この方法は膵島系統分化、成熟、および再生に関する膵島の分野での答えの主要な質問を持つことができます。この技術の主な利点は、高品質の単一細胞RNAシーケンシングデータの生成のための単一膵島細胞の収集を可能にすることです。この技術の応用は、病的状態における膵内分泌単細胞のトランスクリプト分析を通じて糖尿病および他の膵内分泌関連疾患の治療に向けて広がる。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、灌流のために膵臓の狭い胆管に針を挿入するのが難しい可能性があるため、非常に重要です。胚の日17.5胚のために。腹腔を開いた後、肘ピンセットを使用して、冷たいPBSを含む6センチメートルの黒底皿に内臓組織を移します。
鉗子を使用して内臓組織から膵臓を取り外します。そして、5ミリリットルの冷たいコラゲナーゼ溶液を含む20ミリリットルバイアルに膵臓組織を入れる。出生後ゼロから15匹のマウスの場合、組織をコラゲナーゼに入れる前に膵臓のすべてのローブを慎重に解剖する。
出生後18日目から60日目のマウスの場合、まずxiphoidを取り除き、腹腔の右側に腸を抽出する。肝臓の左右の内側葉を両側に押し込み、胆嚢と共通の胆管を露出させる。そして、胆管が十二指腸に入る場所を横取りするために、上下の位置に小さな容器クランプのペアで十二指腸をクランプします。
次に、冷えたコラゲナーゼ溶液を用いた30ゲージ針を装備した5ミリリットルのシリンジをロードする。そして、針の先端を胆嚢に挿入するために顕微鏡を使用してください。慎重かつスムーズに共通の胆管を通して針を操作します。
そして、プランジャーを押し落とし、マウスの大きさに応じて1〜5ミリリットルのコラゲナーゼ溶液で膵臓を浸透させる。すべての溶液が浸透したら、鉗子を使用して、新鮮な冷たいコラゲナーゼ溶液を5ミリリットル含む20ミリリットルバイアルに膵臓をすぐに移します。すべての膵臓組織が採取されたら、バイアルを摂氏37度の水浴に3分間置き、続いて3〜5分間穏やかな揺れを行います。
その後、0.25ミリメートルのナイロンストレーナーを通して消化された製品を新しい50ミリリットル遠心管にフィルターします。そして、ストレーナーを徹底的に洗浄するために氷冷PBSを含む20ミリリットルの注射器を使用してください。出生後18日目から60日目の膵臓では、濾過サンプルを遠心分離し、30ミリリットルの冷たいPBSで組織を再中断する。
その後、組織懸濁液を6センチメートルの黒底皿にデカントし、200マイクロリットルピペットと解剖顕微鏡を使用して、少量の冷たいPBSを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移す小島を選びます。胚性17.5日目の出生後15日目膵臓の場合、濾過された膵臓組織を遠心分離し、トリプシン-EDTA溶液中のペレットを摂氏37度の水浴で4分間インキュベーションに再懸濁する。インキュベーションの最後に、ペレットを200マイクロリットルピペットで1分間穏やかに評価し、続いて冷たい牛血清の0.5倍の量を加えて穏やかな渦を加えて消化を止めます。
次いで、遠心分離によって消化を収集し、フローサイトメトリーによる選別のための5ミリリットルFACSチューブ内のFACSバッファーの200マイクロリットルの細胞を再懸濁します。単一細胞の摘み取りおよびリシスの場合、アリコートで作りたての細胞ライシスバッファーを8つのストリップPCRチューブに、それぞれに単一の細胞を移す。RNAの放出のために細胞をライスするためにサンプルを渦、摂氏4度で30秒間遠心分離し、氷の上に即時貯蔵する。
逆転写の場合は、ライセートを摂氏72度で3分間インキュベートし、氷の上で1分間インキュベートします。サンプルを摂氏4度で30秒間短遠分化し、各サンプルに5.7マイクロリットルの逆転写ミックスを加え、各サンプルの総体積を10マイクロリットルにします。穏やかな渦と遠心分離の後、サーモサイクラーにサンプルをロードし、逆転写プログラムを開始します。
ポリメラーゼ連鎖反応のプリアンプ化、またはPCRの場合は、最初のストランド反応を含む各サンプルに15マイクロリットルのPCRミックスを加え、続いて穏やかな渦および遠心分離を行います。次に、サンプルをサーモサイクラーにロードし、PCR プログラムを開始します。PCR精製の場合、各サンプルに25マイクロリットルの再懸濁DNA精製ビーズを加え、ボルテックスで十分に混合します。
その後、迅速にビーズの決済を避けながら、液体を収集するために室温でサンプルを回転させます。室温で5分後、サンプルを適切な磁気スタンドに置き、溶液が透明になったら上清を慎重に取り除いて捨てます。200マイクロリットルで2回の30秒の洗浄でビーズを洗浄し、1回の洗浄で80%エタノールを調製します。
そして、2回目の洗浄後に残りのエタノールを捨てる。ビーズが空気乾燥したら、11マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えてビーズからDNA標的を溶出させ、続いて渦を起たします。次に、サンプルを素早く遠心分離し、溶液が透明になるまでサンプルを磁気スタンドに戻し、各サンプルの10マイクロリットルを新しいPCRチューブに移します。
正常に増幅されたcDNAは、500塩基対を超える全長を有し、1.5から2キロの塩基対に濃縮される必要があります。また、通常、インスリン1個のRFPプラス細胞において観察されるcDNAの500〜600塩基対濃縮があり、これはインスリン転写産物を表わしてもよい。しかし、100塩基対付近のcDNA断片はプライマーダイマーであり、通常は過剰なプライマーによって引き起こされ、DNA精製ステップを繰り返すことによって除去されなければならない。
100から500塩基対の間のcDNA断片は、通常、劣化したcDNAを表し、これは悪い細胞の状態または領域の問題(RNase汚染など)によって引き起こされ、除外する必要があります。シーケンシング用のcDNAライブラリの精製後、250~450塩基対のcDNAは、DNA精製ビーズを第1および第2の精製に添加することによって得ることができる。DNA Bead の精製後、シーケンシング品質スコアは、シーケンシング品質評価時に 30 を超える必要があります。
下流分析のために高品質の細胞を得るために、マッピングされた読み取りが0.50万未満、または検出された遺伝子が4,000未満の細胞が除外され、異なるグループの細胞の特徴付けと、主成分分析および階層クラスタリングの後に異なるグループで異種化される遺伝子の同定が容易になる。この手順を試みる間、コラゲナーゼ消化の前に膵臓を素早く浸透させて消化の上の島を避け、単一細胞の処置中にRNaseの自由な環境を維持することを忘れておいてください。この手順に従って、アイレットイメージングや培養などの他の方法は、そのアイレット構造の可視化を容易にし、細胞応答および薬物刺激を調べるために行うことができる。
開発後、膵臓研究の研究者が膵島の系統の発達と再生のメカニズム、ならびに哺乳類の糖尿病の進行を探求する道を開いた。
