この手順の目的は、骨のリモデリングを評価し、カルバリア培養または癌細胞との共培養を用いて腫瘍-骨微小環境を再現するex vivoモデルを有することである。最もカルバリアの技術は、新生児マウスのカルバリア骨を使用して骨のリモデリングを評価する臓器培養系である。多様な分子の治療可能性をテストしたり、がん細胞との共培養を行う場合は骨腫瘍微小環境を再現することもできます。
そのすべては、短時間で簡単にアッセイし、低コストで。この技術の目的は、マウスのカルバリア臓器培養のex vivoモデルを用いて、癌骨微小環境における骨再生を評価するツールを有することである。まず、マウスの子犬を選択し、フードの下に置きます。
私たちは、5〜7日齢のマウスの子犬からカルバリアを使用しています。注射器で頭を取り、皮膚を切断し、カルバリアを解剖するのに十分な頭皮領域をクリアします。頭蓋骨、矢状、冠状動脈、およびラムドイドの縫合糸を特定します。
ラムドイド縫合糸に沿ってまっすぐにカットし、目の高さにします。両側に、子羊の縫合糸からコロナ縫合糸に向かって切る。45角度で、もう一つのカットを行い、前のフォントのカットで作られたカットの端を接続します。
正しい組織包入および組織学分析を保証するために、頭蓋骨縫合糸、矢状、前頭、コロナ、ラムドイドを定義することは非常に重要です。細かい先端鉗子で、カルヴァリアを取り外し、ペトリ皿カバーの上に置きます。メスで、冠状縫合糸を通して矢状縫合に沿って後部フォンタネルからまっすぐにカットします。
2つのヘミカルバリアが得られる。鉗子で各カルバリアをピックアップし、PBSと新しいペトリ皿に入れます。培養のために、1ミリリットルの培地を含む24ウェル組織培養プレートにヘミカルバリアを入れ、37度で24時間インキュベートする。
また、原発性カルバリア培養を用い、骨吸収のための腫瘍-骨微小環境を再現することもできます。そのために、カルバリアをがん細胞、またはがん細胞のコンディショ条件付き培地と共培養します。24時間後、メディアを取り出し、テストしたい治療を含む培地に交換してください。
がん細胞と骨の相互作用を評価したい場合、または腫瘍骨微小環境を再現したい場合は、カルバリアを低細胞付着プレートに渡し、癌細胞のプレートへの付着を避けます。がん細胞をトリプシン化し、数え、ヘミカルバリアの上部に慎重に配置します。また、がん細胞の条件付き培地を使用し、それを使用してヘミカルバリアをインキュベートすることもできます。
37度で6~7日間インキュベートし、CO2は5%です。3日目に、メディアを交換し、インキュベートを続けます。共培養で使用する細胞の数は、癌細胞株に依存する。
まず、応答を誘導するために必要な細胞の数を最適化する必要があります。培養後、カルバリアは固定、脱灰、パラフィン埋め込みのプロセスを通過します。また、組織をミクロトームで切り離し、染色し、組織形態測定解析を行う。
カルバリアを含めることは難しい場合があります。包み込み中に組織が保護されていることを確認するには、スポンジの間に組織を置くか、ティッシュペーパーまたは他の吸収性紙を使用してカセットに入れることができます。組織処理の場合は、ヘミカルバリアをティッシュペーパーで包みます。
次に、それを埋め込みカセットに入れ、ホルマリン中の中性バッファーに4度で24時間固定します。カルバリアを脱灰するには、カセットを10%EDTAに4度で48時間置きます。自動組織プロセッサでヘミカルバリアで組織カセットを処理します。
規則的な日の回転サイクルに従い、次いで、パラフィンに含める。断面化のために、マイクロトームで4つのマイクロチックセクションを切断し、ガラス顕微鏡スライドにセクションを取り付け、ヘマトキシリン、エオジンで染色します。組織学分析は、骨表面および骨のリモデリング領域の定量分析を行うために使用された。
7日間のカルバリアの画像をイメージングソフトウェアを用いて分析した。定量的評価の場合は、まず分析の領域を定義します。4つのXがあるテロパのセクションを見て、方向と縫合糸を特定します。
コロナ縫合を定義し、片側の長い骨の表面を特定し、次に他方の短い面を特定します。40倍率の下で、コロナ縫合を特定し、長い表面に沿って縫合線から離れて2つまたは3つの光学フィールドを移動します。解析のためにこの領域の画像をキャプチャします。
イメージ ソフトウェアを使用して、ボーンの構造的な整合性を分析できます。ヘミカルバリアの厚さと骨面積に関する定量的組織形態解析が可能です。正しいカルバリア解析は、一貫した組織学的結果を得るために、良好な埋め込みと適切な方向に依存します。
実験条件ごとに少なくとも3つのカルバリアを使用してください。ここでは、骨の構造を見ることができます。オレンジ色では、骨が観察される。
また、骨膜、オストーサイト、エンドステウム、および骨の別の部分の存在を見ることができます。私たちの場合、骨のリモデリングを増加させるためにインスリンを使用しています。コントロールと比較すると、骨領域の有意な増加を見ることができます。
ここでは、MDA-MB-231細胞株がモデルカルバリアに及ぼす影響を確認できる。コントロールと比較して、がん細胞の存在が骨破壊を刺激する骨分解因子を誘導していることがわかります。カルバリアモデルを用いて、がん細胞や細胞学との共培養による骨再生とがん細胞と骨の相互作用を測定しました。
定量的リアルタイム PCR でデータを検証します。このex vivoモデルは、骨の立体組織や細胞の多様性が保持され、実験条件を制御することができるような多くの利点を有する。また、モデルはシンプルで、短時間で結果を見ることができ、低コストです。
定量的リアルタイム PCR、顕微鏡、マイクロ CT などの他の手法と組み合わせることができます。
