この技術は、生体組織における単一細胞を詳しく見ることを可能にする。単一細胞を追跡して操作することで、開発中の組織形成をよりよく理解することができます。この方法を視覚的にデモンストレーションすると、この手法が自分の作業に役立つかどうかをユーザーが判断できます。
さらに、ユーザーは、アプリケーションの実行方法を確認することが可能になり、テキストだけでは把握するのが難しくなります。このプロトコルは査定可能な表面とすべてのティッシュに適用することができる。私たちは、同じ組織、同じ種の異なる組織、および異なる種の異なる細胞を標的にしてきました。
このプロトコルを試みるときは、集中して迅速に作業することが重要です。解剖を開始する前にすべての機器を準備する必要があります。まず、自動注入器ソフトウェアをインストールし、マイクロピペットプーラーでホウケイ酸ガラス毛細血管からマイクロインジェクションピペットを引っ張ります。
ピペットは、ほこりから保護された最大3日間保管してください。電子レンジを使用して3%広い範囲のアガロースを溶かします。アガロースは摂氏37度の水浴に入れて固まらないでください。
SCMを解凍し、水浴を使用して10〜12ミリリットルのSIMとタイロードの溶液の20ミリリットルを摂氏37度に解凍します。蛍光トレーサーを注入する他の化学物質と混合し、その後、マイクロインジェクション溶液を16,000倍のGで摂氏4度で30分間遠心分離します。上清を収集し、新しいチューブに転送します。
マイクロインジェクション溶液を使用するまで氷の上に保管してください。E13.5からE16.5マウス胚までの頭部を使用して、テレンセファロンの組織組織スライスを準備します。皮膚を取り除き、中線に沿って動く鉗子で頭蓋骨を開きます。
開いた頭蓋骨から胚性脳を解剖し、脳の腹側から始まる脳組織を覆う髄液を取り除く。37°Cの加熱ブロックにタイロードの溶液に解剖された全脳を残します。広い範囲の溶融アガロースを使い捨て埋め込み型に注ぎます。
38~39度まで冷却すると、パスツールピペットを使用して最大4つの脳をアガロースに慎重に移します。組織に触れることなく、ヘラまたはデュモンナンバーワン鉗子のペアで組織の周りのアガロースをかき混ぜます。アガロースを室温で固めます。
アガロースが固まったら、組織を取り巻く過剰をトリミングする。バッファトレイにPBSを入れます。トレイに垂直な組織の耳泡状の軸で脳を向き、ビブラートームを使用して250マイクロメートルのスライスをカットします。
3.5センチメートルのペトリ皿に2ミリリットルの事前温めた媒体を充填し、プラスチック製のパスツールピペットを使用して10〜15スライスをこの皿に移します。完成したら、スライスと一緒にペトリ皿をスライス培養器に移します。加湿した雰囲気の中で37°Cでスライスを維持します。
コンピュータ、顕微鏡、顕微鏡カメラ、マニピュレータ、圧力リグ、圧力センサーの電源を入れます。GitHub からダウンロードしたメインフォルダーで、ファイルをクリックしてアプリケーションをロードし.pyアプリを起動し、ポップアップ画面でデバイス設定を指定します。
不要な詰まりを防ぐには、ピペットを溶液に浸す前に外向きの圧力を作ります。補正圧力バーを 24 ~ 45% にスライドさせて、[値を設定] をクリックします。次に、圧力センサで示されるように、機械的圧力バルブノブを1~2 PSIに変えて圧力を調整します。
2ミリリットルの事前温めたSIMを含む3.5センチメートルのペトリ皿の中央にスライスを移し、37°Cに予熱されたマイクロインジェクションステージにペトリ皿を置きます。長い先端のプラスチックピペットを使用してマイクロインジェクション溶液の1.4〜1.6マイクロインジェクション溶液でマイクロインジェクションピペットをロードし、ピペットホルダーにマイクロインジェクションピペットを挿入します。顕微鏡の最も低い倍率を使用して、スライスを焦点に持ち込み、マイクロピペットをこの視野に導き、スライスターゲットと同じ平面に焦点を合わせます。
カメラに顕微鏡の出力を切り替えて、FOVとアプリケーションを確認します。インターフェイスの左上にある拡大ボタンをクリックして、デバイスのキャリブレーションを開始します。ウィンドウで倍率を選択するよう求められたら、10X を選択して[OK]を押します。ソフトウェアは、内部対物レンズが10倍であることを前提としています。
顕微鏡のマイクロメトリックホイールを使用してピペットチップを再び焦点を合わせ、カーソルでピペットチップをクリックします。次に、ステップ1.1ボタンを押し、ポップアップウィンドウでOKを押します。ピペットはy方向に移動します。
ピペットの先端をクリックし、ステップ1.2ボタンを押します。最後に、ピペット角度ボックスに45と入力し、設定された角度を押します。自動マイクロインジェクションコントロールパネルに必要なパラメータを入力し、速度を 100%に設定して終了したら、[値を設定]をクリックします。
[描画エッジ]ボタンをクリックし、ポップアップウィンドウで目的の軌道に沿ってカーソルをドラッグして、射出の軌道を定義します。ニューロンをマイクロインジェクトする場合は、テレンセバロンの基底側を標的とする。ピペットをラインの先頭に持ってきて、その先端をクリックしてから、マイクロインジェクトを開始するために軌道を実行をクリックします。
この手順を、対象となる射出の各面に対して繰り返します。スライスをコラーゲン混合物に浸し、200〜300マイクロリットルのコラーゲンと一緒に35ミリメートルガラス底皿の14ミリメートルウェルにスライスを移します。スライスが可能な限り少ない量のコラーゲンで覆われていることを確認してください。
2組の鉗子を使用してスライスを向け、加熱ブロックで摂氏37度で5分間ペトリ皿をインキュベートし、コラーゲンを固めます。ペトリ皿をスライス培養器にさらに40分間移動し、2ミリリットルの事前温めたSCMを加えます。培養の最後に、スライス培養インキュベーターからスライスを取り出し、SCMを吸引する。
コラーゲン埋め込みスライスをPBSで洗い、4%パラホルムアルデヒドを加え、組織を室温で30分間放置します。一晩固定するために摂氏4度に移動します。翌日、パラホルムアルデヒド溶液を吸引し、PBSでスライスを洗浄します。
ステレオ顕微鏡下で2組の鉗子を使用して、コラーゲンからスライスを取り除きます。マイクロ波を使用して3%低融点アガロースを溶かし、使い捨ての埋め込み型に注ぎ、約38°Cまたは39°Cに冷却します。このモールドに組織スライスを移し、スライスの皮の側面が上向きであることを確認し、アガロースを室温まで冷却して固めます。
スライスを囲む余分なアガローズをトリミングします。アガロースブロックの向きを変えて、カット面がビブラートメの切断ブレードと平行であることを確認し、厚さ50マイクロメートルの断面を切断します。PBSで24ウェル皿を充填し、細かい先端のペイントブラシを使用してこの皿にセクションを転送し、標準的なプロトコルに従って免疫蛍光を行います。
前駆細胞および新生児ニューロンの注入に成功した代表的な画像をここに示す。デキストランアレクサ488を注入すると、細胞は完全に染料で満たされて表示されます。自動マイクロインジェクションは、手動マイクロインジェクションに比べて大幅に高いスループットを提供できます。
さらに、EDU標識は、細胞の生存率が自動化の影響を受けないことを確認します。培養中のオルガノミピックスライスを保持することは、マイクロ注入された細胞の系統進行に従うことを可能にする。単一神経幹細胞へのマイクロインジェクションは、優れた単一細胞分解能を提供します。
そこで、神経幹細胞の進行や運命遷移の細胞生物学を解剖するために用いられている。このプロトコルは、Dextran A555と共にルシファーイエローを注入することによって新生児ニューロンの接合結合を研究するために使用された。新生児の錐体ニューロンの割合は、隣接するニューロンへのギャップジャンクションを介して結合され、未熟なニューロンがギャップジャンクションを介して通信するという考えと一致する。
この技術を用いて、脳の発達と脳進化の細胞生物学を調べてきた。神経幹細胞の挙動に影響を与えるいくつかの候補遺伝子を研究し、その働き方、神経幹細胞系統の進行にどのような影響を与えるか、脳発達中のニューロン産生を発見し、理解することができました。
