ヒトの母乳から細胞を単離し、HIV標的に対する母乳食細胞による抗体依存性細胞食細胞食細胞(ADCP)を研究するための厳格な方法を開発しました。この技術は、ADCPを実行する白血球集団の容量を評価するために、母乳細胞の比較的迅速かつ容易な単離を容易にする。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるアリサ・フォックスです。
関連する標的抗原を選択した後、市販キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って目的のタンパク質をビオチン化します。そして、スピンカラムの上部チャンバーにビオチン化サンプルを堆積させる。PBSを最大400マイクロリットルに加え、遠心分離のためにカラムを回収管に挿入する前にチャンバーにキャップします。
流れを捨て終えた後、PBSを400マイクロリットルに加えて2番目の遠心分離を行います。流れを捨て、400マイクロリットルにPBSを加え、分光光度計でタンパク質濃度を測定し、ビオチン化タンパク質をマイクロメートルのマイクロスフィアに結合させます。コンジュゲートビーズのプレートあたり200マイクロリットルのPBSに12マイクロリットルのストックビーズを20マイクロリットルで20マイクログラムのタンパク質で2時間インキュベートし、20分ごとに穏やかな渦を生かします。
インキュベーションの終わりに、ペレットは、タンパク質をコンジュゲートビーズ遠心分離により、上清を捨てる。穏やかなボルテックスの後、PBSで0.1%BSAの1200マイクロリットルでタンパク質を再懸濁し、ちょうど実証したようにさらに2回遠心分離によってチューブを洗浄する。最後の洗浄後、PBSプラスBSAで1200マイクロリットルのペレットを再懸濁します。
ADCPアッセイプレートをセットアップするには、まず、12マイクロリットルの抗体、または対象の免疫血清を、ラウンドボトム96ウェルプレートでPBS中の2%BSAに調製する。37°Cで2時間のインキュベーションのためにプレートにウェルごとにタンパク質共役ビーズの10マイクロリットルを追加します。インキュベーションの最後に、PBSとBSAの200マイクロリットルを加えます。
ポンプを用いて発現する健康な授乳中の女性からヒト母乳を得た後、4時間以内に、母乳内容物を遠心分離によって分離し、スキムミルクと脂肪を慎重に注ぎ、細胞ペレットを乱さずに残す。糸くずのないワイプでチューブの内側を拭き取り、チューブウォールから脂肪をすべて取り除き、PBSプラスHSAの10ミリリットルを追加します。アポトーシスで細胞の活性化を避けるために穏やかなピペットでペレットを再懸濁し、遠心分離のために細胞懸濁液を15ミリリットルチューブに移します。
ちょうど実証したようにPBSプラスHSAで2回目の洗浄の後、カウントのために新鮮なPBSとHSAの1〜2ミリリットルの細胞を穏やかに再懸濁します。ADCPアッセイの場合、準備されたADCPプレートを素早く反転して、最終的な遠心分離後に上澄み物をデカントし、PBSとBSAの200マイクロリットルで4番目に分離された母乳細胞で5倍の10を加え、摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、細胞を遠心分離し、示したように200マイクロリットルの新鮮なPBSでペレットを2回洗浄する。
最後の洗浄後、室温で30分間PBSの50マイクロリットルで1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの固定可能な生き生き性染色体450を室温で30分間染色し、光から保護する。インキュベーションの終わりに、示されているように、新鮮なPBSで2回の洗剤用細胞をペレット化し、目的の白血球マーカーの細胞を室温で30分間染色し、光から保護する。インキュベーションの終了時に、細胞遠心分離を収集し、1回の洗浄につき1%BSAプラスPBSの200マイクロリットルで細胞を2回洗浄します。
最後の洗浄後、ペレットを1ウェルあたり0.5%ホルムアルデヒドを光から保護して30分間、200マイクロリットルのホルムアルデヒドで固定します。細胞サンプルのフローサイトメトリック解析では、175マイクロリットルのサンプルを回収し、ウェルあたり5000個の細胞を収集するために、ハイスループットプレートリーダーを装備したフローサイトメーターを設定します。最初の格子を実行して、前方散乱と側面の散布図でダブレットとデブリを除去します。
死んだ細胞を排除するために、サイドスキャッタ対生存性染色プロットを使用します。また、主な白血球クラスを区別するために、サイドスキャッタ対CD45プロットを使用します。すべてのCD45陽性細胞、または対象の各白血球サブセットについて、結合ビーズに対する適切なフルオロフォアチャネルのヒストグラム中のビーズ陽性細胞上のマーカーでゲーティングすることによって抗体依存性細胞貪食活性を測定する。
次に、抗体依存性細胞貪食スコアを、全CD45+陽性集団の細胞の割合でビーズ陽性細胞の蛍光強度の中央値として算出する。ここでは、ダブレット、デブリ、死細胞を排除するための格言戦略が示されている。生細胞全体の1〜12%の間には、典型的にはCD45陽性白血球であり、大部分の側散乱は低く、中間CD45は前駆体であるように見える低い単球、または未熟な細胞に対して、側散乱対CD45格子に基づく。
この顆粒球と称される細胞は、高い、CD45中間細胞の側散乱と定義される。産後1ヶ月でHIV特異的ヒトモノクローナル抗体を用いた新たに単離された母乳細胞のADCP活性を測定した結果、抗体結合型ビーズによるインキュベーション前にアクチン阻害剤Cytochalasin DおよびFc受容体遮断抗体による治療が、コントロール抗体の存在下で観察されたADCP活性の結果を生じることが明らかになった。総CD45陽性細胞について決定されたADCPスコアは、一般的にバックグラウンドレベルより25〜35倍の間であり、陰性対照、抗炭疽モノクローナル抗体を使用して定義される。
すべての母乳サンプルはユニークであり、いくつかのペレットは見るのが難しいかもしれません。さらに、白血球集団、したがってADCPスコアは、サンプルごとに大きく異なる可能性があります。
