癌幹細胞は、薬剤耐性に再発した癌の転移に関与している。このプロトコルは、がん幹細胞の主要遺伝子の機能を調査するための効率的な方法を提供します。条件付きノックダウンシステムと適応球形成アッセイを用いて、この方法は、異なるタイプの癌幹細胞における幹細胞関連遺伝子に対するインビトロおよびインビボ機能の研究に容易に適応される。
手順を実証すると、私の研究室の研究アシスタントであるユーティン・リーとシャンユー・タンです。レンチウイルス粒子を生成するには、400万個の293Tレンチウイルス包装細胞を100ミリのペトリ皿に種を入れ、10%FBSを補ったDMEMを10ミリリットルで洗い出します。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートし、トランスフェクションの日に細胞が50〜80%コンフルエントであることを確認します。
減らされた血清培地を室温に持ち込み、原稿の指示に従ってチューブAとBを準備します。チューブAの内容物をチューブB.Mixウェルに加え、室温で15分間インキュベートして脂質DNA複合体を調製します。培養皿から培地を5ミリリットル除去する。
その後、細胞培養皿に脂質DNA複合体の5ミリリットルを加え、賢明に落とし、皿を穏やかに渦巻きます。37°Cと5%の二酸化炭素で24時間培養します。インキュベーション後、トランスフェクション培地を慎重に取り出し、10%FBSを補った10ミリリットルのあらかじめ温めたDMEMに交換してください。
さらに24時間細胞をインキュベートする。トランスフェクション後約48時間、上清を含むレンチウイルス10ミリリットルを収穫し、0.45マイクロメートルの注ぎフィルターで濾過して細胞の破片を取り除きます。すべての細胞培養容器、先端、フィルターおよび注射器はレンチウイルスを含んでいて、処分の前に10%漂白剤で処理されるべきである。
明確化した上清を滅菌容器に移します。Lenti-Xコンセントレータを追加し、穏やかな反転と混ぜます。一晩摂氏4度で混合物をインキュベートします。
翌日、摂氏4度で45分間Gの1500倍のサンプルを遠心します。上清を慎重に取り除き、底部のペレットを乱さないよう注意してください。ペレットを10%FBSで補ったDMEMの1ミリリットルで静かに再中断し、マイナス80°Cで保存します。
種子 600 万胃癌幹細胞または GCSC 100 ミリペトリ皿に 10 ミリリットル DMEM 10%FBS を補った.24時間摂氏37度、炭酸ガス5%で培養します。細胞が70〜80%の合流度に達したら、皿から培地を吸引し、ポリブレン試薬を含む完全なDMEM培地の4ミリメートルで希釈した濃縮レンチウイルス粒子を加える。
細胞を18時間培養器に戻します。ポリブレンは、有効な濃度を決定するために異なる条件でテストする必要があります, これは通常、ミリリットルあたり2〜10ミリグラムの範囲である.18時間後、培地を10ミリリットルのDMEMを10%FBSに交換し、細胞をインキュベーターに24時間戻します。
その後、上清を細胞の破片で吸引し、10%FBSと2.5マイクログラムのピューロマイシンを1ミリリットルで補充した新鮮なDMEMを加える。さらに24時間細胞をインキュベートする。その後、10%FBSと1ミリリットルピューロマイシン当たり5マイクログラムを補充新鮮なDMEMに再び培地を変更します。
さらに24時間のインキュベーションの後、カルシウムとマグネシウムなしで5ミリリットルのDPBSで接着性のGCSCを2回リンスします。1ミリリットルの温め込まれた細胞解離液で細胞を解離し、摂氏37度で2〜3分間インキュベートする。次いで、新鮮な前温めたGCSC完全な培養培地を細胞懸濁液に5ミリリットル加える。
この懸濁液の3ミリリットルを凍結保存用の15ミリリットル遠心管に分配し、他の3ミリリットルを別のチューブに分配して、ドキシサイクリンを誘導します。遠心分離機は両チューブをGの800倍で5分間用いた。次いで、チューブBから上清を吸引し、新鮮な前温められたGCSC完全な培養培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁した。
新鮮な事前温められたGCSC完全な培養培地と1ミリリットルのドキシサイクリンあたり2.5マイクログラムの新しい100ミリメートルペトリ皿に適切な数の細胞を播種します。その後、48時間、皿をインキュベートします。自動セルカウンターを使用して、細胞の10マイクロリットルサンプルの密度を決定します。
次に、予め温められたGCSC完全な培養培地で体積を調整し、1ミリリットル当たり20,000個の生存細胞の濃度を得る。新しい、超低い取り付け96ウェル培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液の100マイクロリットルを分配する。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。
球体形成は3~10日以内に起こる。2日ごとに腫瘍球形成を画像化する。原発性ヒト胃腺癌由来の胃癌幹細胞を、血清遊離培地で培養した。
6日後、細胞は表現型のような単細胞から大きな球体に拡大した。GCSCにおけるクラスタリングインの機能を評価するために、クラスタリングインに対する短いヘアピンRNA配列をTet-GV307-RFP-Poベクターにクローン化した。発現ベクターをトランスフェクトした細胞を、ドキシサイクリンで48時間処理した。
次に、ウェスタンブロットによりクラスタイン発現を検証し、デンジトメトリーで定量した。GCSCにおけるドキシサイクリンおよびキロンチンのノックダウンの存在は、腫瘍球形成を阻害した。スクランブルされたshRNAコントロールを使用して導入した細胞では腫瘍球形成の阻害は認められなかったが、ドキシサイクリンだけでは腫瘍球形成を阻害しなかったことを示す。
これらの結果は、クラスタリングインサイレンシング後、GCSCがゆっくりと成長し、腫瘍球を形成できないことを示唆している。このデータに基づいて、クロクラスタリングは、GCSCsの自己再生活性を促進する上で重要な役割を果たし、胃癌患者における癌幹細胞を抑制するための有望な薬物標的となり得る可能性を示している。腫瘍球は、個々の細胞または凝集細胞上の固体丸い構造であるべきであり、腫瘍球と考えるべきではない。
しかし、一部の癌幹細胞は、典型的な腫瘍球構造を形成しない場合がある。この手順は、vitroで再生可能な可能性のために癌幹細胞を調べるための他の方法に従うことができる。例えば、ステム関連マーカーの発現を検討することができる。
このプロトコルは、生存上の幹細胞などのがん幹細胞における重要な遺伝子の機能を研究するために拡張することができます。
