このプロトコルにより、研究者は液滴界面二重層(DIB)モデル膜を正確に加熱することができ、細胞環境で起こる様々な温度関連の効果を研究することができます。コアの利点は、DIBの電気的または光学的特性評価へのアクセスを妨げることなく、低体積貯留層の浴温を局所的に測定し、制御する能力に由来する。流体浴を正確に加熱する能力は、天然細胞抽出物を含む膜構成物のはるかに広い種類から形成されたDIBの輸送およびシグナル伝達特性を研究する可能性を解き放ちます。
これは、十分な実験精度を達成するために密接に従わなければならない複数の機器を活用したマルチステッププロトコルであり、したがって、視覚的なデモンストレーションを通じて、書かれたプロセスのあいまいさを明らかにすることができます。長さ25×40ミリメートルにトリミングされた厚さ1ミリメートルの絶縁ゴムの2枚、25×40ミリメートルの6ミリメートルの厚さのゴムの2枚、準備されたアルミニウムベースの固定アセンブリ、およびアルミニウムベースの据え付け具の表示窓に収まるアクリルオイルリザーバーを集め始めます。細いゴム片を顕微鏡のステージに置き、各部分の長いエッジがステージ開口部に接するようにします。
アルミベースの固定具を、対物レンズの上に中央に据えた器具の表示窓を持つ絶縁パッドの上に置きます。各抵抗発熱体の上に厚いゴム片を置き、顕微鏡ステージクリップを使用して、ステージクリップによる損傷から発熱体を保護し、偶発的な電気ショートから絶縁します。熱電対の測定端を慎重に曲げて、端から約4ミリメートルで90度の角度を達成します。
熱電対の曲がった先端をアルミニウム製の器具の左下隅に挿入し、ロックねじで静かに固定します。アクリル貯留器のウェルにアクリル貯留槽を入れて、アルミニウム製の器具のウェルに六方体油を加えて、アクリルの窓と下の部分の間に気泡をトラップするリスクを最小限に抑えます。約1,000マイクロリットルの六方体油をアルミニウム器具の井戸に分配し、熱伝達のための最大表面積を提供し、油が器具の端を顕微鏡ステージまたは対物レンズにこぼれないようにします。
約1,000マイクロリットルのヘキサデカンオイルをアクリル貯蔵所に過剰充填せずに分配します。二層形成が可能な設定点から油浴の温度を下げながら、膜内の脂質の熱的な相転移を識別しながら、膜の公称静電容量を測定します。GUI の温度グラフを右クリックし、表示データをクリアして、バッファ内の十分な領域が後続の記録に使用できることを確認します。
パッチクランプアンプに接続された波形発生器を使用して、液滴界面二重層(DIB)を横切って三角電圧波形を適用し、二重層を介して誘導電流応答を記録します。設定点温度を5度刻みで下げることで二重層を冷却し、望ましい温度が達成されるまで温度変化の間に新しい定常温度で最低5分待ちます。オイルバスを使用して二重層を希望の最低温度まで冷却した後、GUI の温度グラフをもう一度右クリックし、温度データ対時間をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。
現在の記録を停止します。測定電流から、冷却期間中の時間に対する方形波電流応答の公称静電容量を計算します。公称キャパシタンス対温度をプロットして膜容量がどのように変化したかを観察し、静電容量と温度の非単調な変化を見つけて溶融温度を特定します。
同様に、オイルバスと二重層領域の温度を連続的に増分することによって、固定温度での二重層の準静的特異性容量を評価する。GUI を使用して設定点温度を摂氏 10 度単位で変更し、システムが新しい温度に平衡化できるようにします。前述の手順に従って、容量電流と記録の測定を開始します。
マイクロマニピュレータを使用して電極の位置を慎重に調整して、二重層領域を変更します。正波電流が定常状態に達し、DIBの画像を収集して膜面積対時間の計算を可能にします。顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して、絞りから見た二重層を画像化します。
現在の記録ソフトウェアにデジタルタグを追加して、画像コレクションの対応するタイムポイントをマークします。合計5枚のDIB画像と二層電流の定常領域を得て、温度をリセットして撮像を繰り返す。定常二重層領域に対応するタグ付きタイムポイントでの現在の記録とDIB画像を解析し、各温度の二重層容量と面積を抽出します。
各温度の容量対面積をプロットし、各温度における二重層の特定のキャパシタンスを表す第1次回帰の傾きを計算します。次に、特定の静電容量の値とそれぞれの温度をプロットします。非単調な変動の特定の静電容量と温度データを調べて、融解温度を特定します。
二重層全体でDC電圧ステップ入力を生成することにより、電圧依存性イオンチャネル形成のダイナミクスを評価します。初期電圧をミリボルト単位で希望ステップ値に設定し、最終電圧とステップサイズを希望ステップより高い値に設定します。ステップ入力の希望の持続時間を秒単位で設定し、ステップ入力に必要な極性を選択します。
パッチクランプアンプを切り替えて、ラボビューまたは電圧出力モジュールからヘッドステージに発送するコマンド電圧をヘッドステージに送り、電圧をオンにして誘導電流応答を記録します。別に、必要な温度で膜の動的電流電圧関係を取得し、イオンチャネルの挙動などの電圧依存関係を明らかにします。パッチクランプアンプを切り替えて、波形発生器からヘッドステージに発送するコマンド電圧を送信し、電流記録を開始します。
波形発生器で、希望の振幅、オフセット、周波数を持つ連続正弦波波形を出力します。1つまたは複数のサイクルにわたって誘導電流応答を記録し、異なる正波振幅、周波数、温度に応じて繰り返します。温度制御システムは、脳総脂質抽出物、またはBTLE、脂質から形成されたDIBの温度依存性を示すために使用された。
静電容量電流と温度対時間の測定値は、室温から摂氏約60度までの加熱サイクル中に示されています。60°Cでの初期二重層形成後、1つの完全な冷却/加熱サイクルにわたる公称静電容量対温度の変化が文書化された。異なる温度での特定の静電容量の準静的測定は、脂質溶融温度を同定するために使用することができる。
二重層面積と二重層領域のキャパシタンスをプロットすると、線形回帰が可能になり、この傾きは特定のキャパシタンスの値を表します。DIB画像は、温度が融解温度を下回ると、膜が、よく分離された電極によって引き起こされる伸張液滴からの張力下でも、接着性の高い状態を採用することを示している。示された電流対電圧トレースは、二つの異なる温度で誘導電流を測定する、内膜電圧を印加することによって得られた。
矢印とその後の数字は、時間に対して、中弦波電圧の連続する四分の一を視覚化するのに役立ちます。同じ電圧レベルと2つの異なる温度でのモナゾマイシンドープBTLE膜の測定された電流密度をここに示します。六方体油をアルミニウムフィクスチャのウェルに正しく分配することが重要です。
これが順序外に行われるか、慎重に行われていない場合は、アクリルウェルの下に気泡が形成され、DIBのボトムアップビューが妨げられます。また、ユーザーは、完全な記録を確実にするために、各測定の前に温度制御ソフトウェアのデータバッファをクリアすることを忘れないでください。この手順は、膜構造および輸送の温度依存性を研究するために必要な温度の範囲にわたってバイオミメティック膜を特徴付けることを可能にする。
さらに、この機能は、生物学的イオンチャネルおよび工学的ナノ材料のような他の膜活性種のナノスケール効果を明らかにするために使用することができる。
