この技術は、迅速かつ高スループットの分子ベースの技術を使用して、非常に類似性の高い株の混合集団からの微生物の正確かつ正確な定量を可能にする。最終的には、株間でのフィットネスの比較を可能にする。単一のプールで多くの菌株を同時に評価する能力は、すべての菌株が正確に同じ条件にさらされるため、ウェル・ツー・ウェルまたは生物から生物への変動を実質的に減少させます。
この技術の適応性は、ほぼすべての遺伝的に可鍛性の生物と微生物の正確な定量を必要とするほぼすべての実験設計に使用することを可能にする。テキストプロトコルに記載されているように、細菌染色体に遺伝子マーカーのエンジニアリングを開始します。1つを除くすべてのバーコードを含むゲノムDNAのプールを作成します。
このプールを希釈剤として使用し、単一残りのバーコードを含むゲノムDNAを有する希釈系列を行う。プローブベースの化学用に設計されたデジタル PCR スーパーミックスを使用するためのメーカーの推奨事項に従って、重複したデジタル PCR の反応を準備します。プールされたゲノムDNAをテンプレートDNAとして使用します。
また、テキストプロトコルに記述されているように、20 Xプライマープローブマスターミックスを追加します。メーカーの推奨に従って、デジタル PCR の反復制御反応を準備します。各プローブミックスの制御反応は、テンプレートコントロールなし、負のコントロール、および正のコントロールで構成されている必要があります。
バーコード化されたゲノム DNA サンプルごとにデジタル PCR 反応を作成するには、これらの手順を繰り返します。メーカーの指示に従って、液滴発生器を使用して各反応条件の液滴を生成します。新しく作成された液滴を適切な96ウェルプレートに移します。
5~50マイクロリットルのマルチチャネリングピペットに200マイクロリットルピペットチップを使用してください。すべての液滴が生成され、転送された後、ホイルプレートシーラーでプレートを密封します。サイクリング条件を実行するには、製造元が推奨するサーマルサイクラーを使用してください。
サーモサイクリングが実行されている間、サンプル名、実験タイプ、使用するスーパーミックスなどのプレート設定情報を使用してデータ解析ソフトウェアをプログラムします。また、ターゲット 1 名とターゲット 1 の種類、ターゲット 2 名とターゲット 2 の種類も含めます。サーモサイクリングが完了したら、完成した反応を液滴リーダーに移し、メーカーの指示に従って読み取りプロセスを開始します。
すべての井戸が読み取られ、実行が完了したら、データ分析ソフトウェアを使用してQLPデータファイルを開きます。同じプライマープローブMastermixを使用するすべてのウェルを選択します。[液滴]タブで、正と負の両方の液滴を含む各ウェルで分析された液滴の数を調べます。
10,000個未満のウェルを分析から除外します。[1D 振幅]タブに移動し、正と負の液滴の振幅を調べます。2つの異なる集団を含んでいることを確認してください。
ソフトウェア内で、しきい値機能を使用して、使用されたプローブごとに正の液滴と負の液滴の間のカットオフを行います。適切な閾値がすべてのウェルに適用されると、ソフトウェアは各反応のDNAコピー数を計算します。データをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析を行うことができます。
これらの値を使用して、サンプル内の各固有のゲノムバーコードの初期コピー数を計算します。陰性対照反応から偽陽性率の平均値を求め、実験反応で得られた値からこの値を減算します。各実験の設定時に実行された希釈値に基づいて、必要に応じて値を乗算します。
今度は、競合指数を計算して生物の相対的な適合性を決定するか、バーコード化された株のデジタルPCRベースの定量化から競合指数を取り消した。すべての時間ポイントで、バーコード化された各ひずみに対してこのステップを実行します。AAバーコードを含むゲノムDNAを、他のすべてのバーコードゲノムDNAの背景で希釈した。
チャネル 1 は AA バーコードの FAM プローブを表し、チャネル 2 は AO バーコードの HEX プローブを表します。各プローブの結果は、選択されたウェル内のすべての液滴の蛍光強度の周波数を表す個々の液滴蛍光振幅とヒストグラムの両方として提示される。各条件について、正および負の液滴は2つの異なる集団を形成する必要があります。
正および負の液滴を定義するために、閾値機能を使用して母集団を分離する必要があります。しきい値は使用されたプローブによって異なりますが、同じプローブミックスを使用するすべてのウェルのしきい値は同じである必要があります。希釈されたAAの場合、正の液滴は負の液滴によって実質的に上回るので、ヒストグラムは単一の集団のみを描写しているように見える。
しかし、左パネルの蛍光振幅を調べることで、2つの異なる集団が依然として見える。AAバーコード化ゲノムDNAを希釈すると、陽性の液滴が減少し、陽性AO液滴の数は一定のままである。適切な閾値がすべてのウェルに適用されると、ソフトウェアは各反応のDNAコピー数を計算します。
研究の一環として PCR を日常的に実行する場合は、この手法を実行してモデル生物の適合性を評価できます。この手順は、通常、上流の実験の終了結果を決定するために使用されます。その真の有用性は細菌の定量に依存するあらゆる実験のための容易さおよび多様性を促進することである。
私たちは、感染のマウスモデルにおけるサルモネラフィットネスを評価するために、この技術を使用しています。また、この技術は、当研究室の他の病原微生物との併用に適応されています。
