博士アレクサンドル ・ Mourot は、原稿の彼のコメントを感謝いたします。この作品は、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR 2011 MALZ 003 01; からの補助金によって支えられました。ANR-15-CE16-0010 と ANR-17-CE37-0010-03)、BLG 財団注ぐラ凝ったシュル アルツハイマーから交わりに支えられて。IBPS (フランス ・ パリ) の動物施設に感謝いたします。

著者が明らかに何もありません。

単一セルのマルチプレックス RT-PCR によるパッチ ・ クランプすることができます同時にかつ確実にプローブ的識別されたセル5以上 30 遺伝子の発現後。単一細胞レベルの遺伝子発現解析と、非常に効率的な PCR のプライマーが必要です。最も制限の手順の 1 つは、セルの内容のコレクションです。その効率は、セル サイズをマッチングしながら可能な限り大きくする必要がありますパッチ ピペットの先端の径に依存します。1-2 μ m オープン先端径のピペットは、最も神経のタイプに適してする証明されました。携帯電話コンテンツのみを収集するかどうかを確認する重要ですと周囲の組織ではないです。これは生理の収穫の際にタイトなシールの保存を制御することによって実現されます。さらにピペットの離脱時に外をパッチの構成の形成は、細胞の残骸から収穫された細胞質を保護します。調査セルの種類の Mrna の豊かさによって異なりますまたマルチプレックス RT-PCR による単一細胞の成功率。例えば、アストロ サイトは、比較的低い線量3における Mrna を表現で得られる利回りはニューロンで得られたものよりも一般的に低いとサンプル サイズ15,16を増やすことが必要があります。逆に低効率は、チューブ48単一の制限の反応セルのマルチプレックス RT-PCR による転写。したがって、-80 ° c、因数としてそれらを保存して 1 日でのみそれらを使用する最高品質の試薬を使用するが重要です。最後に、RTase の DNA ポリメラーゼ活性はしばしばプライマー二量体形成に見落されたソースです。この問題を解決するには、プライマーとホット スタートを実行するは、増幅効率を向上させる重要です。さらにこれは Taq DNA ポリメラーゼ活性49の RTase の抑制効果を低くなります。
単一のセルの多重 RT-PCR 法は汎用性の高いです。齧歯動物10、11,13,19,20,34,50,51,52 で広く使用されています ,,5354事実上すべての動物モデルと組織と遺伝子配列が利用できる遺伝子に適応することができます。彼らは携帯無料試金の RT-PCR と干渉しない限り、パッチ ・ クランプのさまざまなソリューションを使用できます。例えば K+または Cs+陽イオン、Cl-またはグルコン酸に基づく内部ソリューションは正常に使用される6,36,41,55をされています。
古典的な偽陰性結果はパッチ ピペット フィラメントおよび/または内部パッチ ・ クランプ ソリューションの RNase の混入に由来します。慎重にフィラメントを塩素化し、一般に内部ソリューションを検証するこの問題を解決します。偽陰性結果は、細胞質の割合だけを収穫するので、低い単一セルのレベルで遺伝子を表す場合にも起こります。収穫の品質は全細胞記録の時間を削減しおよび/または大きいピペットを使用して増やすことができます。単一セル20の低レベルで発現すること知られている遺伝子を含めることによって収穫品質を評価できます。偽陽性の結果は、悪い組織の品質、汚染細胞の残骸の量は高と発生します。残骸の存在をテスト、任意のシール ピペット取り外す前に肯定的な圧力を解放ことがなくスライスにパッチ ピペットを挿入して行われます。マルチプレックス RT-PCR 法42無衝突材料の存在の探索します。Silanizing パッチ ピペットは、細胞外の汚染物質56のコレクションを減らすために使用されています。単一セル PCR は二重鎖 DNA57の単一コピーとして同様に少しを検出する非常に敏感な手法です。イントロンのない遺伝子の場合 gDNA を核に含まれる偽陽性を生成できます。この問題を解決するために収穫の助けの間に核からピペットを配置することによって gDNA のコレクションを回避します。GDNA の存在は、イントロン シーケンス25を増幅することによって確実に検出できます。
RT-PCR 法による mRNA 分子の検出 RTase48, 効率が低いためおそらく 10 枚44、信頼性が低くなりにつながることができます、低豊富な成績26,42の検出の下。これはイントロンのない遺伝子の場合問題となることができます。確かに、核の収穫を避けることと、収集できる細胞質の量、したがって検出感度が軽減されます。単一セル PCR 後パッチ ・ クランプ付け biocytin は、細胞の形を可能な限り維持する必要がありますの組み合わせ (図 3)。やむを得ず、これは収集、成功率を減らすことができます材料の量が減少します。コレクション細胞質と細胞形態の保存間の妥協は必須です。
彼らは Cdna がされているかどうかに関する情報を与えるよう、多重の単一セル RT-PCR データが定量的または収集資料には存在しません。ただし、上記検出の制限、ため人口レベルで検出の発生は、遺伝子の単一セルのレベルで豊かさを反映できます。代替的なアプローチを許可するより多くの量的データの生成が主の特定の拡大戦略を (すなわち、相同遺伝子または RT qPCR の相対的な定量化) によって課された技術的な制約の数を制限します。同時にできる遺伝子分析41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,,6465,66。パッチ ・ クランプ記録の単一細胞 RNaseq、パッチ seq30,31, と呼ばれる最近の組み合わせにより、的特徴と細胞の定量的なトランスクリプトーム解析です。新しい有望なアプローチはまだ高速シーケンサーへのアクセスを必要としてデータ生成時間のかかる分析が必要があります。

大脳皮質には、様々 な生理学的なプロセスに関与する様々 な細胞タイプが装備されています。同定と解析、固有の機能を理解する前提条件することができます非常に挑戦的な大脳皮質細胞の種類1 を特徴付ける大きな形態学的、生理学、分子多様を与え、2,3,4。
単一セル多重 RT-PCR は、パッチ ・ クランプと RT-PCR 技術の組み合わせに基づいています。それは同時に生理識別されたセル5以上 30 事前定義された遺伝子の発現を調べることができます。さらに録音ピペットで神経トレーサーのインクルー ジョンにより、組織化学的啓示6,7,8,9,後記録された細胞の形態的特性10ですその形質5,9,10、11,12 の多変量解析に基づく神経型の分類に非常に便利な技だ。 ,,1314。単一のセル マルチプレックス RT-PCR によるアストロ サイト15,16,17など非神経細胞の特性に適しています、すべての脳構造18、事実上適用ことができます。 19,20,21,22,23とセル型、全細胞構成で記録できると仮定すると。
この手法は、非常に便利な細胞源の同定や伝送システム7,8,15,16,20,21、ターゲット 24,25,26,27,28, 特定の抗体が不足している場合は特に。それは視覚的に識別されたセルの29日からのホールセルパッチク ランプ記録に依存し、したがって特定の細胞環境8,15,16セルのターゲットができます。さらに脳スライスにおける脳組織の細胞構築が保持されるのでこの方法もできます神経および非神経要素7,8の特徴の細胞の解剖学的関係の検討,18。
この手法は、細胞質の収穫の量によって、RT の効率によって限られているので、低コピー数で表される mRNA の検出は難しくなります。高-高価なシーケンサーが必ずしも必要があります彼ら30,31,,単一のセル3,4の全トランスクリプトームを解析する RNaseq 技術に基づいて他のアプローチを可能にしますすべての研究室が使用できます。単一セル多重 RT-PCR 法は、エンドポイント PCR を使用しているためにだけ広く利用可能な thermocyclers が必要です。電気生理学的セットアップ装備研究所で簡単に開発することができ、高価な機器を必要としません。1 日の内で、定義済みの一連の遺伝子の表現の質的分析を提供できます。したがって、このアプローチは、迅速な方法で単一細胞の分子特性解析へ簡単にアクセスを提供します。

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Multiple alignement for primer design</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Random primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / desalted and diluted at 200 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT10 Series - 10 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>&amp;Phi;X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Smooth paper with satin appearance</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Potassium D-gluconate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td><td>Wescor</td><td></td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Patch Clamp set-up cleaning</td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>BX51WI Upright microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td><td>Sony</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>E Series with Straight Body (Holder)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Histochemical revelation</td></tr></tbody></table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

大脳皮質は多数の細胞の種類様々 な形態学的、生理学、分子機能を展示で構成されます。この多様性は、これらの細胞の種類、固有の機能を研究するための前提条件の簡単な同定と解析を妨げます。この記事では、パッチ ・ クランプのスライスに記録後、単一のセルに同時に遺伝子の発現を検出するにより多重単一セル逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) プロトコルについて説明します。この単純な方法は形態的特性と実装でき、血管近傍などさまざまなセルタイプおよび彼らの特定の細胞の環境の形質を決定することも多い。この議定書の原則は記録するセルを収穫し、逆に、パッチ ・ クランプの技術ではその細胞質の内容を書き写す、マルチプレックス pcr 法の定性的検出する遺伝子の定義済みセットの式。PCR のプライマーおよび RT-PCR 法と互換性がある細胞内のパッチ ・ クランプ ソリューションの注意深いデザインを必要があります。選択的かつ信頼性の高い成績を確保するため検出、この手法には細胞質が増幅ステップに収穫から適切なコントロールも必要です。注意ここで説明は厳密に従う必要があります、実質的に任意の電気生理学的検査は、RT - pcr マルチプレックスの単一のセルを使用できます。

マルチプレックス RT-PCR 法の代表的な検証を図 3に示します。プロトコルは、同時に 12 の異なる遺伝子の発現を調べるために設計されました。小胞グルタミン酸トランスポーター vGluT1 は、グルタミン酸作動性ニューロン42の肯定的な制御として取られました。GABA 合成酵素 (GAD65 と歩き 67)、ニューロペプチド Y(NPY)、およびソマトスタチン (SOM) は、gaba 作動性介在ニューロンの3、5,11のマーカーとして使用されました。シクロオキシゲナーゼ 2 酵素 (COX-2) は、錐体細胞のサブ人口3,16のマーカーとして使用されました。
ATP1α1 3 サブユニット na+/K+ atp アーゼおよび ATP 感受性 K+チャンネル Kir6.2 と SUR1 サブユニットは、神経細胞の活動や代謝状態43との関係を評価するため選ばれました。Kir6.2 イントロン少ない遺伝子は、SOM イントロンはゲノム コントロールとして含まれていた。プロトコルは、1 にテストされている約 20 の成績証明書に対応するマウス全脳から抽出した逆転写総 RNA の ng 細胞44。マルチプレックス PCR 生成 12 amplicons 予想されるサイズ (図 3および表 1) の感度およびプロトコルの効率を示します。しなくても、RNA 陰性対照に私アンプリコン (データは示されていない) は出ません。
V 層の錐体細胞は視覚的にその大規模なソーマと著名な樹状によって識別され (図 5 a、挿入)。全細胞記録層ニューロン5,45,46を特にスパイク正規 V、入力抵抗が低く、長期的な活動電位、顕著なスパイクの典型的な電気生理学的特性を明らかにしました。周波数適応 (図 5 a)。このニューロンの分子解析は、vGluT1 の式を明らかにした (図 5 b)、そのグルタミン酸作動性表現型42,46を確認します。このニューロンはソム、ATP1α1、ナ+の 3 サブユニットにも表現される/K+ ATPase。Biocytin ラベル記録されたニューロンの錐体の形態 (図 5) を確認しました。
VGluT1 の式で、2 つ GADs. (図 5) のどちらもグルタミン酸作動性ニューロンから期待どおりに 26 V 層の錐体細胞の分子分析を明らかにしました。介在ニューロンのマーカー稀5,42,46に観察されました。コックス 2、層 II-III の錐体細胞の3,16、によって主に表現は層 V 錐体細胞で検出されませんでした。ATP1α1 と 3 サブユニットであった ATP1α2 サブユニット3よりもより頻繁に観察されました。Kir6.2 と SUR1 サブユニットほとんど上層3,43優遇表現に一貫している V 層錐体細胞に検出された.SOM イントロン (3 のうち 26 セル、すなわち12%) の稀な検出の結果、核を収穫に注意されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig1.jpg"> 図 1: 単一セル RT-PCR の専用ボックス。パッチ ・ クランプ後 RT-PCR のため予約資料の一覧です。(1) ホウケイ酸ガラス管、(2) 20 μ L 長い、罰金、柔軟なヒント、(3) 20 μ L ピペット、(4) 自家製の圧搾、(5) 500 μ L の PCR チューブ、(6) 10 μ L エアゾール耐性フィルター ヒント、および (7) 永久的なマーカー。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig2.jpg"> 図 2: PCR プライマー設計戦略。(A) コックス 2 遺伝子を含んでいるマウス染色体 2 シーケンスに配置コックス 2 cDNA のコード配列の模式図。エクソンは、ブラック ボックスおよびホワイト ボックスで gDNA をイントロンによって表されます。GDNA にイントロンのシーケンスに対応する cDNA のギャップに注意してください。それぞれ赤と緑の矢として表される、悪い面と良いオリゴヌクレオチドの代表例です。右と左の矢印を示す前方および逆のプライマー。(B) シーケンスは、(A) に示すようにオリゴヌクレオチドの二次構造。左と右のパネルは、それぞれヘアピン自己相補性と自己ダイマー形成を示します。B1オリゴヌクレオチドは、 B2のオリゴヌクレオチドはダイマー形成に対し強いヘアピン自己相補性とダイマー形成の両方を表示します。B3とB4のオリゴヌクレオチドがあるないヘアピン自己相補性とないダイマー形成;彼らはイントロン ・ overspanning (A) であり、潜在的な PCR プライマー (表 1参照) として選択されています。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig3.jpg"> 図 3: マルチプレックス PCR の検証します。1 ng のマウス脳全体からの総 RNA の逆転写 PCR の拡大の 2 つのラウンド後に受けた。12 の PCR の製品は、別のレーンのHaeIII によって消化 Φx174 と並行して agarose ゲル電気泳動によって解決されました。2 つ目の PCR の製品いたシーケンスによって予測 (bp) のサイズ: 153 (vGluT1)、248 (GAD65)、255 (GAD67)、181 (コックス 2)、220 (NPY)、146 (SOM)、183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2)、128 (ATP1a3)、342 (Kir6.2)、211 (SUR1)、および 182 (SOMint)。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig4.jpg"> 図 4: 脳スライスのパッチク ランプ-収穫します。セルが視覚的に識別される、記録ピペットは肯定的な圧力とピペットの先端の細胞の残骸汚染を避けるために近づかれます。このニューロンの膜上のえくぼに注意してください。肯定的な圧力は、Gigaohm タイトなシールで携帯接続構成を形成するために中断されます。簡単な吸引は、全細胞の構成に切り替えるに適用されます。録音の最後に、細胞質はピペットにタイトなシールを維持しながら穏やかな否定的な圧力を適用することによって収穫されます。収穫の手順の中には、細胞体の収縮を注意してください。記録ピペットを優しく後続 biocytin 啓示とパッチ ピペットで収穫物の保全のための細胞膜閉鎖を支持する外側をパッチを形成する撤回します。Cauli と Lambolez47から王立化学会から許可を得て再現。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig5.jpg"> 図 5: V 層大脳新皮質の錐体細胞のキャラクタリゼーション。(A) 膜の V 層の錐体細胞の潜在的な応答は-100、-40、-10、+60、+120、+500 pA (下部トレース) の現在の脈拍によって誘導されます。ニューロンには、初期の過分極応答 (上部トレース) 後弱い潜在的な偏向が表示されます。閾上の脱分極に対し、ニューロンはゆっくり後過分極 (上側) の開発に長期的な活動電位を放出しました。彩度、近くニューロンが低周波で排出し、顕著な適応 (上部のグレー トレース) を展示します。Inset: V 記録層錐体細胞の赤外線写真です。軟膜表面に上向きです。スケール バー: 20 μ m (B) マルチプレックス RT-PCR による分析 vGluT1、ソム、ATP1α1、および ATP1α3 の式を明らかにします。(C) V の錐体細胞層の 26 のサンプルの遺伝子発現プロファイル。vGluT1 は、GAD65 と GAD67 COX2 が検出されたことがない、すべてのニューロンに表現されました。NPY、SOM、Kir6.2、SUR1、SOM のintが稀に観察されました。錐体細胞は、ATP1α3、ナ+の 1 サブユニットを表明した/K+ atp アーゼとより少ない程度に ATP1α2。(D) 最大強度投影 (A) に記録された biocytin ニューロンの分類を示す共焦点画像の。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>遺伝子/GenBank 数</td>
			<td colspan="2">外部のプライマー</td>
			<td>サイズ (bp)</td>
			<td colspan="2">内部のプライマー</td>
			<td>サイズ (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">vGlut1 NM_182993</td>
			<td colspan="2">意味、-113</td>
			<td rowspan="4">259</td>
			<td colspan="2">意味、-54</td>
			<td rowspan="4">153</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC</td>
			<td colspan="2">ATTCGCAGCCAACAGGGTCT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、126</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、79</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAGCCGACTCCGTTCTAAG</td>
			<td colspan="2">TGGCAAGCAGGGTATGTGAC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">GAD65 NM_008078</td>
			<td colspan="2">意味、99</td>
			<td rowspan="4">375</td>
			<td colspan="2">意味、219</td>
			<td rowspan="4">248</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAAAAGTTCACGGGCGG</td>
			<td colspan="2">CACCTGCGACCAAAAACCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、454</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、447</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TCCTCCAGATTTTGCGGTTG</td>
			<td colspan="2">GATTTTGCGGTTGGTCTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">GAD67 NM_008077</td>
			<td colspan="2">意味、529</td>
			<td rowspan="4">598</td>
			<td colspan="2">意味、801</td>
			<td rowspan="4">255</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TACGGGGTTCGCACAGGTC</td>
			<td colspan="2">CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、1109</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、1034</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCCAGGCAGCATCCACAT</td>
			<td colspan="2">AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">コックス 2 NM_011198</td>
			<td colspan="2">意味、199</td>
			<td rowspan="4">268</td>
			<td colspan="2">意味、265</td>
			<td rowspan="4">181</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CTGAAGCCCACCCCAAACAC</td>
			<td colspan="2">AACAACATCCCCTTCCTGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、445</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、426</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCTTATTTCCCTTCACACCCAT</td>
			<td colspan="2">TGGGAGTTGGGCAGTCATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">NPY NM_023456</td>
			<td colspan="2">意味、16</td>
			<td rowspan="4">294</td>
			<td colspan="2">意味、38</td>
			<td rowspan="4">220</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGAATGGGGCTGTGTGGA</td>
			<td colspan="2">CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、286</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、236</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT</td>
			<td colspan="2">GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ソム NM_009215</td>
			<td colspan="2">理 43</td>
			<td rowspan="4">208</td>
			<td colspan="2">意味、75</td>
			<td rowspan="4">146</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ATCGTCCTGGCTTTGGGC</td>
			<td colspan="2">GCCCTCGGACCCCAGACT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、231</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、203</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GCCTCATCTCGTCCTGCTCA</td>
			<td colspan="2">GCAAATCCTCGGGCTCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">
ATP1Α1 NM_144900
</td>
			<td colspan="2">意味、1287</td>
			<td rowspan="4">288</td>
			<td colspan="2">意味、1329</td>
			<td rowspan="4">183</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA</td>
			<td colspan="2">TAAGCGGGCAGTAGCGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、1556</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、1492</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCGTGGAGAAGGATGGAGC</td>
			<td colspan="2">AGGTGTTTGGGCTCAGATGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ATP1Α2 NM_178405</td>
			<td colspan="2">意味、1392</td>
			<td rowspan="4">268</td>
			<td colspan="2">意味、1430</td>
			<td rowspan="4">213</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG</td>
			<td colspan="2">AAATCCCCTTCAACTCCACCA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、1640</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、1623</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ACAGAAGCCCAGCACTCGTT</td>
			<td colspan="2">GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ATP1Α3 NM_144921</td>
			<td colspan="2">意味、127</td>
			<td rowspan="4">216</td>
			<td colspan="2">意味、158</td>
			<td rowspan="4">128</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGGAAATACAATACTGACTGCGTG</td>
			<td colspan="2">TGACACACAGTAAAGCCCAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、324</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、264</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GTCATCCTCCGTCCCTGCC</td>
			<td colspan="2">CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Kir6.2 NM_010602</td>
			<td colspan="2">意味、306</td>
			<td rowspan="4">431</td>
			<td colspan="2">意味、339</td>
			<td rowspan="4">342</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGGAGAGGGCACCAATGT</td>
			<td colspan="2">CATCCACTCCTTTTCATCTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、719</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、663</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CACCCACGCCATTCTCCA</td>
			<td colspan="2">TCGGGGCTGGTGGTCTTG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">SUR1 NM_011510</td>
			<td colspan="2">意味、1867</td>
			<td rowspan="4">385</td>
			<td colspan="2">意味、2041</td>
			<td rowspan="4">211</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CAGTGTGCCCCCCGAGAG</td>
			<td colspan="2">ATCATCGGAGGCTTCTTCACC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、2231</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、2231</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG</td>
			<td colspan="2">GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">SOMint X51468</td>
			<td colspan="2">意味、8</td>
			<td rowspan="4">240</td>
			<td colspan="2">意味、16</td>
			<td rowspan="4">182</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CTGTCCCCCTTACGAATCCC</td>
			<td colspan="2">CTTACGAATCCCCCAGCCTT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">対策をした意味、228</td>
			<td colspan="2">対策をした意味、178</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAGCACCAGGGATAGAGCC</td>
			<td colspan="2">TTGAAAGCCAGGGAGGAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。最初と 2 番目の PCR プライマーの配列。各 PCR プライマーとその系列の位置は、3 ' から 5' 与えられます。ソマトスタチン イントロンを除く 1 の位置は、各遺伝子の開始コドンの一塁に対応します。

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Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応

このプロトコルでは、重要なステップとパッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行に必要な注意事項をについて説明します。この手法は、あらかじめ決められた一連のホールセルパッチク ランプ記録によって特徴付けられる単一細胞からの遺伝子発現プロファイルを解析するシンプルで効果的な方法です。

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

single-cell-multiplex-reverse-transcription-polymerase-chain-reaction

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K ビュー.  Sorbonne Université. このプロトコルでは、重要なステップとパッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行に必要な注意事項をについて説明します。この手法は、あらかじめ決められた一連のホールセルパッチク ランプ記録によって特徴付けられる単一細胞からの遺伝子発現プロファイルを解析するシンプルで効果的な方法です。

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

神経科学

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

生物学

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety assessment models is a critical step during drug development. Currently, cardiac safety assessment is still highly dependent on animal studies. However, animal models are plagued by poor translational specificity to humans due to species-specific differences, particularly in terms of cardiac electrophysiological characteristics. Thus, there is an urgent need to develop a reliable, efficient, and human-based model for preclinical cardiac safety assessment. Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as an invaluable in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. hiPSC-CMs can be obtained from individuals with diverse genetic backgrounds and various diseased conditions, making them an ideal surrogate to assess drug-induced cardiotoxicity individually. Therefore, methodologies to comprehensively investigate the functional characteristics of hiPSC-CMs need to be established. In this protocol, we detail various functional assays that can be assessed on hiPSC-CMs, including the measurement of contractility, field potential, action potential, and calcium handling. Overall, the incorporation of hiPSC-CMs into preclinical cardiac safety assessment has the potential to revolutionize drug development.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as a promising in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. Here, we detail a protocol for measuring the contractility and electrophysiology of hiPSC-CMs.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

医学

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Slice ...

パッチ・クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプションポリメラーゼ連鎖反応

要約

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シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

一チャネルセル付パッチクランプ法

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応

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単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

一チャネルセル付パッチクランプ法

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

パッチ・クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプションポリメラーゼ連鎖反応