この方法は、遺伝子治療、腫瘍症および遺伝子ワクチン接種の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、アデノウイルス遺伝子導入ベクターのベクターホスト相互作用の理解と調節を容易にし、臨床試験で最も頻繁に使用されるベクタータイプを最新の状態にします。この技術の主な利点は、アデノウイルスのカプレートが、選択した位置で、そして単純な化学を用いて、特定の範囲で高度に定義された方法で特異的に修飾することができるということです。
ベクターホスト修飾は分析のみではなく、患者指向の方法で変調されるため、この技術の意味は治療にまで及びます。この方法は、特定のベクター宿主相互作用に関する洞察を提供するが、マウスなどの生物におけるウイルス粒子の標識および追跡にも使用され得る。一般的に、この方法に新しい個人は、両方の分野からの実用的な知識を必要とするウイルス学と有機化学のユニークな組み合わせに苦労します。
この技術の特別なデモンストレーションは、ここで有機化学の方法が細胞生物学とウイルス学の方法(フィールド固有の処理トリックを含む)を満たすので重要です。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているとおりに、すべてのバッファを準備します。各勾配バッファーの 1 ミリリットルの重量を量って、密度を確認します。
すべてのバッファーを殺菌した後、TCEP の酸化を防ぐために、アルゴンガスで TCEP を含むバッファーを約 30 秒間スパージします。固体粉末結合部分を含むバイアルを大きなチューブに保管し、それぞれがシリカゲルビーズのクッションで満たされ、バイアルを解凍する際に凝縮水の蓄積を防ぎます。これらのチューブをデシケータに入れる。
デシケータの空気を取り除き、アルゴンガスに交換します。その後、各チューブをしっかりと閉じ、シリカゲルビーズでより大きな容器に移します。すべてのチューブが移動されたら、容器を閉じます。
容器は、使用できる状態になるまで摂氏80度で保管してください。解凍する準備ができたら、デシケータのシリカビーズの層に容器を入れます。容器を室温までゆっくりと温め、容器を開けます。
細胞が最適な細胞変性影響に達したら、プレートを削り取り、上清を遠心管に移して回収します。細胞懸濁液をGの400倍に10分間回転させる。次に、10ミリモルTCEPを含むAdバッファーの4ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、得られた溶液を滅菌50ミリリットルチューブに移す。
液体窒素で溶液を凍結し、摂氏37度の水浴で解凍します。この凍結融解サイクルを3回繰り返してベクターを救出します。5000Gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。
遠心分離機は2つの超遠心チューブを設定し、2つの等しいセシウム塩化物ステップ勾配の準備を開始しました。これらのチューブのそれぞれに低相の3ミリリットルを追加します。上部のフェーズをロードする前に、チューブの下のフェーズのレベルをマークします。
その後、慎重に下のフェーズに上相の5ミリリットルを積み重ね、チューブの壁に沿って非常にゆっくりとピペットします。勾配が準備され、遠心が完了すると、サンプルから上清が 2 つの勾配に均等にロードされます。各勾配チューブの残りのスペースを、10ミリモルTCEPを含むAdバッファで埋め、チューブを一番上まで満たしてください。
反対のチューブの重量をゼロの重量差に調整します。そして、176000倍Gと摂氏4度の遠心分離機を2時間変更します。この後、クランプを使用して1つの超遠心チューブをスタンドに固定します。
下のフェーズ レベルの周辺に、アクセス可能とマークを付けておくようにします。グースネックランプをチューブの上に置きます。マークの周り、下側と上の段階の境界で、明確なバンドが表示されるはずです。
チューブを針で穿刺し、ベクターバンドを注射器に吸引してベクターを採取する。収集したベクタービロンを15ミリリットルのチューブに移し、テキストプロトコルで概説されているように必要な結合基板の量を計算します。次に、ベクター溶液を適切なサイズのチューブに移す。
そして、カップリング化合物ストック溶液の計算量を。室温で1時間、頭上回転で軽く混ぜます。次に、広告バッファーを追加して、ベクター溶液の総体積を 6 ミリリットルに調整します。
テキストプロトコルで概説されているように、第2のセシウム塩化物結合ステップを使用して未反応の結合部分からベクターを精製する。針でチューブを穿刺し、ベクターバンドを注射器に吸引する。収集したベクターを15ミリリットルのチューブに移します。
両方の勾配管から結合された結合が2.5ミリリットル未満の場合は、Adバッファを追加して2.5ミリリットルに音量を調整します。結合されたビロンを同じアップグレードされたPd列にロードし、フローを破棄します。次に、3 ミリリットルの Ad バッファを列に追加し、フローを収集します。
収集した流れに333マイクロリットルのグリセロールを加え、10%の最終濃度を得る。これらを適切なアリコートに分割します。OD 260測定によるより厳しい判定のために20マイクロリットルのアリコートを含むようにする。
ベクター溶液を摂氏80度で保存して、使用できる状態にします。293細胞に対する効果の代表的な結果は、ベクター産生が成功したことを示す。細胞は、ウイルスベクターを接種してから40〜48時間後に形態を示すべきである。
銀染色SDSファージは、次いで、カップリング効率を評価するために使用されます。ヘクソンを修飾し、変更されていない両方のカプソームペントンベースに導入されたシステインを有するベクターが実行されます。ヘクソンバンドは、キャプシド当たりモノマーの90%以上の変更に成功したことを示すシフトを示す。
この手順を試みる間、非モドフィドベクター粒子の還元環境を確保することが重要である。修飾後、規則的な雰囲気が適している。正確なドキュメンタリー計算は、すべてのベクトル粒子の定量的な修正を確実にする必要があります。
この技術の開発は、ベクターデリバリーのための安全で不十分な戦略をさらに探求するために、遺伝子治療の分野での研究に役立ちます。この手順に従って、標識のためのリガンドまたは蛍光色素のカップリングのような他の方法は、受容体の使用法および生体分布のような追加の質問に答えるために行うことができる。現地のGMOおよび労働安全規則に従ってください。
