Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
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著者は、その優秀な技術支援のジュディス Lengyel、マリア カルク、グルゴワール Friz、レイチェル ハアブとロシュからマリー クレア Pflimlin、Tifany Schaer と HiQScreen からデボラ Paolucci をありがとうございます。

アフリカツメガエルは建物、ジュネーブのカントン動物ガイドラインに従って処理されます。
1. 放射性リガンド結合
<ol><li>
アッセイ プレートの準備
	<ol>
<li>5 mM KCl、1.25 mM CaCl21.25 mM MgCl2, 120 mM, NaCl と 15 mM; トリス アッセイバッファーの 1.5 L を準備します。7.4 に塩酸で pH を調整します。</li>
		<li>(例えば、5 μ L の微量遠心チューブで 980 μ L アッセイバッファーに 10 ミリメートルで化合物) 50.76 μ M でテストする化合物を準備します。まあ 2-5 s の高速で渦マシンを使用してそれらをミックスします。</li>
		<li>アッセイバッファー 1,970 μ に化合物 (10 mM) の 1 μ L 分注参照化合物フルマゼニルの前希釈を準備します。まあ 2-5 s の高速で渦マシンを使用してそれらをミックスします。</li>
		<li>4 に 4 ° c アッセイバッファーで [3H] フルマゼニル原液を希釈 50 mL ポリプロピレン チューブに nM。</li>
		<li>ピペット 50 μ L/ウェル アッセイバッファー列 1 と 3-11 96 ウェル マイクロ プレートの図 2で表されるプレート レイアウトのように。</li>
		<li>50.76 μ M で希釈した化合物の 73.2 μ L をピペット (手順 1.1.2 参照) プレートの 12 列に。</li>
		<li>9 ステップの上の幾何学的な進行を使用してそれぞれの化合物を希釈 (1E-10 -1E-06 M), 23.12 μ L のデータ転送量と塗りつぶし列 3-11。希釈を徹底的にミックスします。すべて希釈後、ヒントを変更します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞膜を希釈します。
	<ol>
<li>以前 HEK293 過剰人間 GABAの受容から分離された細胞膜を融解 (0.025-0.15 mg/mL) 常温 (RT) 80 mL を取得して懸濁液を 4 ° C でアッセイバッファーに移転</li>
		<li>10,000-12,000 rpm で 30-40 s の組織ホモジナイザーを用いた膜液を 4 ° C でまだ再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
非特異的結合 (NSB) コントロールの希薄ジアゼパム
	<ol>
<li>5 mL で 40 μ M の濃度にアッセイバッファーで 4 mM ジアゼパム原液を希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
反応を開始します。
	<ol>
<li>96 ウェル プレートの各ウェルに 4 nM [3H] フルマゼニルの 50 μ L をピペットし、氷の水容器で保ちます。</li>
		<li>0.5 mg/mL のタンパク質濃度を持っている GABAAの受容体サブタイプ膜準備の 100 μ L を追加します。</li>
		<li>2 列に 40 μ M のジアゼパムの 50 μ L をピペットします。</li>
		<li>氷の上に 1 時間プレートを孵化させなさい。</li>
		<li>後膜分離と放射能測定のための 96 ウェル フィルター プレートの各ウェルにアッセイバッファーの 50 μ L を追加し、その後の反応を停止します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
反応を停止します。
	<ol>
<li>50 mM トリス-HCl、pH 7.4 に洗浄バッファーを準備します。</li>
		<li>96 ウェルの細胞収穫を使用して、ソリューションをフィルター処理します。3、洗浄 300 μ L/ウェル冷たい洗浄液の x。</li>
		<li>プラスチック フィルムとプレートの底をシールし、シンチレーション液体のカクテルの 40 μ L を追加各シンチレーションも、70% エタノールで拭いてください。</li>
		<li>室温 1 時間少なくともプレートを軽く振る少なくとも別の時間室温放置します。</li>
		<li>シンチレーション カウンターに皿を置くことによって (CPM) の放射能を測定します。ウェルあたり 3 分の測定を許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
データ分析
	<ol>
<li>8 の意味を非特異的結合 (NSB) と合計のバインド (TB) も重複またはサンプルのトリプリケートのレプリケートを確認します。次の式に従って各サンプルの平均 % 特定のバインド (SB) を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> ここは 合計 SB NSB を意味マイナス平均 TB を =。</li>
		<li>横座標 %sb対座標での阻害剤の濃度をプロットします。単一サイトの競争分析数式を使用してデータをフィットします。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> ここは y = sb、% A = yの最小値 B = yの最大値 C = IC50、 X = 競合する化合物の濃度のログ10 D = (ヒル係数) 曲線の傾き。</li>
		<li>半最大阻害濃度 (IC50) を使用して結合親和性 (Ki) を計算 [3H] の濃度とそれぞれの膜9の [3H] フルマゼニルの解離定数 (Kd)次のデータを使用して同等化に従ってアッセイのフルマゼニル: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 受容体の発現とアフリカツメガエル卵母細胞での録音
<ol><li>収穫の卵巣と卵の準備
	<ol>
<li>88 mM の NaCl、KCl 1 mM、2.4 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.82 mM MgSO4.7H2O、0.33 mM Ca (3)2.4H2O、0.41 mM CaCl2.6H2O、pH 7.4 でと滅菌バルト ソリューションを準備します。、0.25 μ g/mL アムホテリシン b の 100 μ g/mL ストレプトマイシン、ペニシリンの 100 単位/ml を添加しました。</li>
		<li>88.5 mM NaCl、KCl 2.5 mM、5 mM HEPES、1 ミリメートル MgCl2.6H2O、pH 7.4 で x OR2 1 (CaCl2) 培地を準備します。</li>
		<li>アフリカツメガエルの冷却 (pH 7.4 に調整 150 mg/L の濃度) でトリカインメタネスルフォネイトと炭酸水素ナトリウム (300 mg/L) で 20 分間の深麻酔によって女性に続いて斬首の犠牲。</li>
		<li>きれいなハサミ、鉗子で急激に卵巣を収穫し、40 ml バルト ソリューションと抗生物質/抗真菌薬 x 1 の 2 ペトリ皿 (10 cm) でそれらを置きます。</li>
		<li>4 ° C でバルト ソリューション内に最大 2 週間の非解離卵巣を格納します。</li>
		<li>解離、小さな分数 (1-2 cm3) できれいなかみそりの刃で卵巣をカットし、CaCl2 (OR2 noCaCl2) なし OR2 媒体の 50 mL で 0.2% コラゲナーゼを含んでいるそれらを孵化させなさい (I 型) 100 mL スピナーで 17-19 ° c4-5 磁気棒は確認のため低速撹拌フラスコでは、卵母細胞を粉砕避けるためにスピナー フラスコの下に上記の約 3-5 cm に配置されます。</li>
		<li>4-5 時間後、卵胞から卵母細胞のほとんどが開放されていることを確認 (すなわちのまわりで泳ぐ個別に)。洗って OR2 1.8 mm CaCl2補足の 200 mL の 5 倍。</li>
		<li>ペトリ皿 (10 cm) に卵いっぱいバルト ソリューションと抗生物質/抗と cDNA または mRNA の注入前に 17 ° C で一晩、少なくともそれらを維持 defolliculated を転送します。</li>
		<li>次の日は、双眼鏡、健康卵植物極 (植物極の淡黄色対動物極の暗いブラウン)、はっきりと明確な動物対提示することで、選択。きれいなパスツール ピペットを使用し、滅菌円錐形 96 インジェクションのウェル プレートに 1 つずつ卵を処分します。 注: 特別なケアは必要ありません; mRNA 注射用の卵子の配置の一方、cDNA 注射用じゃはない上向き動物極と卵母細胞の向きに必要不可欠であります。</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA または cDNA の自動注入
	<ol>
<li>次の推奨手順市販のキットを使用して Mrna を合成します。楽器と RNase とテーブルをきれいにし、適切な保護手袋を着用します。 注: mRNA の品質は良い式をもたらすための決定要因と射出中の mRNA 分解を防ぐために不可欠です。</li>
		<li>市販のキットを使用して Cdna を準備し、0.2 μ g/μ L の濃度で bidistilled 水に希望の金額を解散します。</li>
		<li>CDNA 液 0.02-0.2 に至る濃度での 0.2 μ g/μ L、または 10 nL の濃度で mRNA ソリューションの 10-50 nL を注入できれば 95 卵母細胞のバッチで、μ g/μ L。</li>
		<li>膜蛋白質 (すなわち、テキサスサンゴヘビ α1β2γ2 GABAAの受容器)、複数のサブユニットが必要なミックス対応する Mrna または任意の比率で Cdna (すなわち1:1:1 または 1時 10分: 1)。</li>
		<li>卵母細胞の熱ショック蛋白質の発現を防ぐために 17 ° C で卵母細胞を保つマイクロ プレートを熱制御ストレージ領域に格納します。</li>
		<li>0.1-1000 で OR2 の結合の試金に陽性を示した試験化合物を溶かす電気生理学的記録の μ M 96 ウェル平底ポリプロピレン板にそれらを処分し、。</li>
	</ol></li>
	<li>式のプラスミド
	<ol>
<li>細菌の T7 または T6 の休眠打破による mRNA 合成のための市販キットの取扱説明書に従ってください、ソリューションの 20 μ L で 0.2 μ g/μ L RNase 自由な水にします。</li>
		<li>通常は 0.2 μ g/μ L bidistilled 水に溶解し、cDNA 表現の真核生物発現ベクターを含むソリューションの少なくとも 20 μ L を準備します。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロインジェクション卵子とその品質の可視化
	<ol>
<li>10-50 nL プラスミド溶液を注入 (2.3.1 又は 2.3.2 手順参照) 圧力放出システムまたは自動注入システム設置しておりますマイクロマニピュレーターにマウントされているガラス マイクロ注射針を用いた先端径最大 100 μ m に至るまで。 注: ここで説明した例では、卵母細胞は自動システムにより cDNA または mRNA の使用に適した 95 のバッチによって挿入されます。</li>
		<li>1% メチレン ブルーなどの色素の 1 μ L で注射針を入力し、(または cDNA の核または mRNA の細胞質で) 標準的な手順を使用して卵を注入します。</li>
		<li>沸騰したお湯で約 1 分の注入された卵を破棄します。卵母細胞を双眼鏡でかみそりの刃で半分にカットします。 注: 染料の図 3E射出の正確な観察のようにローカライズされたまま。</li>
	</ol></li>
	<li>2 電極電圧クランプ録音
	<ol>
<li>図 4に示す原則を使用して自動システムで卵母細胞を含むウェル プレートを配置します。 注:図5 パッチ クランプ システムと対照をなして、セルの真の膜電位は、電圧電極によって読み取られます。</li>
		<li>集中活動関係の決定のための図 6に示す方式などでアイコン ベースのインターフェイスを使用して自動録音システムをプログラムします。</li>
	</ol></li>
	<li>曲線のあてはめ
	<ol>
<li>図解濃度活性化曲線を使用して、適切なソフトウェアを使用して結果を分析、現在の振幅をアゴニスト濃度の対数の関数としてプロットします。</li>
		<li>形で経験的なヒルの式とその後に合うことができる s 字型のカーブを観察します。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> ここは Y= 誘発電流の割合 EC50 = 50% の活性化のため濃度 x = 化合物の濃度 nH = ヒル係数または明白な協同性。</li>
		<li>各応答に対する一連のセルから得られたデータを分析する最も高い濃度で記録された値の振幅を割って統一へ電流を正常化します。</li>
		<li>平均と標準誤差を決定し、標準利用可能なソフトウェアを使用してカーブ フィットを実現します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 脳スライスの記録
注: ラット海馬スライスは、国および教育機関の指針に則って準備されました。
<ol><li>
海馬スライスの準備
	<ol>
<li>124 mM NaCl 124、2.5 mM KCl、1.25 mM KH2PO4O2MgSO4.7H 2 mM、2.5 mM CaCl2 2 H2O、26 mM NaHCO3、10 mM グルコース 4 mM と郭清人工脳脊髄液 (dACSF) を準備します。庶糖 95% O2と 5% CO2の混合物をボトルに毒ガスします。</li>
		<li>124 mM の NaCl、5 mM KCl、1.25 mM KH2PO4O2MgSO4.7H 2 mM、2.5 mM CaCl2 2 H2O、25 mM NaHCO3、10 mM グルコースと記録人工脳脊髄液 (rACSF) を準備します。95% O2と 5% CO2の混合物をボトルで毒ガスで死亡。</li>
		<li>2.5% イソフルランと純酸素の混合物を用いたラットを麻酔し、それらの首をはねます。</li>
		<li>はさみの罰金ペアで正中線に続く頭皮をカットします。基になる組織を損傷することがなく正中線に沿って頭蓋骨をカットします。ピンセットで頭蓋骨を外し脳をえぐり細かいヘラを使用します。</li>
		<li>脳が RT で包まれた dACSF ソリューション、そして高級ヘラで左の海馬を解剖します。</li>
		<li>組織チョッパーと海馬の中の部分から横スライス (400 μ m 厚) をカットし、ペイント ブラシを使って記録室に転送します。45 分の RT でスライスを保持します。</li>
		<li>35 ° C で包まれた rACSF とスライスを灌流し、1.5 mL/分の速度でバブル 95% O2と 5% CO2の混合物ソリューション。 注: この手順の後、スライス、電気生理学的実験のための準備ができています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
単一の母集団のスパイクの記録
	<ol>
<li>顕微鏡に取り付けられた室に脳のスライスを配置します。</li>
		<li>RACSF 3 mL/分の割合でスライスを灌流します。</li>
		<li>〜 2 MΩ の抵抗を持つピペット引き手とホウケイ酸ガラス ピペットを引き出します。 注: このマイクロ ピペットは記録電極として使用され、電気アンプに接続されています。</li>
		<li>2 M の NaCl を含む溶液をマイクロ ピペットを埋めるし、アンプのピペット ホルダーに入れます。</li>
		<li>右マニピュレーターを使用して海馬の ca1 における地層属三角骨に記録マイクロ ピペットを配置します。 注: 場所は図 7で潰した。</li>
		<li>左のマイクロマニピュレーターのホルダーに絶縁バイポーラ プラチナ/イリジウム電極を配置します。 注: この電極は刺激電極として使用され、電気的刺激発生器に接続されています。</li>
		<li>右のマニピュレーターを用いた海馬スライスの ca1 でシャファー担保に刺激電極を配置します。 注: 場所は図 7で潰した。</li>
		<li>すべて 30 刺激発生器を用いた刺激電極に電流パルスを配信 s (100 μ 秒の期間、10 μ A で始まる) 人口の急増 (PS) が表示されるまで徐々 に刺激強度を増加。</li>
		<li>45% 得ることができる最大の振幅に対応する PS を喚起する刺激の強さを調整します。PSs は 2.4 KHz でフィルターされ、信号増幅器を用いた 20 KHz でデジタル化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ペアパルス抑制
	<ol>
<li>脳スライス (ステップ 3.1) を準備し、前述のように進む (ステップ 3.2.1–3.2.7)。</li>
		<li>すべて 30 刺激電極に 2 つの電流パルス (20 ms 間隔で 100 μ 秒の期間) を配信 s 刺激発生器を使用して。最大振幅の 45% に対応する PS を喚起する刺激強度を設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
化合物のテスト
	<ol>
<li>熟れたアプライドでテストされる化合物の希釈液を作るので、最終濃度 DMSO 0.1% より高くないです。</li>
		<li>複合ソリューションよりも同じ濃度で制御ソリューションに DMSO を追加します。</li>
		<li>シングル (ステップ 3.2) を記録またはすべて 30 シャファー担保刺激により誘発される対パルス (ステップ 3.3) PS、少なくとも 30 分のための s。PS 形は、この基準期間中に安定する必要があります。</li>
		<li>酔った rACSF 固定テストする化合物濃度とビーカーを準備します。</li>
		<li>シングルまたはペア パルス PS を記録しながらこのソリューションで海馬スライスを灌流します。</li>
		<li>酔った rACSF 化合物なしでスライスを灌によって化合物の影響からの回復を評価します。 注: リバーシブルの効果のため、PS は複合アプリケーションの前に基準期間中に観察された初期形に戻ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
データ分析
	<ol>
<li>平均 PS トレース データ解析ソフトウェアを使用して 4 ブロックで実験中に記録されます。</li>
		<li>平均のトレースの PS 変換波の振幅を測定します。</li>
		<li>化合物を灌前に 10 分を記録された基準計画の値の割合として振幅を正規化します。</li>
		<li>± SEM. を意味データを表現します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

著者フレデリック ・ Knoflach、マリア ・ Clemencia ・ ヘルナンデス F. ホフマン ・ ラ ・ ロシュ AG、4070 バーゼル、スイス連邦共和国、製薬会社の従業員であります。著者ダニエル ベルトランは HiQScreen Sàrl 6、rte の従業員・ デ ・ Compois、1222 Vésenaz ジュネーブ、スイス、検診施設を製薬会社に提供すること。

GABAAの受容体などのリガンド依存性イオン チャネルでアクティブな新規化合物の開発には、複数のアプローチが必要です。通常、最初のステップはしばしば用いて結合の試金;しかし、そのような測定は、化合物またはその正確な薬理学の生理活性の特性を十分ではありません。特に、受容体に結合する化合物が強化またはその機能を阻害するまたはも効果がない機能 (静かになる) (すなわち、その機能を変更することがなく受容体にバインド)。したがって、機能テストは、フル コンパウンドの特性評価のため必要です。
結合アッセイを: 結合の試金の主な利点は数千までのサンプル数が多いに効率的に行うことができる、アクティブな分子の結合親和性を提供すること。ここに記載されている、必要な受容体サブタイプの評価手法を確立する最初のステップで構成されます。すなわち、分数または全体の脳からネイティブ受容体の結合を行うことができる、そのようなメソッドが特定の受容体サブタイプで親和性の定量を防ぐ。したがって、目的のターゲットに画面分子組換えシステムを使用する必要は。今日では、一時的または安定したトランスフェクション細胞に必要な受容体サブユニット Cdna の目的 (例えばGABAA α5β3γ2) の受容体サブタイプを表現する効率的かつ信頼性の高い方法を提供しています。伝統的な結合の試金作るイメージングに関する基礎的、しかし最近の技術を使用可能であり、処理 (例えば、定量的蛍光ベースのリガンド) 放射能の不便を避けるため。
ホスト システムの機能発現は: ホスト システムの遺伝子を表現するため十分な休眠打破を含むプラスミドに興味のコーディング シーケンスを挿入する必要があります。通常、mRNA 合成培養で細菌の T7 または T6 休眠打破が使用されます。CDNA 表現の興味の遺伝子の転写は、CMV (サイトメガロ ウイルス) などと同じ真核生物プロモーターによって調整されなければなりません。今日 2 つの休眠打破 (すなわちpUNIV、pCMV 6AC、psf CMV/T7、pCI ネオ、pcDNA) を含むいくつかのプラスミド mRNA の体外で合成または cDNA 式図 15に示すように、利用できるようにしています。細胞やアフリカツメガエル卵母細胞における GABAAの受容器の表現が忠実に得られます。後者の主な利点は、内因性受容体式、操作のシンプルさとマイクロ注射と録音のための自動化されたシステムの可用性の欠如です。このプロトコルで説明する手順は、約 7 分で 96 卵母細胞の注入が可能し、顕微操作スキルを必要としない自動システムの効率を示しています。アフリカツメガエルから単一の子房が 10,000-30,000 卵母細胞間含まれていることを思い出し、単一の準備の多数のセル測定を行うことができるは明らかです。また、cDNA の注射を使用して、式を行うことができる、バインドの実験用に開発された興味の遺伝子を含んでいる同じプラスミッド使用できますさらに分子生物学を必要とせず機能解析のため操作。
その大きさと高い表面表現を与え、単一卵子は約 35 mm ペトリ皿の合流のセルに相当する受容体の数を得られます。ただし、卵母細胞の準備と注入は、実験は、特定の文化媒体と無菌操作を必要としない、細胞ラインのコストのほんの一部を表します。単一の GABAAチャネルの活性化をもたらす数 picoamperes (10-12) と最大数万アンペア (10-6) に至るまでの流れが簡単の数百万の併用の活動を確認する 1 つの卵子に記録されます。1 つの応答の中に受容体。
リガンド依存性イオン チャネルの特性の最初のステップは、受容器の見かけの親和性の決定である頻繁。実施する必要がある実験は、一連の簡単なアゴニスト テスト パルスを適用して、振幅、誘発の現在や、場合によっては、アゴニスト濃度の対数の関数として (AUC) 曲線の下の領域をプロットで構成されます。異なるプラスミド濃度と卵母細胞の同じバッチの比 microinject を簡単に実現可能な式のこのシステムはそのような特性に特に適した。さらに、バッチ間の比較は別の EC50s の安定性を高度を明らかにしました。受容体の見かけの親和性サブユニット組成の影響は、図 10に例示としてスパイダー プロットを使用して容易に視覚化します。
アフリカツメガエル卵母細胞で得られた 2 電極電圧クランプの結果はしばしばパッチ クランプ電極を使用した録音と比較されます。一方、それは、これらの 2 つのシステム間の詳細な比較に行くにこの仕事の範囲を超えて行くだろう、いくつかのポイントを調べることができます。細胞パッチク医薬品迅速アプリケーション生物物理特性のための利点を提供しています、その要件、アフリカツメガエル卵母細胞に 2 つ電極の録音のものよりも複雑です。最初と無視できない難易度安定のトランスフェクションや一時的な細胞培養の必要性と目的の構造を表現しているセルの識別特定の蛋白質の表現であります。さらに、考えられる細胞の内因性表現の貢献の可能性を調べるため欠かせません。また、パッチク ランプはその人も、シールの質を評価するのに実験中に十分な分析を実行する必要がある高倍率顕微鏡下におけるマイクロマニピュレーションを実施する熟練者を必要とします。アクセス抵抗など対照的に、2 電極電圧クランプ記録、特に 1 つの自動化された電気生理学的システムを使用して任意の特定のスキルを必要としないし、検査技師が行うことができます。
、電気生理学的設定を取得する際、コスト意識は確かに慎重に分析する必要がある重要な要素です。たとえば、自動化されたシステムのコストは比較的高いが、詳しく比較を明らかに完全な電気生理学的リグのインストールは良いマイクロマニピュレーター、両眼のレンズ、アンプ、血流などの機器を購入、システムともデータの取得と分析を実行しながら、防振テーブル。2 電極電圧クランプ セットアップ対パッチ クランプ セットアップのコスト比較では、さらに矛盾を明らかにします。また、自動化されたシステムは完全に自動化された装置の利点を提供しています、昼と夜無人実行されます。
化合物の薬理学的特性は、受容体の処置のモードによって決まります。たとえば、競争の抑制剤はアゴニスト自体が競争を原因として同じ結合ポケット、または orthosteric サイトが入力できる分子であります。非競争の抑制剤は、入力でき、たとえばイオンの毛穴をブロック別サイトと、リガンド依存性イオン チャネルの場合の相互作用によって受容体を阻害する化合物です。それは、相互作用のさまざまなメカニズムを調べるためこの作業の範囲を超えて行くだろうが、薬理の教科書または Bertrand とベルトランの22など他の作業からさらに情報を入手できます。
アロステリック変調器の場合は、化合物の結合分子の存在は orthosteric サイトとは異なるサイトではアクティブなその他の状態の間のエネルギー障壁を変更します。正のアロステリック変調 (Pam) は、アクティブ状態に休んでからエネルギー障壁を軽減する化合物であるし、したがって、アゴニストの効果を高めます。PAM の影響を評価するには、必要がある、したがって、化合物への露出を高めるアゴニストへの応答、および、どの濃度で、それを判別図 11 図 14に示した実験は、GABAAの受容器の PAMs の特性が正しく使用できるプロトコルを示しています。
場合によっては、単独での PAM への露出受容器をアクティブにするための十分な可能性があります。このような活動は、ここで提示された実験的プロトコルのわずかな変更によって決定できます。すなわち、GABA に露光中に変調器の共同アプリケーションを使用する代わりにプロトコル変更できます最初のアプリケーションのだけと、GABA 存在下での化合物。化合物自体によって誘発し、GABA 誘発電流と比較して応答の振幅の測定による直接アゴニスト活性の評価になります。
図 7に示すよう脳切片での実験は、動物モデルや臨床試験に向けての経路に沿ってさらに行く前に明確な抑制性回路でネイティブの受容器の複合アクティビティを確認する使用されます。比較的単純なデータの記録と解析プロトコルは、PS 振幅差動変調効果を評価することによって複数の化合物のランキングをできます。GABA のシステムに関連していない化合物の非特異的効果は検出された (例えばPS 形の変化が観察されるとき) もあります。直接、Gaba 神経伝達によって評価されるこれらのケースで全細胞パッチ クランプ技術8を使用して抑制性シナプス電流 (Ips) の化合物の効果を測定します。

ここでは、生理学や薬理学へのバインドから GABAAの受容器のアクティブな化合物の検出のためのプロトコルを提案します。新規分子 GABAAの受容器の特定の検索では、定義することが重要、できるだけ正確に、関心と新たに同定された化合物の特異性の評価のサブタイプ (例えばレビューのルドルフを見るとKnoflach1または Sieghart2)。創薬の実現に必要な手順の一般的なパスは、図 1で示されます。
結合の試金はされているし、まだほとんど創薬における最初のステップとして使用されます。GABAAの受容器の場合に、治療上有用で安全な薬が結合受容体のベンゾジアゼピン結合部位に結合する化合物を同定に最適化されています。蛍光イメージング プレート リーダー (FLIPR) 膜潜在的な赤い色素に基づく試金3を使用して他の技術は、不要な副作用のプロフィールのためにより少なく好ましいが他のサイトに結合するバルビツール酸のような化合物を検出します。さらに、使用染料は直接 GABAAの受容器、従って薬物発見4のこれらのアッセイの有用性を疑問をアクティブ化できます。結合アッセイのみ与えられた化合物が特定の受容体クラスにバインドできるという証拠を提供できます。培養細胞膜の試金を使用して人間の選択の GABAA α5β3γ2 受容体リガンドを識別します。一時的に transfected HEK293 細胞人間の GABA、 α5β3γ2、α1β3γ2、α2β3γ2、α3β3γ2 受容体は、これらの試金のための膜を準備する使用されます。リガンドの効果は、膜受容体 ([3H] フルマゼニル結合阻害) するバインド [3H] フルマゼニルのシンチレーションを測定することによって検出されます。この手法の主な利点は、関心の受容体に結合化合物の迅速かつ効率的な測定が関心の受容体に用意されていることです。
化合物の機能的活動を評価し、受容体に化合物の結合によって引き起こされる機構の生理学的および薬理学的説明を提案する機能の研究が欠かせない。今日、イオン間隙と 5 つの同一サブユニットのアセンブリから結果によって形成される pseudosymmetry の軸線のまわりの 5 つのサブユニットのアセンブリに起因機能 GABAAの受容器は良く知られています。GABAAの受容器のほとんどは、2 つ以上の異なるサブユニットで構成されます。主要な脳のGABA 受容体、例えば、される α 1、β 2、γ2 2、2、および 1 の化学量論のサブユニットのそれぞれ5,6。アフリカツメガエル卵母細胞 HEK293 細胞などのホスト システムの再構築では、急速に受容体の薬理学的特性を探索の可能性を提供しています。
化合物の薬理学的特性は、脳スライス7で細胞外記録で検討されます。このメソッドにより、神経伝達に及ぼす化合物の探査と全体のネイティブ受容体のレベルでの異種発現システムで決定された化合物の機能の効果を確認する効果的な方法を提供します神経細胞の環境。Gaba 作動性神経伝達は、抑制性シナプス電流 (Ips)8化合物の効果を測定することにより分子レベルで評価できます。しかし、ここで使用され、脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ録音に基づいてプロトコルはより精巧な低いスループットが得られます。
最後に、長所と短所の in vitroスクリーニング カスケード α5β3γ2 選択的リガンド識別に使用されるは、さまざまなテクニックと本質的な制限の観点から説明します。この作品は、専門家と非専門家がこれらのリガンド依存性イオン チャネルの新しい変調器の発見に取り組むために使用される別の in vitroアプローチの組み合わせの参考になったレビュー GABAAの受容器の分野で提供しなければなりません。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;General equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well cell harvester -(Filtermate 196)&amp;nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>To filter membranes with bound radioligand</td></tr><tr><td>Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td><td>Packard</td><td></td><td>Microplate Scintillation and Luminescence counter</td></tr><tr><td>Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Packard</td><td></td><td>Vial Scintillation and Luminescence counter</td></tr><tr><td>Liquid&amp;nbsp; handler (Biomek 2000)</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td>To prepare compound dilutions</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>To mix compound stock solutions</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>To resuspend the membrane preparations</td></tr><tr><td>XLfit5 software</td><td>Microsoft Excel&lt;br/&gt; &amp;nbsp;add-on by IDBS</td><td></td><td>Curve fitting software</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix</td><td>-</td><td>Electrode Puller</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Automated Voltage Clamp (&lt;em&gt;Xenopus&lt;/em&gt; Ooocytes)</td></tr><tr><td>DataMining</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Data Analysis Software</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Data Processing Software</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Low noise data acquisition system</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 or equivalent</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programmable Signal Conditioner</td></tr><tr><td>pClamp program suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software for data acquisition and analysis software</td></tr><tr><td>Antivibraton table&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>To avoid microelectrode vibrations&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Micromanipulators</td><td>Scientifica</td><td></td><td>To accurately position microelectrodes in brain slices</td></tr><tr><td>Faraday Cage&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>To isolate recordings from noise</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&amp;nbsp;</td><td></td><td>To prepare brain slices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass micropipette&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>To record extracellular potentials in brain slices</td></tr><tr><td>Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>To stimulate the brain slices with current</td></tr><tr><td>Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td><td>MultiChannel Systems</td><td>STG4000</td><td>Delivers the current to the stimulation electrode</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate round bottom</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>Used for the binding assay</td></tr><tr><td>GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 &amp;micro;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&amp;nbsp;</td><td>Packard&amp;nbsp;</td><td>#6005174</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>50 mL Tubes</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>#352070</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Safe-lock tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Safe-lock tubes 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Shipping tubes 180 mL&amp;nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&amp;nbsp;</td><td>#3722</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Pony vial Polyethylene 6 mL&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Top Seal&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#60051859</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Spinner Flask</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Spinner Flask</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; Well Plate (Conical)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Injection plate for the oocytes</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; Well Plate (Flat bottom)</td><td>Corning (Vitaris Switzerland)</td><td>3364-cor</td><td>Compound Plate for the HiClamp</td></tr><tr><td>Glass capillary&amp;nbsp;</td><td>Hilgenberg (Germany)</td><td>-</td><td>borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>for the &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; synthesis</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Microscint 40&amp;nbsp;</td><td>Packard&amp;nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Ultima Gold&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>antibiotics / antimycotics</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Collagenase Type I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Membranes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABA&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt; receptor subtypes: &amp;alpha;1&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;2&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;3&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;5&amp;beta;3&amp;gamma;2. See Ballard &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2009 for detailed methods.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr></tbody></table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

この原稿では、ガンマ-アミノ酪で化合物のスクリーニングのためのステップバイ ステップのプロトコル酸型 (GABAA) 受容体とその体外遺伝子組換えから前臨床アッセイでアクティブな新規分子の同定への試み受容体齧歯動物脳スライスにおけるネイティブ受容体の薬理学的影響。最初のステップは、化合物が受容体のベンゾジアゼピン系サイトのバインド、GABAAの主要なサブタイプを表現する細胞膜上の放射性リガンド結合アッセイの開発で構成されるプライマリ画面を設定するに。その後、HEK 293 細胞やアフリカツメガエル卵母細胞における齧歯動物および人間 GABAAの受容体の異種表現を活かし、異なる受容体の生理学的性質を電気生理学的アッセイに探索することが可能です。サブタイプと同定された化合物の薬理学的特性。アフリカツメガエル卵母細胞システムは卵母細胞、2 電極電圧クランプを用いた薬理学的解析までの異なる Mrna と彼らのマイクロインジェクションの分離から始まるここでは、表示されます。最後に、明確に定義された神経回路ネイティブ受容体分子の活動を評価するためにセカンダリの生理学的なテストとして使用される齧歯動物の脳のスライスで行われた録音を説明します。人口に対する複数のニューロン細胞外記録は、薬物のアプリケーションと共に示されています。

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Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

ここでは、生理・薬理のバインドからの GABAAの受容器のアクティブな化合物を発見するためのプロトコルを提案する.

Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

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Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

行動学

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

神経科学

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. Currently, the characterization of novel drugs towards their interactions with &#946;-arrestins and other cytosolic proteins is extremely valuable in the field of GPCR drug discovery particularly during the study of GPCR biased agonism. Here, we show the application of a novel structural complementation assay to accurately monitor receptor-&#946;-arrestin interactions in real time living systems. This method is simple, accurate and can be easily extended to any GPCR of interest and also it has the advantage that it overcomes unspecific interactions due to the presence of a low expression promoter present in each vector system. This structural complementation assay provides key features that allow an accurate and precise monitoring of receptor-&#946;-arrestin interactions, making it suitable in the study of biased agonism of any GPCR system as well as GPCR c-terminus &#8216;phosphorylation codes&#8217; written by different GPCR-kinases (GRKs) and post-translational modifications of arrestins that stabilize or destabilize the receptor-&#946;-arrestin complex.

GPCR-&#946;-arrestin interactions are an emerging field in GPCR drug discovery. Accurate, precise and easy to set up methods are necessary to monitor such interactions in living systems. We show a structural complementation assay to monitor GPCR-&#946;-arrestin interactions in real time living cells, and it can be extended to any GPCR.

GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

生化学

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

The molecular mechanisms that co-ordinate the formation of inhibitory GABAergic synapses during ontogeny are largely unknown. To study these processes,we have developed a co-culture model system which incorporates embryonic medium spiny GABAergic neurons cultured together with stably transfected human embryonic kidney 293 (HEK293) cells expressing functional GABAA receptors.

共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現<sub&gt; A</sub&gt;受容体

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in monoamine neurotransmitter release and uptake dynamics. Technically complex methods such as electrophysiology, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), imaging, in vivo&#160;microdialysis, optogenetics, or use of radioactivity are required to study monoamine function. The method presented here is an optimized two-step approach for detecting monoamine release in acute brain slices using a 48-well plate containing tissue holders for examining monoamine release, and high-performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-ECD) for monoamine release measurement. Briefly, rat brain sections containing regions of interest, including prefrontal cortex, hippocampus, and dorsal striatum were obtained using a tissue slicer or vibratome. These regions of interest were dissected from the whole brain and incubated in an oxygenated physiological buffer. Viability was examined throughout the experimental time course, by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The acutely dissected brain regions were incubated in varying drug conditions that are known to induce monoamine release through the transporter (amphetamine) or through the activation of exocytotic vesicular release (KCl). After incubation, the released products in the supernatant were collected and analyzed through an HPLC-ECD system. Here, basal monoamine release is detected by HPLC from acute brain slices. This data supports previous in vivo and in vitro results showing that AMPH and KCl induce monoamine release. This method is particularly useful for studying mechanisms associated with monoamine transporter-dependent release and provides an opportunity to screen compounds affecting monoamine release in a rapid and low-cost manner.

This method introduces a simple technique for the detection of endogenous monoamine release using acute brain slices. The setup uses a 48-well plate containing a tissue holder for monoamine release. Released monoamine is analyzed by HPLC coupled with electrochemical detection. Additionally, this technique provides a screening method for drug discovery.

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

要約

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この動画の章

動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループットカルシウム変化分析

シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッキング

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

要約

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動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループットカルシウム変化分析

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッキング