この方法は、異なる環境変数が細菌に対するバイオアベイラビリティにどのような影響を与えるかなど、カドミウムと水銀の生物地球化学的サイクリングに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、酸素の存在に関係なく、準リアルタイムのバイオアベイラビリティデータと生存細胞を提供することです。一般的に、この方法に新しい個人は、細部に非常に細心の注意を払う必要がある多くの時間に敏感なステップがあるので苦労します。
手順をデモンストレーションするベン、私の研究室の大学院生になります。アッセイの準備のために、水銀誘導性バイオセンサーと構成的に発現したバイオセンサーをマイナス80°Cのクライオストックから取り出します。アンピシリン1ミリリットル当たり120マイクログラムを含むリソゲニースーププレートに細胞をプレートします。
一晩摂氏37度でインキュベーターでプレート培養を成長させます。4:30と5p.mの間にアンピシリンとLBの10ミリリットルの培養物を接種し、220rpmで振ると摂氏37度で一晩成長する。
翌朝、9時から10時.m時に、培養物と以前に調製した成長培地を嫌気室に持ち込む。その後、新鮮な成長培地の8ミリリットルと無菌バルチリンチューブにアンピシリンのミリリットルあたり210マイクログラムを追加します。
今、一晩成長した培養物の2ミリリットルを収集し、2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。10,000 RCFで90秒間遠心分離した後、上清を取り除き、新鮮な成長培地の2ミリリットルで再懸濁します。次に、新鮮な成長培地とアンピシリンの8ミリリットルを含むバルチチューブに再懸濁培養液を加えます。
滅菌技術を使用して、気性チャンバーから取り外す前に、慎重にバルチチューブにゴム栓を置きます。その後、チューブをインキュベーターに入れ、220rpmで振ると摂氏37度で嫌気性で成長します。3と5 p.mの間。
培養液、新しい滅菌バルチチューブ、および成長培地と共に、バルチチューブを嫌気室に持ち込みます。滅菌バルチチューブにアンピシリンを用いた新鮮な成長培地10ミリリットルに培養液100マイクロリットルを加える。滅菌技術を使用して、慎重にバルチ管の上にゴム栓を置きます。
嫌気性チャンバーからチューブを取り出してから、摂氏37度で一晩成長し、220rpmで揺れます。翌日の9時から10時.mの間で、培養液と成長培地を嫌気室に戻す。
再び滅菌バルチチューブに成長培地とアンピシリンの8ミリリットルを追加します。一晩成長した培養物の2ミリリットルを2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。前のように遠心分離に続いて、上清を取り除き、新鮮な成長培地の2ミリリットルで細胞を再懸濁する。
次に、新鮮な成長培地とアンピシリンを含むバルチチューブに再懸濁培養液を加える。滅菌技術を使用して、慎重にバルチ管の上にゴム栓を置きます。チャンバーから取り出し、220rpmで揺れで摂氏37度で嫌気性成長をします。
分光光度計を使用して培養物の成長を監視し、その後600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定します。3~4時間の予想成長の後、培養は6のOD600に達するはずです。今嫌気室にチューブを持って来て、2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に培養を移します。
前のように遠心分離に続いて上清を除去し、新鮮な暴露媒体の2ミリリットルで各細胞の口蓋を再懸濁する。この洗浄工程を一度繰り返して、成長培地の痕跡を除去する。次に、細胞培養の両方のマイクロ遠心チューブを7ミリリットルPTFE標準バイアルに組み合わせて、露出アッセイに使用するためのバイオセンサーストックを取得します。
実験を開始する前に、嫌気性モニターをチェックして、嫌気性チャンバーに酸素がないことを確認してください。96ウェルテンプレートに従ってプレートレイアウトを設計します。3つの技術的な複製で実験を実行するには、バイアルを設定するために4で8グリッドで最もよく表される32の異なる治療を可能にします。
アッセイプレートレイアウトに従って、4つ8グリッドを設定します。その後、トレイに7ミリリットルPTFE標準バイアルを入れ。バイアルは、バイアルの外側を操作することによってのみ処理する必要があります。
各治療に対応する各バイアルに露光媒体のボリュームを追加します。各バイアルにプレートのレイアウトに従ってテストされる化学変数の対応する容積を加える。今、濃度が200マイクロモルになるように、各バイアルに硝酸塩を追加します。
構成バイオセンサー治療ブランクの場合は、このステップを除外してください。バイアルに水銀を加えるために、最初に4〜8マイクロモルストックを取り、よく振ります。溶液と露光媒体を7ミリリットルのPTFEバイアルで100~250ナノモルの濃度に希釈し、水銀溶液を働かせる。
この作業ソリューションから、プレートレイアウトに従って必要なバイアルに水銀を追加します。水銀またはカドミウムを添加した後、手動で軌道運動でプレートを振る。水銀またはカドミウムが溶液中で分化するのに必要な時間に応じて、実験は今一時停止することができます。
実験が再開されたら、ピペットバイオセンサーストックを前後に静かに入れ、均質性を確保します。その後、各バイアルにバイオセンサーストックの100マイクロリットルを追加し、手動でプレートを振ります。プレートリーダーを摂氏37度に温め、2ポイント5〜5分ごとに読み取りで10時間の運動走行を設定します。
読み取り値の間の軌道の揺れ。440ナノメートルの蛍光励起と500ナノメートルの放出で蛍光測定を取るために実行を設定します。今ピペット200マイクロリットルは、4つ、8グリッドの各PTFEバイアルから96ウェルプレートの対応する井戸に入ります。
ピペットは、各200マイクロリットルを移す前に5回前後に行き来する。ピペットチップを捨てる代わりに、ピペットチップをPTFEバイアルに残してピペットの進行状況を追跡します。96ウェルプレートをプレートリーダーのトレイに入れ、
その後、96ウェルプレートに蓋を置き、アッセイを開始します。ここでは、補正された蛍光データを時間の関数として示す代表的な結果を示す。蛍光は、誘導可能なバイオセンサーへの水銀濃度の増加とともに示される。
すべての値は、水銀コントロールなしに空白です。蛍光ピークは、水銀またはカドミウム濃度の関数として蛍光シグナルを示すために定量することができる。誘導性と構成バイオセンサーの両方に対して、リンベクレンジの水銀またはカドミウム濃度を使用して、変数をテストする必要があります。
亜鉛の結果が決定的でない例を次に示します。そして、バイオセンサーへの水銀バイオアベイラビリティにマグネシウムおよびマンガンとの決定的な結果.亜鉛を用いた結果は、毒性を示す誘導蛍光で構成蛍光が減衰するため決定的ではない。
この手順を試みる間、これらはバイオセンサーの較正に使用されるようにカドミウムまたは水銀のいずれかの濃度を入力することを忘れないでください。この手順に従って、水系の熱力学的モデリングのような他の方法は、水銀またはカドミウムの特定の化学種がそれらの生物学的利用能にどのように影響するかなどの追加の質問に答えるために行うことができる。カドミウムや水銀、硫酸などの強酸を使用することは非常に危険であり、個人的な保護具の着用などの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
その開発の後、この技術は、環境微生物学の分野の研究者が準リアルタイム嫌気性水銀またはカドミウムバイオアベイラビリティと遺伝的に難解な微生物を探求する道を開いた。
