このプロトコルは、常駐グリアから脳内に直接新しいニューロンを生成することが可能であり、これらの再プログラムされた細胞がサブタイプ特異的ニューロンに成熟することを示しています。主な利点は、NG2-gliaと分析のために再プログラムされたニューロンにラベルを付けたGFPレポーターの特異的な標的化を可能にするcre依存型AAVウイルスである。脳内の新しいニューロンを生成することは、脳内の細胞置換療法の将来の開発につながる可能性があります。.
私たちのプロトコルでは、精神疾患に影響を与えるパルブアルブミン陽性インターニューロンを生成します。インビボリプログラミングは、あなたがターゲットにしたい神経表現型や神経学的状態に応じて、他の脳領域や回路に適用することができます。この手順のデモンストレーションは、ジェニー・ヨハンソン:技術者、マリア・ペレイラ:元博士課程の学生、そして私たちの研究室の博士課程の学生であるマルセラ・ビルテレです。
AAV5ウイルスベクターを産生するために、5つのT175フラスコに標準培養培地を用いたHEK293T細胞をシードする。細胞が50〜70%の合流に達したら、次の混合物をトランスベクション用に調製する。50ミリリットルの遠心分離管に、等モル量のベクタープラスミドとpDGシリーズヘルパープラスミドを加える。
144マイクロリットルの最終体積にTris-EDTAバッファーを加え、超純水を加えて1296マイクロリットルの総容量を得て混合します。次に、144マイクロリットルの2.5モル塩化カルシウムを加え、混合します。その後、DNA溶液と渦に1.92ミリリットルのHBSをすぐに加えます。
室温で正確に60秒間インキュベートします。続いて、溶液を28ミリリットルの新鮮な細胞培養培地に移し、混合する。フラスコ内の培地を、トランスベクションミックスを含む培地に交換します。
3日間待ってから、メディアを無駄に移します。各フラスコに収穫バッファーを5ミリリットル加え、各フラスコにさらに4ミリリットルのDPBSを加えて残りの細胞をすすいで、細胞溶液とプールします。収穫した細胞を摂氏4度で5分間5分間1,000xgで遠心分離する。
遠心分離後、上清を取り除き、15ミリリットルの溶解バッファーにペレットを溶解します。50ミリリットルの遠心分離管をドライアイスに15分間凍らせ、マイナス20度の冷凍庫に保管します。使用前に、収穫した細胞のライセートを摂氏37度の水浴で解凍する。
この手順では、iodiキサノール勾配超遠心分離によるAAV精製を行い、室温で1時間45分間、350、000 x gで遠心分離を有する超遠心分離天井管を使用する。AAV含有相を抽出するには、ベベルを上向きにして40〜60%の相境界の約2ミリメートル下に18ゲージ針を持つ10ミリリットルの注射器を挿入し、引き出します。ウイルスベクターの5〜6ミリリットルが抽出された後、タンパク質バンドに到達する前に停止することを確認してください。
次に、希釈したイオデキサノール勾配をアニオン交換フィルタを通して、1秒あたり1滴以下の速度で押し通すことによって精製し濃縮する。その後、IEバッファの3ミリリットルをゆっくりとフィルターを通して洗浄します。次に、溶出バッファーの 1 ~ 2 ミリリットルの遠心フィルター ユニットに混合物を溶出させます。
4ミリリットルの最終容積にDPBSをデバイスに加えます。DPBSの0.5ミリリットル未満になるまで室温で2,000 x gで遠心分離機がフィルターに残される。その後、チューブの底から液体を取り除き、4ミリリットルのDPBSを補充し、再び遠心分離機を使用します。
このステップをさらに2回繰り返し、最後の遠心分離後にフィルター上の濃縮ベクターの体積が約200マイクロリットルであることを確認してください。ピペットを使用して200マイクロリットルの濃縮ベクターを取り出し、0.22マイクロメートルのフィルターを通して殺菌します。次に、アリコート200マイクロリットルをインターロックインサート付きのガラスバイアルに入れる。
リプログラミング因子を注入するには、ステレオタキシックフレームに麻酔マウスを配置します。手術の開始時に適切な鎮痛を投与し、注射針のガラス毛細血管の先端をブレグマのすぐ上に持って来てください。毛管先端がA-PおよびM-Lの両方の平面で完全にまっすぐであることを確認しなさい。
デジタル座標カウンタで、M-L 値と A-P 値を両方とも 0.0 にリセットします。動物の頭部が完全に平らな位置にあることを確認するには、デジタル座標カウンタを使用して、A-Pアームがプラス2.0とマイナス2.0の場合、およびM-Lアームがプラス2.0とマイナス2.0の場合にD-V座標値を測定します。歯棒と耳棒の高さを適宜調整します。
その後、注射器を少し上げ、注入の座標で歯科ドリルを使用して穴を開けます。現場で掘削を開始し、円形で優しく作業します。次に、開いた切開部の上に綿のガーゼを置き、生理食い液で注射器を洗い流します。
フラッシュした後、気泡を作り出し、次いでウイルスベクターを含む溶液を1マイクロリットル引き出す。ウイルス溶液が気泡の下で容易に視覚化できることを確認してください。次に、シリンジを下げ、所望の深さまでゆっくりと進行し、そして軌道が骨片からはっきりしていることを確認する。
続いて、1分間に0.4マイクロリットルの速度でウイルス溶液の1マイクロリットルを注入する。注射が終わったら、注射器の離脱前に拡散のために2分間待ちます。拡散後、毛細血管の先端が脳から完全に引き抜かれるまでゆっくりと注射器を引き込み、切開を慎重に縫合し、動物を立体フレームから取り除く。
意識が回復するまで術後ステーションで動物を監視します。動物は、ウイルス注射後最大12週間保持され、常駐グリアが成熟したニューロンに再プログラムできるようにします。ビブラートメを使用して電気生理学のための脳スライスを準備するには、最も多くのrostral部分から高速で線条体レベルまで脳を切り離します。
その後、275マイクロメートルで275マイクロメートルで1秒当たり0.1ミリメートルで線条体を断面化します。各セクションの後、慎重に非注入線条体側を除去し、室温で水浴中の底ネットと酸素化CREBセンススライドとバイアルに注入された側を移します。すべてのセクションが切断されるまで、バイアルを室温に保ちます。
その後、ゆっくりと水浴の温度を摂氏37度に上げ、30分間放置し、ヒーターをオフにして室温まで冷まします。1つの組織セクションを電気生理学のために記録チャンバーに移した後、ガラスピペットを記録電極に取り付け、溶液に下げます。電極の抵抗を再確認します。
次に、ピペットで再プログラムされたセルにゆっくりと近づき、先端を差し込まないように電極にわずかな正圧を保ち、パッチを当てる前にセルがGFP陽性であることを確認します。セルにパッチが適用されたら、現在のクランプでマイナス60からマイナス70ミリボルトまでセルを維持し、マイナス20からプラス90ピコアンペアの500ミリ秒の電流を注入して、アクション電位を誘発します。これは、神経細胞の成熟と成功したリプログラミングを示しています。
その後、電圧クランプに切り替え、10ミリボルトの脱分極工程で内向きナトリウムおよび遅延整流カリウム電流を測定します。ここでは、成熟した神経形態と樹状脊椎を示すポスト記録されたバイオシチン充填再プログラムニューロンです。ここで、再プログラムされたニューロンの電気生理学的記録は、自発的な活動手段を用いた心筋機能接続の存在を示す。
トレースは、ピクロトキシン、GABAA受容体拮抗薬およびCNQX、AMPA受容体拮抗薬でブロックされている興奮性活性でブロックされている阻害活性を示しています。パッチを当てたニューロンは、注射後5週間で既に昼寝後の活動を示し、注射後8週間と12週で続く。現在の誘発作用電位を有するニューロンの数も時間の経過とともに増加する。
より詳細な分析は、細胞の大部分がパルブアルブミンインターニューロンに似た速いスパイク活性を示すいくつかの明確な発火パターンを明らかにした。12週での免疫物質化学的分析は、さらにレポーターGFPとパルブアルブミンの共発現を示した。この手順に従って、パッチシーク技術で遺伝子発現を調べたり、単シナプストレーシングおよびiDISCOによる3次元シナプス接続性を評価することができます。
レジデントグリアをインターニューロンを発現するパーブアルブミンに再プログラムすることが可能になったので、これらは本物であり、治療ツールとして使用できるかどうかを調査し始めました。動物を扱うときとAAVウイルスを使用する際には、確立されたプロトコルとガイドラインに従うことを忘れないでください。
