二重ルシファーゼレポーターシステムによるCRISPRプラスミドの構築と哺乳動物細胞におけるノックアウト効率の検出

このプロトコルは、効率的なsgRNAベクターの生成および最適化における重要なステップを説明する。候補sgRNAの先行加速は、相対的な時間と推論をターゲットにしています。このプロトコルの主な利点は、内因性遺伝子を編集することなく、各sgRNAのDNAコードインプレッションを分析することができるということです。

この事前選択方法は、二本鎖破断を通じて他の遺伝子編集手段にも適用することができる。まず、凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを、二重蒸留水中の10ミクロモルの最終濃度に希釈します。余分なバッファーを追加せずに、薄層 PCR チューブ内の前方オリゴヌクレオチドとリバース オリゴヌクレオチドを 1 対 1 の比率で混合します。

95°Cで5分間インキュベートし、温度を摂氏72度まで10分間下げます。PCRマシンからオリゴヌクレオチドミックスを取り出し、室温で冷却させます。pX330-xCas9ベクターを消化するには、Bbs1で、ベクター、酵素、および消化バッファーを50マイクロリットルの体積で組み合わせ、反応を摂氏37度で2時間インキュベートします。

細胞変換を行った後、LBプレートから5〜10個の細菌コロニーを選択し、それぞれを使用して1.5ミリリットルチューブに60ミリグラムのアンピシリンを含むLB培地1ミリリットルを接種します。その後、2〜3時間ロータリーシェーカーにチューブをインキュベートします。テキスト原稿に記載されているように、組み換えプラスミドをスクリーニングするPCRを実行し、10ボルト/センチメートルの下で2%アガロースゲルで製品を実行します。

陽性プラスミドを同定した後、それらを使用して、レポーターベクターと共に、適切な細胞株を共にトランスフェクトする。細胞をライゼするには、培養細胞から増殖培地を除去する。PBSで培養容器の表面を静かに洗浄し、各培養ウェルにPLBの100マイクロリットルを分配し、細胞モノ層を完全に覆う。

プレートを室温で20分間インキュベートし、その後、さらなる取り扱いまたは保管のためにチューブまたはバイアルにリゼートを移します。二重ルシファーゼアッセイを実行するには、2秒の予読遅延を提供し、その後10秒の測定期間を提供するようにルミノメーターをプログラムします。次いで、100マイクロリットルのルシファーゼアッセイ試薬を適当な数のルミノメーターチューブに分配する。

20マイクロリットルの細胞ライセートをルミノメーターチューブに慎重に加え、2~3回ピペットで混合します。チューブをルミノメーターに入れ、読み取りを開始します。サンプルチューブをルミノメーターから取り外します。

100マイクロリットルのストップ試薬と渦を短時間加え、混合します。サンプルをルミノメーターに戻し、読み取りを開始します。レニラルシファーゼ活性を記録し、ホタルルシファーゼ活性、具体的には画面に表示される比率の逆数に正規化した。

終了したら、反応管を捨てます。この方法は、ヒツジDKK2エソン1用の3つのsgRNAベクターを生成するために使用した。sgRNAおよびxCas9発現ベクターは、ベクター骨格を事前に消化し、続いてアニールオリゴペアを介して一連の短い二本鎖DNA断片を連結することによって構築された。

7つの細菌コロニーを特異的プライマーペア誘導PCRでスクリーニングし、陽性コロニーを検出した。pX330-xCas9 T1、T2、およびT3の遺伝子標的容量を、デュアルルシファーゼアッセイで同時に検出した。最後のsgRNAベクターは、最も高い検出シグナルを表示し、その後、羊の遺伝子編集研究に使用されました。

このプロトコルに従って、T7EIアッセイまたはリボヌクレアーゼアッセイを行うことができる。これらの追加措置は、内因性遺伝子編集のより正確な印象を与える。