タンパク質結晶の成長を最適化すると同時に、X線結晶学によってタンパク質の構造を決定するフェージング分子でタンパク質を誘導するように設計された結晶化プロトコルです。完全に新しいタンパク質のX線結晶構造を決定するために、結晶化条件が最適化され、高品質の結晶を生成します。完全に新しいタンパク質の場合、重原子を結晶に導入して誘導体化結晶を生成する必要があります。
X線回折データは、導出結晶から収集され、X線結晶構造を作り出すために計算的に解決されなければならない。結晶化と誘導化は、どちらも面倒なプロセスです。これらのボトルネックに対処するために、我々は同時にこれらの目標の両方を達成する最適化されたスクリーニング手順を考案しました。
このプロトコルは、ランダムマイクロシードマトリックススクリーニングとして知られている以前に開発された技術を使用しています。結晶または結晶性沈殿物は、完全に独立した条件で結晶成長を開始するために使用することができるマイクロシードに粉砕されます。同時に、結晶化条件にI3Cというフェスニング分子を導入します。
この分子は、単一の波長の異常な議論のフェージングによって構造を解決することを可能にする大きな異常な信号を提供する。結晶構造の実験的なサイジングに慣れていないユーザーのために、私たちは部分的にI3Cからの異常な信号を使用するようにそれを調整する構造ソリューションを自動化するためにユーザーフレンドリーなソフトウェアパイプラインを提示します。最初のステップは、I3C在庫を作成することです。
マイクロ遠心分離管にI3Cの120ミリグラムを測定します。2つの水酸化リチウムリチウム200マイクロセントリフュージチューブに200マイクロリットルを加えます。40〜60度でチューブを加熱し、渦液は、溶解を促進するために使用することができます。
リチウムI3C溶液の1モルストックは茶色でなければなりません。2つの方法を用い、I3Cをタンパク質ストックに導入することができる。リチウムI3Cは、タンパク質ストックに直接添加することができます。
3.75マイクロリットルから30マイクロリットルのI3Cを150マイクロリットルのタンパク質に加え、5~14ミリモルの濃度を与えることができる。一部のタンパク質は、高濃度のI3Cと接触すると沈殿する可能性があります。これらの場合、リチウムI3Cは、10〜80ミリモルの間の最終濃度にサンプルタンパク質を一致するバッファーであるタンパク質希釈バッファーに添加することができます。
150マイクロリットルのタンパク質サンプルに150マイクロリットルのタンパク質希釈バッファーを加えます。結晶を粉砕するガラスプローブは、ガラスパスツールピペットから作られています。青い炎の上にブンゼンバーナーで、パスツールピペットを真ん中に向かって加熱します。
ピンセットを使用して、パスツールピペットの端部を0.3ミリメートル未満の細い直径に引き出します。この時点でピペットを分離し、ピペットの端を丸める炎の中にそのセグメントを保持し、ガラスプローブを終了します。これはガラスピペットがどのように見えるかの例です。
クリスタルクラッシュは、タンパク質結晶または結晶性沈殿物を粉砕することによって生成されるマイクロシードストックを独自に作る代わりに、サードパーティベンダーから注文されるかもしれません。氷の上に5つの1.5 mLマイクロ遠心分離管を置きます。軽顕微鏡の下で、犠牲にできる最良の形態結晶または結晶性沈殿物を選択してください。
96井戸結晶化トレイの場合は、プラスチック製のシーリングテープを切断して井戸を開きます。吊り下げの下の皿のために、カバースリップはピンセットを使用して取除き、平らな表面に逆張ることができる。70マイクロリザーバー溶液をマイクロ遠心チューブの1つに移し、氷の上で冷やします。
残りのチューブに、リザーバー溶液の90マイクロリットルをそれに移し、氷に戻して冷やします。貯蔵量が不足している場合は結晶化貯留槽を適宜試薬を混合して作製でき、代わりに使用することができる。ガラスプローブを使用して結晶液中の結晶を十分に粉砕します。
結晶や結晶材料が見えなくなるまで、顕微鏡下で進行を監視することができます。滴から70マイクロリットルのリザーバ溶液を含むマイクロ遠心管に液体のすべてを移す。上下にピペットを入れ、混ぜます。
2~3マイクロリットルの混合物を井戸に戻し、上下にピペットを入れ、井戸をすすきます。混合物をマイクロ遠心分離チューブに戻します。このすすいステップをもう一度繰り返す必要があります。
マイクロ遠心チューブは、マイクロシードを溶かさないように、この時点から前方に冷たく保つ必要があります。過熱を防ぐために、氷の上でチューブを定期的に冷やして約3分間、最高速度でチューブを4度で渦を出します。冷却貯留液の間で10マイクロリットルを順次移すことによって、種子ストックの10の連続希釈物の1つを作る。
種子ストック希釈の間に、チューブは渦を起たるべきです。すぐに使用されない種子株は、マイナス80度の超低温冷凍庫に保管する必要があります。96ウェルランダムマイクロシードマトリックススクリーンは液体分配ロボットを使用して設定することができる。
ロボットにシードストック、I3Cを補ったタンパク質ストック溶液、結晶化スクリーンを配置します。ロボットを使用して、結晶化スクリーンから96ウェルトレイに75マイクロリットルを転送します。結晶化液に1マイクロリットル、リザーバーに74マイクロリットルを加えます。
I3Cを補った1マイクロリットルのタンパク質を結晶化低下に移す。0.1マイクロリットルの種子ストックを結晶化ドロップに移します。シールテープを使用してプレートを密封します。
吊り下げドロップスクリーンは、24ウェル吊り下げドロップ結晶化トレイに設定することができます。吊り下げドロップウェルの端をグリースします。500マイクロリットルの結晶化液をリザーバーに移します。
ガラスカバースライドの中央付近には、結晶化液の1マイクロリットルの滴を置きます。このドロップには、リチウムI3Cを添加したタンパク質1マイクロリットルと種子ストック0.1マイクロリットルを加えます。カバースライドを反転し、カバースライドをグリースに押し込んで結晶をよく密封します。
吊り下げドロップとシーリングドロップトレイは、結晶を形成できるように一定の温度でインキュベートされます。それらは定期的に結晶成長のための顕微鏡の下で検査されるべきである。回折データが取得され、統合され、また、付随する書面によるプロトコルで説明されているようにスケーリングされた後、自動人力車の自動結晶構造決定パイプラインを使用して、位相問題を解決し、タンパク質をモデル化することができます。
自動人力車のランディング ページで、進むボタンをクリックします。自動人力車ウェブフォームに機関の電子メールを入力し、自動人力車の実行を続行をクリックします。ホモロジーモトテンプレートのないタンパク質の場合は、高度なモードで自動人力車のSADプロトコルを実行します。
必要なパラメータを入力します。分子タイプとしてタンパク質を選択します。オングストロームのデータ収集波長を入力します。
ヨウ素原子を示す部分構造要素として私のように使用された。I3Cがフェス構造分子であることを示すI3Cサブ構造タイプを選択します。sub_directをサブ構造決定方法として選択します。
モノマー当たりの予想される下位構造の数として 3 つを選択します。部分構造検索の引当カットオフとして 1 を入力します。これにより、自動人力車は適切な解像度カットオフを自動的に決定できます。
マシューズ係数に基づいて、単一のモノマー、データセットの空間グループ、および非対称単位の分子数の残基数を入力します。必要に応じて、適切な X 線データの普及レベルを選択します。異常なデータを空のセット ファイルとして入力します。
タンパク質配列を、SEQ、PIR、または TXT ファイルとして入力します。教育機関の電子メール アドレスを入力します。結果は、提供された電子メールアドレスに送信されたWebリンクを介してあなたに配信されます。
Auto-人力車が決定された部分構造を使用して構造を解決できなかった場合、構造の解決のトラブルシューティングに役立ちます。自動人力車の結果ページから重い原子サイトのリストをダウンロードします。これは、重原子サイトと呼ばれるハイパーリンクです。
これは、重い原子サイトとのテキストファイルをダウンロードします。ファイルの拡張子を txt から pdb に変更します。Pdb ファイルをクートで開きます。
対称をオンにして、隣接する非対称単位からすべての重原子を表示します。非対称単位を含む重い原子間の距離を測定します。I3Cは、6つのオングストロームの側面長を持つ正三角形として表示されます。
これらの寸法を持つ三角形の存在は、それらの重い原子の配置が正しいことを示しています。自動人力車の実行部分構造が正しくない場合、他の自動人力車の設定は、書かれたプロトコルで説明したようにテストすることができます。I3C RMMS法は、ハンプトンリサーチのHTスクリーンとバクテリオファージP68由来のOrf11リジンタンパク質のドメインを使用して、2つのタンパク質、鶏卵白リソザイムで試験した。
I3Cまたはマイクロシードなしでコントロールスクリーンに対応する各タンパク質ごとに全画面を設置し、マイクロシードを加えたスクリーン、I3Cによるスクリーン、そして最後にI3Cとマイクロシードでスクリーンを設置した。I3Cを結晶スクリーンに追加しても、結晶化ヒット数が増加するようには見えません。鶏卵白リソザイムでは、条件の数は31から26に減少しました。
Orf11 ドメインでは、コントロール画面に 1 回のヒット条件が見つかりました。I3Cを画面に追加すると、同じ条件で単一のヒットを与えました。マイクロシードを井戸に加えると、ヒット条件の数が大幅に増加し、鶏卵白リソザイムとOrf11ドメインがそれぞれ2.1倍と6倍増加しました。
この結果は、RMMSをテストする他の研究と一致しています。最も重要なことは、I3Cとマイクロシードをスクリーンに加えることは、それぞれ鶏卵白リソザイムとOrf11ドメインに対して2.3倍と7倍の増加を示す制御画面に対するヒット条件の数を増加させることである。これは、I3C RMMS法が効率的に誘導体化結晶の新しい条件を生成できることを示しています。
これらの条件からの結晶を収穫し、結晶構造を解決するために使用することができます。鶏卵白リソザイムOrf11ドメインの両方の構造は、I3C RMMSスクリーンによる誘導化に成功したことを示すI3Cからの異常信号を使用して、自動人力車パイプライン上のSADフェージングで解決することができました。私たちは、フェス化分子I3Cで導出された高品質の結晶を生成するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示しました。
スクリーンの数と結晶処理のステップを最小限に抑え、新しいタンパク質を研究する構造生物学者に特に関心があります。我々は強く種子ストックの準備中に行われた異なる種子ストック希釈をテストすることにより、結晶サイズを最適化することをお勧めします。そして、このステップは、最初の画面が完了した後に完了します。
I3Cは広く利用可能であり、購入するには安価であり、したがって、我々はこの方法は、ほとんどの構造生物学研究所の手の届くところにあると考えています。
