Name: the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

ヒト末梢血は、インフォームドコンセントの下で健康なドナーから得なければならない、と血液サンプルの使用は、個々の治験審査委員会によって確立され承認されたガイドラインに準拠する必要があります。本研究では、フローサイトメトリーの結果のデモンストレーションでは、ヒトの血液を使用するプロトコル（ 図1）およびELISPOTアッセイ（ 図3）は、国立台湾大学病院（プロトコル番号201307019RINB）の内部審査委員会によって承認されました。 ヒト末梢血B細胞の1単離および精製<ol><li> K 2 EDTA（1.5〜2.0ミリグラム/ mLの血液）を含む15-mLのチューブに（肘に肘窩の前方で）肘正中皮静脈から血液の〜10mLのを描画し、すぐに凝血塊を防止するために、チューブを数回転倒形成。 </li><li> P;（121℃、15分）、オートクレーブ処理の35 mLを加え、赤血球（RBC）溶解バッファー（150mMのNH 4 Cl を 、10mMのKHCO 3、および1mM EDTA新鮮な血液サンプル（≥3を含有するチューブにH 7.4）：1体積/体積）をし、もはやより5分間室温（RT）でインキュベート。 注：管を通る光の透過の外観は、RBC溶解が完了したことを示しています。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。ペレットの色が白であることを確認してください。 </li><li>ステップ1.3のように遠心分離器;オートクレーブしたリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4のPBS、137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、4.3 mMののNa 2 HPO 4、および1.47 mMのKH 2 PO 4）10mLでペレットを再懸濁。 </li><li> 、その後プレート：上清を捨てRPMI 1640培地（10％ウシ胎児血清、100 U / mLのペニシリン/ストレプトマイシン、0.25 / mlのアンホテリシンB、および2mM L-グルタミンサプリメント）10mLでペレットを再懸濁10 cmの培養皿（皿当たり10mlの血液）への細胞。 30分間、5％CO 2で37℃のインキュベーターに皿を置きます。 </li><li>静かに培養皿を数回旋回し、配置15-mLのプラスチック製コニカルチューブに培地（浮遊細胞）。培養皿に接着細胞（主にマクロファージ）を捨てます。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。上清を捨てます。 </li><li> RPMI 1640培地1mLでペレットを再懸濁します。血球計数器または自動細胞カウンターで細胞数をカウントします。 注：分離された白血球の生存率は、通常、トリパンブルー排除によって90％以上です。 </li><li> 10×10 6細胞/ mL - 5の濃度で工程1.7と同様に遠心分離し、冷PBS緩衝液〜200μL（0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA）中で細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞あたり（B細胞の負の選択のための）血液細胞に特異的なビオチン化抗ヒト抗体カクテルの5μLを加え、30分間21氷上でインキュベートします。 注：抗ヒト抗体カクテルは、少なくともCD2（またはCD3）、CD14、およびCD16に特異的な腹筋を含める必要があります。 </li><li> 10倍過剰量を追加滅菌PBSの細胞、5分間600×gで遠心分離し、上清を廃棄します。 </li><li>ペレットにストレプトアビジン結合マイクロビーズ（10 6細胞あたり5μL）の等量を加え、よく混ぜます。 </li><li> 15-mLのプラスチック円錐管中で30分間氷上でインキュベートします。 </li><li>チューブにPBS緩衝液2mLのを追加します。 </li><li>磁気スタンドにチューブを置き、8分間RTでインキュベートします。茶色のマイクロビーズは徐々に次の磁石22に管壁に付着します。 </li><li>チューブを磁気スタンドに残っていると、慎重に新しい滅菌15 mLチューブ22に上清を移します。 </li><li>繰り返しは、1.16から1.14までを段階的に説明し、手つかずのB細胞を含む2つの上清を兼ね備えています。マイクロビーズを捨てます。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。上清を捨てます。 </li><li>下流の実験のためにRPMI 1640培地中でペレットを再懸濁。 注：一般的に、1から5×10 5 B細胞のウィットHA末梢血10mLの95％を超える純度が23を単離することができます。 </li></ol> 2.精製および単離されたB細胞からのメモリとナイーブB細胞の分離<ol><li>ステップ1から精製された細胞を使用し、血球計または自動セルカウンターを用いて細胞数を決定します。 </li><li> 5分間600×gで遠心分離し、RT後の冷PBS緩衝液100μLで細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞あたりビオチン化CD27 mAbを2μgの氷上で30分間インキュベート- 1を追加します。 </li><li> 5分間、600×gでチューブと遠心分離機にPBS緩衝液の10 mLを加え。 </li><li>上清を捨て、PBS緩衝液の50μLで細胞を懸濁します。 </li><li> 15 mLのプラスチックコニカルチューブ中の細胞に- （2μgの/ 10 6細胞1）ストレプトアビジン磁性マイクロビーズの等量を追加します。 </li><li>穏やかによく混合し、氷上で30分間インキュベートします。 </li><li>チューブにPBS緩衝液3mLの - 2を追加します。 </li><li>置き磁気スタンドにチューブとは、茶色のマイクロビーズが磁石に近い側に取り付けることができるように、8分間RTでインキュベートします。 </li><li>磁気スタンドでの管で、慎重に新しい滅菌チューブに上清画分を転送します。ナイーブB細胞-この画分は、濃縮されたCD27が含まれています。 </li><li>マイクロビーズを含むチューブに5 mLを加え、穏やかにマイクロビーズを再懸濁（ すなわち、CD27 +メモリーB細胞の濃縮分画）24-25。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。下流の実験のためのRPMI 1640培地でペレットを再懸濁します。 注：典型的には、約30 - B細胞の60％が健康なドナー7、25-26のPBMCからCD27 +記憶細胞として精製することができます。 </li></ol>ナイーブB細胞、メモリーB細胞、およびPBS /パソコンのコレクションのソート3.セル<ol><li>ステップ1から精製された細胞を用いて、hemocytomeを用いて細胞数を決定しますターまたは自動セルカウンター。 </li><li> 5-mLのポリスチレンチューブ中で、mL当たり10 7の濃度で冷PBS緩衝液中で細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞当たりのヒトIgGを2μgおよびFcブロックのために10分間氷上でインキュベート- 1を追加します。 </li><li> 1μgの抗CD19-APC（クローン：HIB19）のそれぞれを追加し、抗CD27-eFluor450（クローン：O323）、および抗CD38-PE（クローン：HIT2）10 6細胞あたり。よく混ぜ、30分4、27氷上でインキュベートします。 </li><li>ステップ3.4の最後の5分で、商業7-アミノD（7-AAD）の5μLを追加します。 </li><li> 5分間、600×gでチューブ、ボルテックスし、遠心分離機にPBSの2ミリリットルを追加します。 </li><li> 15 mLチューブに、mL当たり5×10 7細胞- 1の濃度で（2％BSAおよび2mMのEDTAを含む滅菌PBS）バッファーを並べ替え中に細胞を再懸濁します。 </li><li>細胞塊を除去するためにナイロンメッシュセルストレーナー（40μmの孔サイズ）を介して細胞をフィルタリングします。 </li><li>フローサイトメトリーソートして細胞を分離紫色（405 nm）と、青（488 nm）で、赤色（640nmの）：えー3つのレーザを搭載しました。 注：単独の青色レーザーは、27-28サイトメトリー3色のフローのために十分です。 </li><li>ナイーブB細胞（CD19 + CD27 - ）を同時に収集するための3つの15 mLチューブ（RPMI培地5mlを含有する）にソート細胞、記憶B細胞（CD19 + CD27 +）、およびPBS /パソコン（CD19 + CD27 + /ハイ CD38 +）3-4、28。 注：ステップ4で説明したようにソートさナイーブおよびメモリーB細胞を培養することができます。 </li></ol>ナイーブB細胞-単離されたヒトCD19 + B細胞、CD19 + CD27 +メモリーB細胞、およびCD19 + CD27のインビトロ分化4. <ol><li>手順1.19、2.10、2.11および3.10で精製された細胞を用いて、血球計または自動セルカウンターで細胞数を決定します。 </li><li> RPMI 1640培地で細胞を再懸濁1の濃度- 、mL当たり10×10 5、12ウェルプレートのウェルにそれらをアリコート。 </li><li> 5μgの/ 10 6細胞/ mLの18、29でのCpG（ODN 2006）を追加します。 </li><li> 5日間培養し、5％CO 2、37℃インキュベーターで細胞。 </li><li>各ウェルから細胞を採取、15-mLのチューブに別々に配置し、各チューブにPBSの5 mLを加え、5分間600×gで、室温でそれらを遠心分離します。 </li><li>血球計数器または自動細胞カウンターを用いて細胞を数えます。 RPMI 1640培地で、mL当たり10×10 5から1までの濃度で細胞を再懸濁します。 </li></ol> 5.エリスポットアッセイ<ol><li> 30秒間ELISPOTプレートの各ウェルに蒸留水に35％エタノールの30μLを加えます。 注：ピペッティングすると、すべての回でウェル中の膜には触れないでください。 </li><li>エタノールを除去したELISpotプレートを反転。 </li><li>各ウェルにオートクレーブ滅菌のddH 2 Oの150μLを入れ、インキュベート室温で5分間、それらは、残留エタノールをオフにフラッシュします。 3分間室温で滅菌PBSの洗浄に従ってください。 注：5.3から5.1までは、プレートの製造に応じて、任意であるステップ。 </li><li> ELISPOTプレートの各ウェルに（PBS中）抗ヒトIg抗体（IgG + IgM抗体+型IgA）の5μg/ mlのポリクローナルF（ab &#39;）2フラグメントの50μLを入れ、4℃で一晩（好ましい）でそれらをインキュベートまたは2時間11 37℃です。 注：使用するまでパラフィルムでプレートの端をシール。 </li><li>たびに、未結合のAbを除去し、各ウェルに200μlのPBSを追加し、3分間室温で二度、それらをインキュベートし、プレートを反転。 </li><li>遮断するための各ウェルに5％BSA（またはRPMI 1640培地）を含むPBSを200μLを追加し、室温で2時間、それらをインキュベートします。 </li><li>ブロッキングバッファーを除去するためにプレートを反転。ステップ5.5のように、PBS200μlで各ウェルを二回洗浄します。 </li><li>各ウェルにRPMI 1640培地100μLを加え、37℃でそれらをインキュベートします。 </li><li>準備ができた細胞をシードするときは、RPMI 1640培地を除去するためにプレートを反転。 </li><li>シード100μL（5×10 4）、50μL（2.5×10 4）、および（ステップ1.19、2.10、2.11、3.10から、および4.6）細胞の25μL（1.25×10 4）のウェルにELISPOTプレート。 RPMI 1640培地で、/だけでなく150μLにボリュームをもたらします。 注：細胞をプレーティングするための1つまたは2つの2倍連続希釈の最小値が推奨されます。 </li><li> 14時間18から8のために、5％CO 2で37℃インキュベーターで培養します。インキュベーション中にプレートを移動しないでください。 </li><li>細胞およびRPMI 1640培地を除去するためにプレートを反転。 </li><li> 3分間、室温で毎回5回（0.05％のTween 20を含むPBS）を200μL/ウェルのPBS-Tのを追加し、それらをインキュベートします。 5回の洗浄との間に洗浄バッファーを除去するためにプレートを反転。 </li><li> IgGの検出、1のFcγ特異的、ヤギ抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ（AP）のいずれかを追加するABS（：PBS-Tで5,000）またはヤギ抗ヒトIgM-AP、Fcμフラグメント固有のAbs（IgM抗体検出、1：PBS-Tで5,000）指定されたウェルに、暗所で室温で2時間インキュベートします。 </li><li>ステップ5.5のように、PBS200μlで各ウェルを二回洗浄します。 </li><li> 50μL/ウェルのブロモクロロインドリルリン酸ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP / NBT）基質溶液を追加します。 15分 - 紫色の斑点は、通常5に表示されます。 </li><li>スポットの過剰発生を防止するために、100μL/ウェルのddH 2のOを追加します。 </li><li>すべてのスポットの完全な開発後に水道水でプレートを洗浄します。 </li><li>プレートの暗渠を削除し、それらは暗闇の中で空気乾燥することができます。 </li><li>画像取得/解析部（ 例えば、自動スキャナまたは手動で解剖顕微鏡を介して）で自動化プレートリーダーを使用してスポットをカウントします。 注意：プレートを暗所で室温で保存し、後で分析することができます。 </li></ol>

The author declares no competing financial interests.

B細胞は、体液性免疫の発達において中心的な役割を果たしています。彼らは当初、骨髄で開発し、さらなる発展のために、ナイーブ脾臓などのリンパ組織へと移動することができるB細胞、リンパ節、および扁桃として血流を入力してください。銀遭遇すると、いくつかのナイーブB細胞が胚中心B細胞は、記憶B細胞および形質（PBS）/プラズマ細胞（パソコン）に分化することができるリンパ濾胞へ移行します。ほとんどのPB / PCが血流に発信されているが、いくつかは、最終的には長寿命のパソコン1に最終的に分化するために骨髄に存在します。循環中のB細胞は不均一であり、かつ定常状態で、PBS / PCは、末梢血2で稀です。系統特異的表面マーカーの利用可能性の結果として、フローサイトメトリー末梢血中のB細胞サブセットの同定および特徴付けのための一般的な方法となっています。フローcytometrの拡張アプリケーションYは、高純度で分離し、B細胞の個々のサブセットの単離を可能にするセルソーター機能の追加です。異なる発生段階の特定の表面受容体の発現に基づいて、人間の循環B細胞は一般的に3つの主要な亜集団に分類される、記憶B細胞（CD19 + CD27 + CD38 - ）、ナイーブB細胞（ - - CD38 CD19 + CD27）、およびPBS /パソコン（CD19 + CD27 + CD38 +）3-4（ 図1）。本質的にナイーブB細胞はのAgに遭遇していません。しかし、それらはIgM抗体+ CD27 +メモリーB細胞に分化することができます。ナイーブB細胞（BCR）関連分子（ 例えば、CD19、CD20およびCD22）、B細胞抗原受容体を発現に均質であるが、それらは、免疫グロブリンレパートリー5に不均質です。 CD27 +メモリーB細胞の大部分はCD27に分化することができます+ /ハイCD38 + PBS /パソコン6。また、メモリーB細胞およびPBS / PCはポリクローナルであり、発達および機能異質4-7を示します。循環中のPB / PCは、通常短命であり、CD138を発現しないが、骨髄に落ち着くために作られたものは、末端分化し、長寿命となります。最終的に分化したPCは、CD138を発現し、その表面8上にCD27分子をダウンレギュレートします。 PBSおよびPCの両方が腹筋を分泌することができるので、多くの場面では、それらを総称したASCと表記されています。対照的に、ナイーブB細胞や記憶B細胞のいずれもは、ABS 9-10のかなりの量を生成することができます。適切な培養条件6、11-15に置かれたとき、10日-単離された場合、それにもかかわらず、両方のナイーブ及びメモリーB細胞は、3でのASCに分化させることができます。実際には、ASCを、それらの直接分離されたFRとCD27とCD38のインビトロ分化を共有同様の表面式から導出しますオム末梢血6。また、in vitroで分化したASCは、PBS /パソコン6の循環同様の表面CD20の低レベルを発現します。文化由来のASCは、すべての短命ですが、彼らは機能的に有能で、体液性免疫に貢献することが可能であることを示す、ABS樹脂を分泌することができます。 遠くで最も一般的に適用される方法は、体液性免疫応答の機能情報を取得することにより、ELISAおよびエリスポットの両方があります。 ELISAは、96ウェルプレートに基づくアッセイであり、しばしば血清Ag特異ABSおよび他の検体（ 例えば、サイトカイン）の力価を測定するために使用されます。これは、便利かつスケーラブルです。 ELISAは、液体試料16中、ABS又は血清のような他の物質の存在を検出するための固相酵素アッセイを使用するように設計されています。血清のELISAからの読み出しが広く体の免疫応答を表すために使用されてきました。再取得のために必要なツールELISAアッセイからadoutsは、分光光度マイクロプレートリーダーです。リーダは、典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）共役検出ABSおよびその特異的な基質17の反応から得られる最終生成物の光学密度（OD）を決定することができます。体液性免疫応答の報告に関して、ELISAによって決定した血清抗体レベルは、体内でのASCの集団ではなく、個々の性能を示します。また、ELISAは、アカウントに腹筋を分泌しない記憶B細胞による参加を取ることができません。 ELISAのように、エリスポットは、末梢血サンプル17-18で免疫応答を検出し、監視するための広く用いられている方法です。 ELISpotは、サンドイッチELISAに関連する技術です。その中で、細胞をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）短期培養のためのマイクロプレートの96ウェルの膜・バックウェルに配置されています。 ELISpotアッセイは、マイクロプレートとdevelopinにウェスタンブロッティングを行うに類似していますグラム各ウェルのPVDF膜上のスポット。自動ELISPOTリーダーシステムやマニュアルの計数のための実体顕微鏡が必要です。免疫応答を検出するのELISpotの主な利点は、ASCにおよびサイトカイン分泌細胞の定量化におけるその優れた感度です。それは、それぞれ、体液性および細胞性免疫におけるそれらの機能の活動を報告します。体液性免疫機能の測定では、ELISAおよびELISPOTによって列挙されたASCの数によって決定される血清抗体レベルは、しばしば相関しているが、これらの2つのアッセイからのデータ読み出しは、機能的意味19-20でいくつかの違いがあります。エリスポットの主な利点は、この方法の感度です。 Abの適切なアイソタイプの既知量を参考のために含まれている場合に、ELISAによって報告されているように、血清抗体力価のレベルは、濃度の読み出しとして、より定量的に相対的な抗体のレベルを示す、ODの読み出しとして半定量的に提示、またはされています。対照的に、のELISpotの結果はpresenteあります関心対象の細胞プールでのASCの絶対数としてD（ 例えば、未分画の末梢血単核細胞（PBMC）及びPBMCから精製したB細胞）。エリスポットは、単一のASCを検出することができますが、ELISAは、測定前に最適化されたアッセイに依存する濃度に到達するのASCからのAbの量を必要とします。したがって、エリスポットは、定量化の感度のELISAに明らかに優れています。また、エリスポットはまた、活性化された記憶B細胞のインビトロ分化のASCを定量化するのに適しています。記憶B細胞は、ABSを分泌しないが、活性化の際のASCに分化することができます。彼らは、したがって、ELISAによって検出された血清のAbsへの貢献を持っていません。従って、エリスポットは、培養中の活性化した後、記憶B細胞の循環の免疫応答の測定で選択する方法です。これは、長期的な体液性免疫の維持の監視を可能にします。

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>10 mL tube</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>endotoxin-free</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.5% solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag Human B lymphocyte enrichment set</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Streptavidin magnetic microbeads</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Blue nylon mesh cell strainer, 40 &amp;mu;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>clone HIB19</td></tr><tr><td>Anti-human CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>clone HIT2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>clone HIT2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-human CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-human CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td><td>clone LG.3A10</td></tr><tr><td>Anti-human CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>clone L128</td></tr><tr><td>Anti-human CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-human CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-human CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>clone 2H7</td></tr><tr><td>biotinylated anti-human CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>biotinylated anti-human CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&amp;nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>type B CpG</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>Protein A of &lt;em&gt;S. aureus &lt;/em&gt;Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitogen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen filter plates, 0.45 &amp;micro;m pore size</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane</td></tr><tr><td>BCIP/NBT solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG, Fc fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fc&amp;gamma; fragment specific</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fc&amp;micro; fragment specific</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgG-peroxidase, Fc&amp;gamma; fragment specific</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgM-peroxidase, Fc&amp;micro; fragment specific</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC substrate kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. ImmunoSpot analyzer</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity

体液性免疫の特徴は、合成し、そのような病原体としての抗原（Ag）から、固有の腹筋を分泌し、宿主防御のために使用される機能のASCを、生成することです。個体の体液性免疫応答の機能状態を定量的に決意するために、血清のAb及び循環のASCの両方は、一般的に機能的な読み出しとして測定されます。ヒトにおいては、末梢血は、宿主B細胞によって誘発される体液性免疫応答を決意するために使用することができる最も便利で容易にアクセス可能な試料です。 ASCを含む異なるB細胞サブセットは、系統特異的抗体コンジュゲートビーズまたはフローサイトメトリーで細胞選別を介して選択を介して、末梢血から直接単離することができます。また、精製されたナイーブ及びメモリーB細胞を活性化し、培養中のASCに分化させることができます。抗体分泌に貢献するのASCの機能活性は、酵素を収束するアッセイであるエリスポットによって定量することができます- 結合immunoabsorbanceアッセイ（ELISA）およびウエスタンブロッティング技術は、単一細胞レベルでの個々のASCの列挙を有効にします。実際には、ELISpotアッセイは、ますますために血液試料の多数の取り扱いの容易さのワクチンの有効性を評価するために使用されています。末梢血からのヒトB細胞を単離する方法は、 インビトロでのASCへのB細胞の分化、および総IgM-およびIgG-ASCを定量化するためのELISpotの使用は、ここで説明します。

PBMCを赤血球および接着細胞（1.7から1.2ステップ）の枯渇させました。細胞のアリコート（2×10 6）を 、ナイーブB細胞、メモリーB細胞、及びPBS /末梢血中のPC（ 図1）の集団を説明するためにフローサイトメトリー分析に供しました。このドナーのPBMCにおける、リンパ球の約10％がCD19 + B細胞でした。 B細胞区画において、CD19 + CD27の百分率-ナイーブB細胞は約50％でした。一方、CD19 + B細胞の約50％がCD27 +メモリーB細胞7、25-26ました。注目すべきは、CD27 +メモリーB細胞は、さらに、IgDの4を含めて分離することができます。 2、30-31 -のPB循環の表現型は、より良い低または無表面CD20の発現（CD19 + CD27 + /ハイ CD38 + CD20 LO /）で定義することができます。死細胞、7-AADを除外するには細胞染色（ステップ3.5）に含まれ、及び7-AAD 対 FSCためのプロットは、生細胞（7-AAD - ）集団をゲーティングを可能にすることができます。 ELISpotアッセイの重要なステップは、 図2に示されています。精製されたヒトB細胞およびCD19 + CD27 +記憶B細胞の両方は、5日間のRPMI 1640培地でのCpGの存在下で培養しました。細胞は、新たに出現したASCを定量するためのELISpotアッセイのために回収しました。存在する場合、既存のPBは、48時間11で出て死んでしまう末梢血から単離しました。 ELISpotアッセイを行い、自動プレートスキャナにより取得されたスポット像を図3に示されます。 10 4個の細胞11に50 -のIgG-たASCの数は10であるのに対し、5日間のCpGで処置した10 4 B細胞から200のIgM-のASC -のELISpotの結果は、典型的には50が表示されます。 ナイーブB細胞、メモリーB細胞、及びPBMC中のPBを分離するためのゲーティング戦略の 図1. イラスト。 （A）細胞（2×10 6）は、CD19-APC、CD27-eFluor450、およびCD38-PEモノクローナル抗体（ステップ3.4）の各2μgで染色しました。リンパ球コンパートメントは、側散乱（SSC）対前方散乱（FSC）のドットプロットに（G1）にゲートされました。貼り合わせ2細胞によって形成されている（B）細胞ダブレットは、FSC-H（高さ）対FSC-W（幅）についてのプロットに（それらの外G2）は除外しました。 （C）CD19 + B細胞は、SSC-A（面積）およびCD19-APCのためのプロット上G3としてゲートしました。 CD19 +細胞の（D）、CD27およびCD38のパラメータのドットプロットは、ナイーブB細胞（CD19 + CD27 - ; Q1およびQ4）を示し、記憶B細胞（CD19 + CD27 +を 、Q2とQ3）、およびPBS（CD19 + CD27 + /ハイ CD38 +、G4、Q2の0.6％）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54582/54582fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54582/54582fig2.jpg" /> エリスポットアッセイの重要なステップの 2. イラスト図 。 （A）は 、37℃で、または一晩4℃で2時間のELISpotプレートに抗ヒトIg抗体（IgG + IgM抗体+型IgA）のF（ab &#39;）2断片の50μL/ウェル（5μg/ ml）を入れてC（優先）（ステップ5.4）。 ELISPOTプレートのウェルに細胞を播種します。 14時間（ステップ5.11） - ASCには、PVDF膜に付着し、8のために腹筋を分泌することができます。 （B）は （0.05％Tween 20で）PBSで細胞を洗い流します。 （C）AP-あるいはHRP-CONJを追加ugated検出は、IgGまたはIgMのいずれかに特異的なABS。 （D）未結合している検出腹筋を洗い流します。 （E）検出腹筋と一致するように、APまたはHRPの基質溶液とスポットを開発します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54582/54582fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54582/54582fig3.jpg" /> 代表プレートから 3 のELISpot結果を 図 。 （A）精製されたCD19 + B細胞を、ELISPOTプレートの（それぞれウェル＃3によく＃1において50,000細胞を、ウェル＃2で25,000細胞および12,500細胞）は、3つの隣接するウェルに入れました。細胞を、RPMI 1640培地で一晩（〜14時間）で培養しました。 ELISpotアッセイは、培養（5.18に5.12ステップ）を完了した後に行きました。アナライザーへE結果、ELISPOTプレートは、スキャナとソフトウェアを備えた自動分析装置を介して画像を取得するためにスキャンしました。 （B）精製されたCD19 + CD27 +記憶細胞（10 6 / mL）を5日間のCpGの5μg/ mlの存在下で培養しました。細胞を、ELISpotアッセイのための（A）のように処理しました。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54582/54582fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K ビュー.  National Taiwan University. Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

ビデオ: The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

免疫・感染学

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

ELISPOT Assay: Detection of IFN-&#947; Secreting Splenocytes

Source: Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201
ELISPOT is a standardized, reproducible assay used to detect cellular immune responses. The assay utilizes an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)- based method to detect single-cell immune responses which can be visualized by spots, hence the name ELISPOT. ELISPOT was first described in 1983, by Czerkinsky, as a method of enumerating the number of B cell hybridomas producing antigen-specific immunoglobulins (1). The same group further developed the assay to measure the frequency of cytokine producing T lymphocytes. Now ELISPOT has become a gold standard for measuring antigen-specific T cell immunity in clinical trials and vaccine candidates. For example, after vaccination or during an infection, plasma cells and memory B cells secrete antibodies that provide protection. Typically, these B cell responses are assessed by measuring serum titers of antigen-specific antibodies. However, this type of analysis, typically measured by ELISA, may not include memory B cells, which can be present even in the absence of detectable serum antibody levels. Furthermore, it has been well-established that circulating memory B cells are important for the rapid and protective antibody response observed following pathogen re-exposure, thus it is critical to be able to detect these cells. Therefore, to clearly assess antigen-specific memory B-cell responses, both ELISA and ELISPOT should be used (2).
ELISPOT assay uses a plate containing membrane-lined wells that are coated with antibodies in order to capture secreted proteins of interest. Then, the plate is loaded with cells and stimuli to induce protein production. The secreted proteins are captured by the antibodies coated on the surface. After appropriate incubation time, cells are removed and the secreted molecule is detected by using a biotinylated antibody that is specific for a different epitope, as compared to the capture antibody. Next, streptavidin peroxidase is added, followed by the addition of a substrate that allows the detection of the spots (Figure 1). The strength of this assay is that it allows one to quantitate the number of cells producing the protein of interest. Importantly, one can assess if there are changes in the total number of cells producing a specific protein or if individual cells within a population are producing more protein. Moreover, it can provide information regarding kinetics and can be used to assess overall immune activation (mitogen stimulation) relative to antigen-specific responses (antigen simulation). The ELISPOT assay will permit the detection one activated cell amongst 300,000 cells following mitogenic or antigen-specific activation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10497/10497fig1.jpg" /> 
Figure 1: ELISPOT protocol overview.
The major advantages of this assay are its- a. Simplicity- the protocol is relatively simple and straightforward. It does not require technical expertise, b. Sensitivity- it permits the detection of immune cells at the single cell level and requires very few cells compared to other methods such as flow cytometry, c. Functionality- it provides quantitative data regarding immune function.
This lab exercise demonstrates the ELISPOT protocol for detection of IFN-&#947; secreting-splenocytes, but as mentioned above this assay can also be used to assess antibody secretion by B cells (3).

ELISPOT Assay: Detection of IFN-&amp;#947; Secreting Splenocytes

ELISPOTアッセイ:IFN-γ分泌脾細胞の検出

Source: Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum ...

Education

JoVE Science Education

高等生物学

免疫学

Flow Cytometry-Based Cell Sorting for Different Circulatory B Cell Populations

Source: Tzeng, S. J. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54582">The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity.</a> J. Vis. Exp. (2016).
In this video, we describe a protocol for the flow cytometry-based sorting of na&#239;ve B cell, memory B cell, and plasmablast plasma cell subpopulations from human peripheral blood B cells. The different B cell subpopulations can be distinguished based on fluorophore-based antibody binding to the CD19, CD27, and CD38 receptors expressed on the B cell surfaces, followed by cell sorting.

フローサイトメトリーを用いた、さまざまな循環型B細胞集団の細胞ソーティング

Source: Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫システムとコンポーネント

アッセイと機能プロファイリング

Functional Assessment of Antibody-Secreting B Cells Using ELISpot Assay

Source: Tzeng, S. J. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54582">The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the use of the ELISpot assay to assess the function of antibody-secreting B cells, ASCs. The antibodies secreted by the ASCs interact with the membrane-bound polyclonal antibody fragments, which are detected by the enzyme-conjugated IgG or IgM antibodies. The colored spot produced in each well indicates the presence of the specific antibody&#39;s isotype, which correlates with the B cells&#39; secretory activity.

ELISpotアッセイを用いた抗体分泌B細胞の機能評価

Isolation and Purification of B Cells from Human Peripheral Blood

Source: Tzeng, S. J. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54582">The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we demonstrate the isolation of B cells from human peripheral blood using biotinylated antibodies specific for non-B cells and streptavidin-conjugated magnetic microbeads.

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

要約

さらに動画を探す

この動画の章

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞性免疫応答の定量化

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

ELISPOTアッセイ:IFN-γ分泌脾細胞の検出

フローサイトメトリーを用いた、さまざまな循環型B細胞集団の細胞ソーティング

ELISpotアッセイを用いた抗体分泌B細胞の機能評価

ヒト末梢血からのB細胞の単離と精製

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

要約

さらに動画を探す

この動画の章

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

ELISPOTアッセイ:IFN-γ分泌脾細胞の検出

フローサイトメトリーを用いた、さまざまな循環型B細胞集団の細胞ソーティング

ELISpotアッセイを用いた抗体分泌B細胞の機能評価

ヒト末梢血からのB細胞の単離と精製

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞性免疫応答の定量化