細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

テキスタイルにおける現在のプロトコル評価者は、細胞内コンパートメント特異的な方法で酸化還元状態が変化する。我々のプロトコルは、より良い理解を可能にし、酸化ストレスのすべての生理学的または病的生理学的メカニズムを監視する。この技術により、シグナル発現レベル、写真漂白、検出感度の差を相殺するために、比率メトリック出力を使用して、無傷細胞のタイル眼硫化物比を無停止で定量できます。

このプロトコルは、植物中の細菌を含む様々な生物に適用することができる。実験の1日目に、コンフルエント乳癌細胞株の細胞を2分間治療し、EDTAでは0.2、5%のトリップの2ミリリットルで治療する。細胞が剥離し始めると、完全な培地の6ミリリットルで反応を逮捕し、遠心分離によって細胞を沈下する。

ペレットを5ミリリットルの新鮮な完全な培地に再び懸濁し、細胞を数え、完全な培地の1ミリリットル当たり1.5倍から5番目の細胞に希釈します。次に、6ウェルプレートで1ミリリットル当たりの5番目の細胞に1.5倍の10回を播種し、細胞培養インキュベーター内の細胞を一晩インキュベートする。または、ウイルス行GFPの導入を追加しません。

翌朝、1~100マイクロリットルの12.5、25、および50マイクロリットルを10倍希釈して、1ミリリットル当たり10番目のプラーク形成単位に加え、ウイルス浸食GFP溶液を加えず、完全培地に添加する。適切なウェルまたは6ウェルプレートに加えて、それぞれ50、100、および200の感染多重度を有する細胞をトランスデュースする。すべてのサンプルのウェルズがウイルスで導入されたら、細胞を16〜24時間細胞培養インキュベーターに戻します。

翌日、蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、上清を培地に置き換え、ウイルスを使用せずに細胞をさらに24時間回復させる。最適な伝達効率を決定するには、フローサイトメトリーにより細胞の蛍光強度と形態を評価します。バイオセーフティレベル2認定生物学的安全キャビネット内で、エアロゾルや飛沫からの感染を引き起こす可能性のあるすべての手順を必ず実施してください。

細胞の酸化還元状態を評価するために、翌朝、細胞および6ウェルプレートの適切なウェルを1時間10マイクロモルモル過酸化水素でインキュベートし、EDTA当たり0.2 5%点滴の750マイクロリットルで細胞を剥離する前に、実証された。ウェルあたり完全な媒体の2ミリリットルで反応を停止し、個々の15ミリリットルの円錐管の各条件の上清を引っ張ります。遠心分離によって細胞を沈め、遠心分離によってPBSの500マイクロリットルでペレットを2回洗浄する。

2回目の洗浄後、細胞懸濁液を40マイクロメートルメッシュでろ過し、氷上のフローサイトメトリー適合チューブにフィルターをかけます。フローサイトメーターソフトウェアで、感染制御サンプルのゼロ多重度を実行します。次に過酸化水素と未処理の細胞を分析します。

これは、示された式を使用して、行GFPの酸化と減少形態の間の平均蛍光強度比の計算を可能にする。フローサイトメトリーにより多数の細胞を選択するための格言戦略を以下に示す。フローサイトメトリーは、行GFP分析のための線量応答曲線および感染入力の最も効率的な多重度を決定するためにも使用することができる。

感染の多重度によれば、本代表分析における用量応答曲線は、200の多重度の感染が最も高い道路GFP発現を与えたが、細胞形態は細胞毒性を示唆する作用があった。そこで、最適な伝達効率は、100の感染の多重度であると判断した。このレドックス状態解析では、酸化および減少した行GFP平均蛍光強度は、車両および4つの10マイクロモル陽性対照過酸化水素処理のフローサイトメトリー分析から得られた。

重ね合わせたヒストグラムは、過酸化水素10マイクロモルおよびビークル処理群の細胞数の変化を表すか、または減少して酸化された侵食GFPである。この分析のために酸化された行と減少した行GFPの比率を計算すると、10マイクロモル過酸化水素が車両処理と比較して行GFPの酸化の3倍の増加を引き起こしたことが明らかになった。正確なセル番号を持つことは、MRIの計算と再現性にとって重要です。

再現性のある結果を得るためには、研究者は、均質な懸濁液を得るために徹底的に抗ウイルス溶液を混合する必要があります。このプロトコルは、研究者がリアルタイムで正常な細胞プロセスと疾患の進行の広い範囲の不可欠な部分として急速な酸化還元変化を研究することを可能にします。