この方法は、DNAメチル化に対する環境要因の影響を評価するためのシーケンシングベースのツールを設計および実装する方法を示すことによって、エピゲノミクス分野の主要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、アレイベースのプラットフォームと比較して、DNAメチル化レベルを評価するためのより包括的で定量的な方法を提供できることです。この技術の意味合いは、配列データが利用可能な生物の生理学的プロセスの異なるタイプによるDNAメチル化変化の同定にまで及ぶ。
この方法は、ストレスがDNAメチル化に及ぼす影響に関する洞察を提供することができますが、高脂肪食や糖尿病や心血管疾患などの条件における環境毒性物質への暴露など、他の環境要因や生理学的条件にも適用できます。DNAを剪断し、生体分析装置を介してサイズを確認した後、各サンプルに180マイクロリットルのDNA結合磁気ビーズを加え、室温で5分間インキュベートします。磁石のプレートにビーズをペレットし、上清を取り除きます。
70%エタノールの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。次に、ビーズをペレット化する磁性板を使用し、できるだけ多くのエタノールを除去する。ビーズを37°Cのヒートブロックで3~5分間乾燥させます。
次いで、44マイクロリットルのヌクレアーゼを含まない水でペレットを再懸濁し、約42マイクロリットルの上清を回収する。アダプターを連結し、バイオアナライザーを介してライゲーションを検証した後、サンプルを低DNA結合マイクロ遠心チューブに移します。次に、加熱真空濃縮器を使用して、サンプルの体積を3.4マイクロリットル以下に減らします。
この後、各サンプルにメチルセクブロックミックスの5.6マイクロリットルを加え、サーマルサイクラーにインキュベートします。テキスト プロトコルに従ってキャプチャ ライブラリのハイブリダイゼーション ミックスを準備します。次に、各サンプルに20マイクロリットルのキャプチャライブラリハイブリダイゼーションミックスを加え、摂氏65度で16時間インキュベートします。
インキュベーション期間の終わりに向かって、新しい8ウェルストリップチューブにサンプルあたり50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを加えることによってストレプトアビジン磁気ビーズを調製します。200マイクロリットルのメチルセク結合バッファーでビーズを洗浄します。ストリップチューブを磁性プレートに置き、ビーズから上澄み地を取り除きます。
その後、メチルセク結合バッファーの 200 マイクロリットルでビーズを再懸濁します。洗浄されたストレプトアビジンビーズにサンプルを加え、回転ミキサーで室温で30分間インキュベートします。サンプルが混合している間、アリコート200マイクロリットルのメチルセクウォッシュバッファ2は、96ウェルプレートの三重の井戸に、摂氏65度に予熱します。
サンプルインキュベート後、磁気ビーズを磁気プレートでペレットにし、上清を除去します。その後、メチルセクウォッシュバッファー1の200マイクロリットルにビーズを再懸濁します。ビーズを室温で15分間インキュベートし、磁気プレートを使用して上清を除去します。
この後、ビーズペレットを200マイクロリットルの事前に温めたウォッシュバッファー2に再懸濁します。次に、ビーズをペレットにする磁気プレートを使用する前に、サーマルサイクラーにビーズをインキュベートします。洗浄されたビーズにメチルセク溶出バッファーの 20 マイクロリットルを加え、室温で 20 分間インキュベートします。
ビーズをペレットにマグネットプレートを使用し、上清を新しいストリップチューブに移します。まず、130マイクロリットルのバイサルファイト変換試薬を、以前に採取した上清に加える。150マイクロリットルの反応を均等に2つの井戸に分けます。
次に、サーマルサイクラー中の反応をインキュベートする。600マイクロリットルの結合バッファーを使用してサンプルをスピンカラムに結合し、100マイクロリットルのウォッシュバッファーでカラムを洗浄します。次に、列を遠心分離し、フロースルーを破棄します。
この後、200マイクロリットルのデサルフォネーションバッファーをカラムに追加します。カラムを室温で15~20分間インキュベートします。200マイクロリットルのウォッシュバッファーで2回コラムを洗います。
次に、10マイクロリットルの溶出バッファーをカラムに加えます。室温でインキュベートし、遠心分離機を使用します。テキストプロトコルに従って PCR 反応マスターミックスを準備します。
次に、各サンプルに82マイクロリットルのマスターミックスを加え、サーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。まず、テキストプロトコルに従って、氷の上にPCRマスターミックス2を準備します。次に、各サンプルに、25.5マイクロリットルのPCRマスターミックス2と5マイクロリットルの市販インデックスプライマーを加え、サンプルをサーマルサイクラーにインキュベートします。
バイオアナライザー上で高感度DNA検出試薬を用いてサンプルのDNA濃度を評価します。次に、メチル・セク・ライブラリーは、次世代シーケンサーのシーケンシングのために提出されます。バイサルファイト変換およびPCR増幅検証サンプルの後、結合バッファー、水、ストレプトアビジンコーティングセファローズビーズとのマスターミックスを調製します。
その後、マスターミックス75マイクロリットルと入れ子になったPCR製品の5マイクロリットルを96ウェルプレートに加え、プレートシェーカーでプレートを15~60分間振ります。プレートが揺れる間、ピロシケンシングアッセイプレートの井戸に12マイクロリットルのプライマーを加えます。振盪後、水で満たされたトラフに真空工具を入れ、そのツールを結合反応でプレートに入れます。
次に、70%エタノール、水酸化ナトリウム、およびトリス酢酸緩衝液を含む半充填トラフに真空工具を沈下します。真空を取り外し、HSピロシケンシングアッセイプレートに真空工具を入れ、ビーズを移送します。熱ブロックの上にプレートを置き、2分間摂氏80度でインキュベートします。
最後に、プレートを5分間冷却してから、パイロプログラムを開始します。このプロトコルでは、メチル-Seqライブラリの分析は、ストレス動物とストレスを受けていない動物とDDRのグラフィカルプロットの間の微分メチル化領域(DDR)のランク付けリストを提供しました。
CpG 10のメチル化レベルも、各動物の平均3週間のCORTレベルと比較した。結果は、内分泌とメチル化データの間に適度な相関関係があることを示している。この手順を試みる間、DNAの剪断とアダプターのライゲーションステップ間の平均DNAサイズの増加を比較し、シーケンシング前に十分なライブラリ量を確保することを忘れないでください。
この手順に従って、環境毒性物質がラット神経発達に及ぼす影響などの新しい質問に答えるために、他の同様のアプローチを実装することができる。その開発後、この技術はエピジェネティクスの分野の研究者がゲノム配列が利用可能な非モデルまたはモデル生物のゲノム全体のDNAメチル化変化を探求する手段を提供した。温度感受性酵素を使用するには、使用中に氷の上に貯蔵し、マイナス20度の冷凍庫に保管する必要があることを忘れないでください。
ターゲットキャプチャに使用されるRNAビーズは、使用中の氷の上で解凍と保存を必要とし、マイナス80度冷凍庫に長期保存する必要があります。
