פרוטוקול זה מראה כי ניתן ליצור נוירונים חדשים ישירות במוח מן גליה תושב, כי אלה תאים מתוכנתים מחדש להתבגר לתוך נוירונים תת-סוג ספציפי. היתרון העיקרי הוא וירוס AAV תלוי cre המאפשר מיקוד ספציפי של NG2-גליה ואת כתב GFP כי תוויות נוירונים מתוכנתים מחדש לניתוח. יצירת נוירונים חדשניים במוח עלולה להוביל להתפתחות עתידית לטיפולים בהחלפת תאים במוח.
בפרוטוקול שלנו אנו מייצרים את האינטראורונים החיוביים של פרבלבומין שיש להם השלכות על הפרעות פסיכיאטריות. תכנות מחדש של Vivo יכול להיות מיושם על אזורים ומעגלים אחרים במוח תלוי מה פנוטיפ עצבי ומצב נוירולוגי אתה רוצה למקד. הדגמת ההליך תהיה ג'ני ג'והנסון: טכנאית, מריה פריירה: סטודנטית לשעבר לדוקטורט, ומרסלה בירטלה: סטודנטית לדוקטורט במעבדה שלנו.
כדי לייצר וקטור ויראלי AAV5, זרע HEK293T תאים עם בינוני תרבות סטנדרטית בחמישה בקבוקונים T175. כאשר התאים מגיעים ל-50 עד 70%, הכן את התמהיל הבא להתהוות. בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, להוסיף כמויות טוחנת שווה של פלסמיד וקטור, ו pDG סדרת עוזר plasmid.
הוסף מאגר Tris-EDTA לנפח סופי של 144 מיקרוליטר ולאחר מכן הוסף מים אולטרה-חמים כדי לגרום לנפח כולל של 1296 מיקרוליטרים ולערבב. לאחר מכן, מוסיפים 144 מיקרוליטרים של 2.5 כלוריד סידן טוחן ומערבבים. לאחר מכן, להוסיף 1.92 מיליליטר של HBS לפתרון DNA ומערבולת מיד.
דגירה בטמפרטורת החדר בדיוק 60 שניות. לאחר מכן, להעביר את הפתרון 28 מיליליטר של תאים טריים תרבות בינוני ומערבבים. החלף את המדיום בבקבוקים עם המדיום המכיל תערובת transvection.
חכה שלושה ימים, ותעביר את התקשורת לבזבוז. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ קציר לכל בקבוקון, ולאחר מכן להוסיף עוד ארבעה מיליליטר של DPBS לכל בקבוק כדי לשטוף את התאים הנותרים ואת הבריכה עם פתרון התא. צנטריפוגה התאים שנקטפו ב 1, 000 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהמיס את גלולה ב 15 מיליליטר של חיץ תמוגה. להקפיא את צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על קרח יבש במשך 15 דקות ולאחסן במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, להפשיר את התא שנקטף lysate באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
בהליך זה, לבצע טיהור AAV על ידי אולטרהצנטריפוגה שיפוע יוד ולהשתמש צינורות תקרה אולטרהצנטריפוגה עם צנטריפוגה ב 350, 000 x g במשך שעה אחת ו 45 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לחלץ את AAV המכיל שלב, להכניס מזרק 10 מיליליטר עם מחט מד 18 בערך שני מילימטרים מתחת לגבול 40 עד 60% פאזה עם השיקוע פונה כלפי מעלה לסגת. הקפד לעצור לפני שהגיע רצועת החלבון לאחר חמישה עד שישה מיליליטר של וקטור ויראלי כבר מופק.
לאחר מכן, לטהר ולרכז את שיפוע יודיקסנול מדולל באמצעות מסנן חילופי אניון, על ידי דחיפת אותו דרך בקצב לא מהר יותר מאשר טיפה אחת לשנייה. לאחר מכן, לדחוף שלושה מיליליטר של מאגר IE לאט דרך המסנן כדי לשטוף אותו. לאחר מכן, החלק את התערובת ליחידת סינון צנטריפוגלית עם אחד עד שני מיליליטר של מאגר אלוטיון.
הוסף DPBS להתקן לנפח סופי של ארבעה מיליליטר. צנטריפוגה ב 2, 000 x גרם בטמפרטורת החדר עד פחות מ 0.5 מיליליטר של DPBS נשאר במסנן. לאחר מכן, להסיר נוזל מתחתית הצינור, מילוי מחדש עם ארבעה מיליליטר של DPBS, צנטריפוגה שוב.
חזור על שלב זה פעמיים נוספות, ודא כי נפח וקטור מרוכז על המסנן הוא כ 200 microliters לאחר הצנטריפוגה האחרונה. הסר את 200 וקטור מרוכז מיקרוליטר באמצעות פיפטה, ולדחוף אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי לעקר. לאחר מכן, aliquot 200 microliters לתוך בקבוקון זכוכית עם הכנס שלובים.
להזרקת גורמי תכנות מחדש, הצב עכבר הרדמה במסגרת הסטריאוטוקסית. לנהל משככי כאבים מתאימים בתחילת הניתוח, ואז להביא את קצה נימי הזכוכית של מחט ההזרקה ממש מעל bregma. ודאו שהטיפ נימי ישר לחלוטין בשני מטוסי ה-A-P וה-M-L.
אפס הן את ערכי M-L והן את ערכי ה- A-P ל- 0.0 ב מונה הקואורדינטות הדיגיטליות. כדי לוודא שראש החיה נמצא במצב שטוח לחלוטין, השתמש ב מונה הקואורדינטות הדיגיטליות כדי למדוד את ערך הקואורדינטות D-V כאשר זרוע ה- A-P נמצאת בפלוס 2.0 ומינוס 2.0 וכן כאשר זרוע ה- M-L נמצאת בפלוס 2.0 ומינוס 2.0. התאימו את גובה השן ואת האוזן בהתאם.
לאחר מכן, הרם מעט את המזרק וקדח חור באמצעות תרגיל שיניים בנקודות הציון של ההזרקה. התחל לקדוח באתר, עובד בצורה מעגלית ועדינה. לאחר מכן, מניחים חתיכת גזה כותנה על החתך הפתוח לשטוף את המזרק עם תמיסת מלח.
לאחר שטיפה, לצייר בועת אוויר ולאחר מכן microliter אחד של פתרון המכיל את הווקטור ויראלי. ודא כי הפתרון הוויראלי ניתן לדמיין בקלות מתחת לבועת האוויר. לאחר מכן, מנמיך את המזרק, מתקדם לאט לעומק הרצוי, וודא שהמסלול נקי ממשברי עצם.
לאחר מכן, להזריק מיקרוליטר אחד של הפתרון הנגיפי בקצב של 0.4 microliters לדקה. כאשר ההזרקה נעשית, לאפשר שתי דקות עבור דיפוזיה לפני נסיגת מזרק. לאחר דיפוזיה, לאט לסגת המזרק עד קצה נימי הוא נסוג לחלוטין מהמוח, ואז בזהירות לתפור את החתך ולהסיר את החיה מן המסגרת stereotaxic.
לפקח על החיה בתחנה לאחר הניתוח עד ההכרה היא חזרה. בעלי חיים נשמרים עד 12 שבועות לאחר הזרקת וירוס כדי לאפשר גליה תושב לתכנת מחדש לתוך נוירונים בוגרים. כדי להכין פרוסות מוח לאלקטרופיזיולוגיה באמצעות רטט, חותכים את המוח מהחלק הסטראלי ביותר עד לרמה הסטריאטית במהירות גבוהה.
לאחר מכן חתך את הסטריאטום ב-275 מיקרומטר ב-0.1 מילימטרים לשנייה. לאחר כל קטע, להסיר בזהירות את הצד striatal לא מוזרק ולהעביר את הצד מוזרק לתוך בקבוקון עם רשת תחתונה מחומצן CREB להחליק באמבט המים בטמפרטורת החדר. שמור את הבקבוקון בטמפרטורת החדר עד שכל החלקים נחתכים.
לאחר מכן, לאט להגדיל את הטמפרטורה של אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס ולהשאיר אותו במשך 30 דקות, ולאחר מכן לכבות את התנור ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר העברת קטע רקמה אחד לתא הקלטה לאלקטרופיזיולוגיה, הר את פיפטה הזכוכית על האלקטרודה המתעדת והורד אותה לתוך הפתרון. בדוק שוב את ההתנגדות של האלקטרודה.
לאחר מכן, לאט להתקרב לתא מתוכנת מחדש עם פיפטה, שמירה על לחץ חיובי קל באלקטרודה, כדי למנוע חיבור הקצה, ולבדוק כי התא הוא GFP חיובי לפני תיקון. כאשר התא תוקן, לשמור על התא מהדק הנוכחי ממינוס 60 עד מינוס 70 מילי-וולט, ולהזריק 500 זרמי אלפיות שנייה ממינוס 20 פלוס 90 picoamperes עם 10 מרווחים picoampere כדי לגרום פוטנציאל פעולה. זה מעיד על התבגרות עצבית ותכנות מחדש מוצלח.
לאחר מכן, לעבור מלחצי מתח ולמדוד את הנתרן פנימה ועיכוב תיקון זרמי אשלגן בשלבים depolarizing של 10 מיליבולטים. הנה פוסט נרשם ביוצטין מלא נוירון מתוכנת מחדש אשר מראה מורפולוגיה עצבית בוגרת ואת קוצים דנדריטי. כאן, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של הנוירונים מתוכנתים מחדש להראות את נוכחותם של קשרים תפקודיים postsynaptic עם אמצעי פעילות ספונטניים.
עקבות להראות את הפעילות מעכבות כי הוא חסום עם picrotoxin, אנטגוניסט קולטן GABAA ואת פעילות סינפלורציה כי הוא חסום עם CNQX, אנטגוניסט קולטן אמפא. הנוירונים המדבקים כבר מראים פעילות פוסט-סינפטית בחמישה שבועות לאחר ההזרקה, וממשיכים בשמונה ו-12 שבועות לאחר ההזרקה. מספר הנוירונים עם פוטנציאל הפעולה המושרה הנוכחי גם עולה עם הזמן.
ניתוח מפורט יותר חשף מספר דפוסי ירי ברורים שבהם רוב התאים מראים פעילות ספינג מהירה הדומה ל- parvalbumin interneurons. ניתוח אימונוהיסטוכימי ב 12 שבועות נוספים הראה ביטוי שותף של הכתב GFP ואת parvalbumin. בעקבות הליך זה ניתן לבחון את ביטוי הגן עם טכניקת מחפש טלאי או להעריך את הקישוריות הסינפטית התלת מימדית עם מעקב חד-סינפטי ו- iDISCO.
כעת, לאחר שניתן לתכנת מחדש את גליה תושבת לפרבלבומין המבטאת אינטרפרונים, התחלנו לחקור אם אלה אותנטיים וניתן להשתמש בהם ככלי טיפולי. זכור לפעול לפי הפרוטוקולים וההנחיות שנקבעו בעת טיפול בבעלי חיים ושימוש בנגיף AAV.
