この手順の全体的な目標は、下気道への細菌接種の単純で非侵襲的な経路を提供し、続いて転写物分析のためのRNAの細菌回収および精製を提供することによって、二次細菌性肺炎研究を強化することである。これは、最初にマウスを深く麻酔し、上顎切歯から垂直に吊り下げられたマウスの気管にプリロードされた鈍い先端の曲がった針を挿入することによって達成される。第二に、成功した感染に続いて、細菌コロニー形成ユニットは、肺の切除および均質化によって回収される。
得られた肺ホモゲン酸は、コロニー形成単位を列挙するために栄養寒天に連続的に希釈し、メッキされる。最後に、RNAは肺ホモジネートから精製される。この手順の利点は、下気道への直接制御された送達を可能にすることです。
これにより、病原体の組み合わせと個々の貢献の両方を病気の結果に向けて見ることができます。この分野における最近の進歩は、細菌遺伝子調節が感染の結果を決定する上で大きな役割を持つ可能性があることを実証している。この技術は、細菌CFUsとRNAの両方を回収する能力から恩恵を受ける。
RNAが単離されると、特定の毒性遺伝子が感染に対する寄与を評価することができます。さらに、この技術は非外科的であることから利益を得る。これにより、この手順で使用される動物に最小限のストレスを与え、即時回復を可能にします。
この手順は、カニューラ、ガイドワイヤまたは光ファイバーケーブルの任意のタイプを使用せずに一般的な実験室の機器を使用することで利点があります。この技術に新しい個人は、気管を通して実際のインストールに最初に苦労する可能性があります。.この技術が概念化されると、マウス宿主内の二次細菌性肺炎を尋問する簡単で効果的な手順となる。
手順を開始する前に、次の供給でワークスペースを準備します:挿管プラットフォーム、無菌1 mLシリンジ、無菌鈍チップ鉗子、無菌21ゲージの鈍い先端針、および注射器および鉗子を格納するための2つの円錐管。病原体の接種を準備して、所望の最終濃度が50マイクロリットルの体積で得られるようにして、処置を開始する。次に、滅菌手袋を使用して、1〜1.5インチ21ゲージの鈍い先端針を約35度の角度に曲げることによって準備する。
注射器に針を固定した後、100マイクロリットルのエアクッションを引き、続いて感染因子の50マイクロリットルを引き出す。100マイクロリットルのエアクッションはスポイトが落ち込んだ後の病原体負荷の完全な配達を保障する。ロードされた針と注射器を、支配的な手で簡単にアクセスできる場所に置きます。
麻酔室からマウスを取り出して麻酔し、上顎切歯から挿管プラットフォーム上でマウスを中断します。鈍い先端の鉗子を使用して、穏やかに舌をつかんで伸ばします。鉗子から非支配的な手の親指と人差し指に舌を移す。
非支配的な手で舌を保持したまま、プリロードされた注射器を拾います。針の曲がった端を体から離します。針を口腔に挿入します。
舌の根元で手首を優しく傾け、針を体から離します。このアクションは、針が食道ではなく気管に挿入されることを保証します。ゆっくりと針を気管に下ろします。
針がボーカルフォールドを通過すると、多くの場合、わずかなダニが感じられます。針がカリナに遭遇するとわずかな抵抗が感じられるまで、気管を通して針を通します。わずかに上向きの方向に針を持ち上げて、カリーナの上の針を吊り下げます。
これにより、一次気管支への配送が可能になります。感染性負荷を供給するために、注射器プランジャーを完全に落ち込ませる。気管から針を取り出し、捨てます。
ゴムバンドを押し下げて挿管プラットフォームからマウスを取り外しますが、マウスを直立した位置に保持します。ナレスの上に指を置くことによって鼻道を妨げる。この位置を約1分間、または複数の深呼吸が観察されるまで保持します。
この最後のステップは、総接種量が下気道に送達されることを保証する。動物をケージに戻し、麻酔からの迅速な回復があることを確認してください。選択された時点で、感染した肺を切除して、二次細菌性肺炎に関連する罹患率の増加に対する細菌の寄与を定量化し、評価することができる。
スケールと無菌の重量を量るボート、解剖のプラットホーム、はさみおよび鉗子および無菌ガーゼを含んでいる解剖キットは次の項目とワークスペースを準備しなさい。このデモンストレーションの目的のために、肺の切除はベンチトップで行われます。しかし、この手順を通して無菌性を維持するためには、肺切除を層流フード内で行うことを推奨する。
CO2または同様のIACUC承認の安楽死方法で感染したマウスを安楽死させる。解剖プラットフォーム上に感染したマウスを配置し、保護します。作業面での無菌性を維持するために、マウスにエタノールをスプレーします。
臍帯から始まり、ペア鉗子を使って皮膚を持ち上げ、喉頭に向かって切開を行う。最初の切開の両側の皮膚をつかみ、皮膚を体から引き離し、組織の接続を切断します。胸部領域の多くを明らかにするために皮膚全体の横切りを行うことを助けることができます。.
xiphoidプロセスの基部から始めて、横隔膜を穿刺するつもりで小さな切開を行う。これは、胸腔の圧力の増加をもたらし、肺を引き込む原因となる。肺を引き込んだまま、切開を続けて横隔膜を解放する。
両側に切開を行うことで肋骨を取り除きます。これは、胸腔と肺を露出します.切除するには、肺は鉗子で心臓の基盤をつかみ、上方に持ち上げます。
肺の後ろにはさみを置き、心臓を上に持ち上げ続けながら、組織の接続を通して小さな切開を開始します。肺を切除したら、生殖不能ガーゼの上に置き、肺から離れ、残りの組織接続を切断することによって心臓を取り除きます。肺を事前タール計量ボートに移し、質量を記録する。
肺の重量を量った後、肺を無菌リン酸緩衝生理食塩水に移し、一時的に氷の上に貯蔵する。肺が切除され、計量された今、細菌は病因に対する役割を決定するために回復することができる。細菌回収に備えて、組織粉砕機、無菌RNaseフリーPBS、β-メルカプトエタノールを添加したバッファRLT、および1.5 mL RNaseフリーマイクロ遠心チューブが必要です。
まず、滅菌RNaseフリーPBSの1mLを組織グラインダーに加えます。充填したら、組織グラインダーを氷の上に保管します。次に、一連の無菌RNaseフリーシリアル希釈チューブを調製し、感染した肺から回収された細菌負荷を定量化します。
準備された組織グラインダーに肺を移し、回転しながら台座を押し下げて組織を完全に均質化する。組織粉砕機と均質化サンプルのアリコート100マイクロリットルを、調製したシリアル希釈管の最初に開く。サンプルとプレートを栄養寒天で連続して希釈し、コロニー形成単位を列挙する。
CFUsは、肺組織のミリグラム当たり、mL当たりまたは1mL当たりのCFUsとして記録することができる。100マイクロリットルのアリコートを取り除いた後、粉砕台座と遠心分離機を4,000rpmで摂氏4度で10分間交換します。遠心分離が完了したら、ペレット化したサンプルから上清を取り除く。
上清は、後日さらに分析するためにマイナス80°Cで保存し、保存することができます。700マイクロリットルのRLT β-メルカプトエタノールで均質化された組織ペレットを再中断し、サンプルを無菌RNase-free 1.5 mL遠心分離管に移します。この時点で、サンプルはマイナス80度で保存できます。
RNAは、1ミリシリカビーズを含む2mLマイクロ遠心分離チューブにサンプルをロードすることによってRLT肺ホモジネートスラリーから精製し、毎秒6メートルで20秒間ビーズビーターを介して処理することができます。RNAは、Voyich等で報告されたRNeasy法の適応を用いて直ちに精製される。分子生物学における方法"2008、およびこのビデオに付随する原稿に記載されている。
精製後、分光光度計を用いてRNA収率を定量することができる。一度定量化すると、得られたRNAをマイクロリットル当たり50ナノグラムの複数のアリコートに希釈することが有益である。これにより、サンプルからのRNAを複数の凍結融解サイクルの対象とすることなく、複数の分析に使用できます。
この技術を使用すると、制御された病原体負荷を下気道に直接設置することができます。この配信システムの効率は、1%Coomassieブリリアントブルーソリューションのインストールによって実証することができます。一番上の行は、コントロールとして機能する未感染の肺のペアを表示し、一番下の行は、気管内設置を通じて1%クマシー鮮青色染料の50マイクロリットルを受け取った肺のペアを表示します。
この色素の使用は、気管内設置が左右の肺に対する病原体負荷の均等な分布を提供する方法を示す。感染すると、病原体の負荷を回復し、肺組織の切除および均質化によって気管内設置後の様々な時点で分析することができる。この回収技術の効率を実証するために、3匹のマウスをそれぞれ含む2群が黄色ブドウ球菌の低用量および高用量で感染した。
細菌の入力は、CFUsを列挙するために栄養寒天にメッキされた。気管内設置後1時間、マウスを安楽死させ、肺を切除し、組織粉砕機で均質化した。ホモジナイズ組織を連続的に希釈し、栄養寒天にメッキしてCFUsを列挙した。
均質化された肺組織から単離されたRNAを逆転写酵素PCRで調べ、標的遺伝子の相対的な転写量を定量化するために使用することができる。バックグラウンドDNA汚染を最小限に抑えるために、逆転写酵素を添加せずにPCR反応をqRT-PCR反応と一緒に実行することをお勧めします。細菌の負荷に加えて、この技術は、ウイルス負荷のインストールおよび分離に拡張することができます。
肺組織の均質化に続いて、ウイルスRNAを単離して、ウイルス遺伝子の産物の豊富さを測定するか、またはウイルス定量のための標準的な曲線を構築するために使用することができる。このシステムの使用は二次細菌性肺炎を研究するために非常に能率的で再生可能なシステムを提供する。一度習得すると、この手順は大規模な実験で使用することができます。
マウスを安楽死させるためにバッチで働いて、気管内設置はマウスあたり30秒以内に起こり得る。これが完了した後、肺の切除に移り、これはマウス1匹につき約2〜3分で完了することができる。ここで説明する方法は二次細菌感染の文脈の範囲内であったが、接種の制御された送達および回復が必要なあらゆる処置に向けて拡張することができる。
ここに記載されている方法に加えて、この手順は、肺の切除前に気管支肺胞洗浄の添加によって補足することができる。これはしばしば病原体負荷の回復を減少させるが、サイトカイン分析、乳酸脱水素酵素活性、および異なる細胞集団の同定などのデータを得る利点がある。病因の病態をより完全に理解するためには、宿主と病原体の両方に疾患への寄与を問い合わすることが重要になります。
このビデオの目的は、マウスホスト内の二次細菌性肺炎を探索するための簡単で効率的な方法を提供することであった。
