このプロトコルは、特定のDNA配列に一時的に結合し、RNAプライマーの形成を触媒する酵素であるプリマーゼのタンパク質-DNA結合マイクロアレイからの膨大なデータの収集を記述する。このビデオでは、マイクロアレイ技術がprimaseシーケンス認識サイトの再定義にどのように役立ち、高スループットアプローチが古典的な生化学を補完できるかを説明します。この技術は、プリマーゼDNA結合マイクロアレイとプリマーゼ活性アッセイの2つのアプローチを組み合わせた。
マイクロアレイは、生化学的アッセイとしてDNAプリマーゼによるRNAプライマー形成に関する情報を提供するDNA配列に対するプリマーゼ結合の膨大なデータを提供する。テストされた酵素活性は、マイクロアレイ実験の洞察と、その性質上のスループットの低下に依存します。結合の効率、DNA配列選択および酵素の活性との間のリンクがプローブされる。
マイクロアレイを用いた配列決定の同定は、マイクロアレイの膨大なデータに基づいて正確な結論を導き出すことを可能にする。このアプローチは、これまでに転写因子のDNA結合配列を記述するために使用されてきた。転写因子は、DNAに密に結合する静的タンパク質です。
手順のデモンストレーションはステファン・イリックです。この手順を開始するには、マイクロアレイスライドを0.01%Triton-X 100を含むコプリン瓶に入れてプリウェットします。ラボの回転器で回転し、125 rpmを5分間追加します。
ブロック溶液をプラスチック製の箱にピペットします。次に、コプリンジャーからマイクロアレイスライドを取り外します。細かいワイプを使用して、スライドの非DNA側とエッジを駆動します。
マイクロアレイをプラスチック製の箱にゆっくりと入れます。ゆっくりと揺れで1時間室温でインキュベートします。この後、スライドをPBSで0.01%Tween-20で1回洗います。
125 rpmで5分間ラボの回転器で。Tween-20を取り外し、125 rpmのラボローテーターでPBSで0.01%Triton-X 100でスライドを2分間リンスします。その後、すぐにPBSを含むコプリン瓶にスライドを転送します。
まず、テキストプロトコルで概説されているようにPMBチャンバーを組み立てます。スライドを指定したスペースに配置します。ピンセットを使って押し下げて左に押し下げろ。
シリコンガスケットを上部に置き、PBMチャンバーの下部に十分に一致していることを確認します。その後、チャンバーを閉じ、斜めにネジを締めます。タンパク質結合混合物をガスケットの各ウェルにピペットする。
その後、室温で30分間インキュベートする。まず、ピペット0.05%Tween-20をPBSでPBMチャンバーに入れ、スライドを短時間洗浄します。真空吸引器を使用して、DNAスポットに触れないように注意してチャンバーのウェルから溶液を取り除きます。
これを繰り返し、スライドをPBSで短時間洗います。そして、真空を使用して、DNAスポットに触れないように注意しながら、チャンバーの井戸から溶液を取り除きます。次に、PBMチャンバーの各ウェルにAlexa 488コンジュゲート抗His抗体を加えます。
室温で暗闇の中で30分間インキュベートします。この後、PBS内の0.05%Tween-20を各ウェルに数滴加えて、PBMチャンバー内のスライドを簡単に洗浄します。そして真空吸引器を使用して、溶液をチャンバーの井戸から取り除き、DNAスポットに触れないように注意する。
PBMチャンバーを分解し、スライドを取り外します。PBSで0.05%Tween-20でスライドを2回リンスし、各リンスは3分間続きます。その後、スライドをPBSで2回リンスし、各リンスをそれぞれ3分間持続させます。
そして、3分間二重蒸留水で1回。スライドを圧縮空気で乾燥させます。そして、スキャンする準備ができるまで暗いスライドボックスに保管してください。
準備ができたら、マイクロアレイスキャナを使用して、495ナノメートルの励起と19ナノメートルの放出でチップをスキャンします。そして、中央値の蛍光強度を収集します。この研究では、piスループットプリマーゼプロファイリングは、古典的なツールを使用して観察することが不可能ではないにしても困難なものも含め、プリマーゼ結合部位をマッピングするために使用されます。
重要なことに、piスループットプリマーゼプロファイリングは、プリマーゼ結合部位の従来の理解を再検討することを可能にする。特にpiスループットプリマーゼプロファイリングは、既知の5'GTC3'認識配列に加えて結合特異性を明らかにし、T7 DNAプリマーゼの機能的活動の変化をもたらす。すなわち、シーケンスの2つのグループが識別されます。
側面にTGを含む強力な結合DNA配列と、側面にAGを含む弱結合DNA配列。5'GTC3'配列内に欠けていたDNAテンプレートへのプリマーゼ結合は検出されなかった。TGリッチな側面などの特定の特徴を含むプリマーゼDNA認識部位は、プリマーゼDNA結合を最大10倍に増加させる。
驚くべきことに、彼らはまた、新たに形成されたRNAの長さを増加させます。重要なことに、高スループットのプリマーゼプロファイリングにより、DNAテンプレートの配列に関連してプライマー長の変動を観察し、定量化することが可能になります。この手順を実行する場合、洗浄手順は微妙でなければなりません。
そして、バッファーには、DNAにプリマーゼを記録したコンポーネントが含まれている必要があります。また、無駄な結合イベントの閾値は生化学的に決定される。そのためマイクロアレイの解析が不十分である。
表面プラズマ共鳴やゲルシフトアッセイなどの方法は、DNA配列を選択するためにプリマーゼの結合親和性を決定することができる。私の研究室では、DNAポリメラーゼで拡張できる生産的なプライマーを生み出すプリマーゼ配列決定因子を検出するための機械学習予測モデルを実装しています。ビッグデータの時代には、ビッグデータを分析するための統計的手法の実装は、この技術は間違いなく特定のDNA配列をより良く特徴付け、配列認識をprimaseの活性に結び付けるのに役立ちます。
放射線を扱う人は、電離放射線の使用に関連する規制や危険を十分に理解する必要があります。訓練を受けるべきであり、安全装置と協力する必要があります。
