Name: gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast at JoVE.com

このプロジェクトの支援の資金調達は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省と ICT (2016R1A2B2006354) によって資金を供給によって提供されました。

1. 媒体の作製
<ol><li>準備酵母エキス サプリメント (はい)、はいアデニン (はい低 Ade)、酵母のグルタミン酸媒体 (PMG12) および PMG なしアデニン (PMG Ade) なしの表 1に示すようにコンポーネントを混合することによって。はいエイド (低 Ade) と PMG Ade プレートがすべての同じコンポーネント、アデニンを後者から省略すると。<ol>
<li>次の塩 (50 x) ストックを使用: 52.5 g/L MgCl2·6H2O、2 グラム/L の CaCl2·2H2O、50 g/L 塩化カリウム、2 グラム/L の Na24蒸留水です。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存</li>
		<li>次のビタミンを使用して (1、000 x) 在庫: 1 g/L パントテン酸 10 g/L ニコチン酸、イノシトール 10 g/L、蒸留水で 10 mg/L ビオチン。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存</li>
		<li>次の鉱物を使用 (10, 000 x) 在庫: ホウ酸 5 g/L、4 g/L MnSO4、4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L した FeCl2·4H2O, 0.4 g/L MoO3, 1 g/L KI、0.4 g/L CuSO4·5H2O、蒸留水の 10 g/L のクエン酸。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存 注: はい液体培地を寒天を省略することで可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オートクレーブ中 200 rpm の速度での攪拌棒で攪拌しながら 60 ° C 以下に冷却します。</li>
	<li>はい + G418 (ジェネティシン) プレートはい中 1 mL/L G418 原液を追加します。<ol>
<li>次の G418 を使用 (1、000 x) 在庫: 100 mg/mL G418 蒸留水で。フィルター滅菌-20 ° C で 0.22 μ m の細孔径のフィルター、およびストアの 1.5 mL 遠心チューブに分注を使用して</li>
	</ol>
</li>
	<li>90 mm シャーレ (約 40 シャーレ中の因数の 1 L に別の 5-10 分、因数のメディアをかき混ぜる.4 ° C でプレートを保存します。</li>
</ol>2. クローンのrpt4 +とその 5/3' UTRs
<ol><li>プライマー p1 と p2 で PCR を行う (図 1 a) (〜 1 μ g DNA、20 U 酵素反応バッファー x 1)、50 μ L の総ボリュームでテンプレートとしてゲノム DNA (gDNA) を酵母分裂を使用して、3,315 ベースを増幅して表 2に示す反応サイクルを適用します。ペア (bp) のフラグメントは、 rpt4 +とその 5/3' UTRs で構成されます。PCR の製品の浄化キット13を使用して (図 1 a) の製造元の指示に従ってを浄化します。</li>
	<li>PBlueScript KS(-) ベクトル14と 16-18 の水浴の 37 ° C でrpt4 +とその 5/3' BamH1とXho1 UTRs 20 μ L (〜 1 μ g の DNA、20 U 酵素、1 x 消化バッファー) の総量を含む増幅された DNA 断片をダイジェストします。h (図 1 b)。</li>
	<li>ゲル浄化消化ベクトル (1.2% の agarose のゲル)、DNA を挿入 TAE を用いたアガロース電気泳動 (100 V、1 h) を実行する、任意の大きさの DNA バンドを切除し、ゲル抽出キット15で DNA を分離することです。</li>
	<li>ベクトルとベクトル DNA の 50-100 ng を含む 20 μ L の ligation の反作用を実行することによって T4 DNA リガーゼを使って DNA 挿入を縛る、~ 3 倍モル過剰挿入 DNA、400 U T4 DNA リガーゼと結紮バッファー × 1。16-18 h の 18 ° C でこの混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>70 の熱ショックを適用することによって大腸菌DH5α の 100 μ L に結紮の DNA を変換 42 ° C で sポンドの 1 つの mL を追加し、回復の 37 ° C で 1 時間インキュベートします。遠心分離 (13,800 x g) を実行、変換されたエシェリヒア属大腸菌のすべてが LB アンピシリン (ラ) プレート細胞培養上清、, 16 h の 37 ° C で板を破棄します。</li>
	<li>つまようじで 4-8 コロニーをピックアップし、37 ° c 3 mL ラ中で一晩成長します。</li>
	<li>製造元のプロトコルに従って使用されるプラスミド精製キット16で、プラスミドを分離し、孤立したプラスミド (BamH1と各制限酵素の 5 U の 5 μ L で分析の制限の酵素の消化力を実行Xho1) と制限バッファー × 1。3 h 候補プラスミドを配列することによってクローニング確認の水浴の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
</ol>3. サイレント突然変異 (Xho1制限サイト) の導入
<ol><li>それ以外の場合補足シーケンスの望ましい突然変異を含む 33 bp プライマー (p3 および p4) のペアを設計します。</li>
	<li>25 μ L の総ボリューム内の忠実度の高いポリメラーゼ17 (図 1) と PCR を行う (10 複製プラスミド、10 pmol プライマー ミックス、2 U 酵素反応バッファーの 1 つの x の 2 μ L の ng) サイクリングのパラメーターを使用して表 3に記載されています。</li>
	<li>Dpnを 1 時間水に 37 ° C で 20 μ L (20 U 酵素, 1 x 消化バッファー) の容量でお風呂が付いているテンプレート プラスミッドを消化します。</li>
	<li>変換、伝達、分離、および 2.5 2.7 の手順に記載されている、サイレント突然変異を含んでいるプラスミッドをシーケンスします。 注:18の単一の反作用の複数の DNA のフラグメントの結合に関することができますクローンの作成方法を使用しても、サイレント突然変異を導入できます。</li>
</ol>4 rpt4 +エラーを起こしやすい PCR によるランダム変異導入
<ol><li>テンプレート、プライマー p5、p6、50 μ L (4.1.1 10 pmol プライマー ミックス、2.5 U 酵素、1 x 反作用バッファーの 2 μ L のステップで定義したテンプレートの量) の総量と、プラスミドを用いたサイレント突然変異 (Xho1サイト)、エラーを起こしやすい PCR を実行します。、高いエラーを生成するために設計されている特別なポリメラーゼ率19 (図 1)。表 2に説明されているように、PCR を実行します。<ol>
<li>4-5 μ g のプラスミド テンプレートを使用して、1 bp/kb (プラスミド) に突然変異の頻度を制御します。 注:高濃度 (> 500 ng/μ L) プラスミド ミニ準備キット20を使用して入手することが、必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲル電気泳動を使用して 2670 bp (1.2% の agarose のゲル) の PCR の製品を確認します。ゲルは、2.5 の手順で説明されているようにこの PCR の製品を浄化します。</li>
</ol>5. フュージョン PCR のフラグメント (菅、3' UTR) の準備
<ol><li>テンプレート、プライマー p7 と p8, pFA6a KANMX621を使用して PCR を行い、マーカー (菅) フラグメントを取得する表 4 に記載されている条件。ゲルは、2.5 (図 1E) の手順で説明するように結果 1,480 bp のフラグメントを浄化します。<ol>
<li>突然変異とその隣接遺伝子のコーディングの地域を対象とする遺伝子の終止コドンが 500 以上で区切られたかどうかチェックしてください bp。この地域が 500 未満の場合は、内因性のターミネータを使用できません bp;むしろ、内因性のターミネーターではなくADHターミネータを使用ください。ADHの終端文字を使用するために必要なプロトコルの変更は、表 5に掲載されています。 注:これらの変更は、内因性のターミネーターではなく pFA6a 3HA KANMX6 プラスミドであり、 ADHの終端記号を使用する場合にのみ適用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クローンとrpt4 +PCR を実行-テンプレートとプライマー p9、p10 の総量が 50 μ L のベクターを含む (20 クローンのプラスミド、10 pmol プライマー ミックス、2 U 酵素反応バッファーの 1 つの x の 2 μ L の ng)、表 6に提示条件を使用して。ゲルは、得られた 506 bp 3' UTR フラグメント (図 1E) を浄化します。</li>
</ol>6. 融合 PCR (図 1E) による変換のコンス トラクターの生成
<ol><li>50 ng/μ L で 3 フラグメント (人為rpt4 +菅、および 3' UTR) を準備します。</li>
	<li>表 7 に記載されている 3 つの PCR プライマー p11 と p12 を使用して片融合を実行します。(フュージョン PCR のためのプロトコルは元プロトコル22の変更) です。主要な 4,398 bp の PCR の製品を浄化します。<ol>
<li>Rpt4 +を使用: KAN:3'UTR の 1 の割合で断片: 3:1 最適な結果を得るのため。 注:挿入 DNA の総量が 500 を超えない ng。Rpt4 +の推奨量: KAN:3'UTR は 50 ng:150 ng:50 ng。人為の領域は、他の 3 つに変異が各拠点のすべての可能な組み合わせを占めるイースト コロニーの最小数は 1,600 x 3 = 4,800 約 1.6 kb の植民地。変換反応の 1 つは通常 400-500 コロニーを生成、ため融合 PCR を構築の価値が少なくとも 10 の反応が必要です。10 の要因によって単に反応量 (すなわち、 PCR チューブの数) を増やすことによってこの必要性を満たすことが。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 電気穿孔法 (図 1 f) による分裂酵母の変換
<ol><li>16 時間以上インキュベートし飽和する [はい] 媒体の 10 mL には、酵母を接種します。</li>
	<li>600 の光学濃度に細胞を希釈はい中の 0.2 で 200 mL の nm (外径600), 外径600 5-6 時間振とうしながら 30 ° C で、= 0.6 - 0.8。</li>
	<li>外径600細胞を集中 = 30、4 つの 50 mL の円錐管に省略し、10 分間氷で冷やします。</li>
	<li>4 ° C で 3 分間 1,050 × g で遠心分離を行い、細胞を収穫します。チューブと 10 電気キュベットを氷の上に配置します。氷上 7.3 7.8 の手順に従います。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、1.2 M ソルビトールの 15 mL を加えます。細胞を再懸濁しますチューブを軽く振る。</li>
	<li>4 ° C で 3 分間 1050 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>7.4 と 7.5 の手順を繰り返します。上清を捨てます。各管に 1.2 M ソルビトールの 500 μ L を追加、細胞を再懸濁します、1 つ 15 ml の円錐管の細胞のすべてを収集します。</li>
	<li>1.2 M ソルビトールを追加 2.4 mL (外径600 = 0.2 mL あたり 10)。氷の上の管を保ちます。</li>
	<li>(彼らは十分に中断された確認) ソルビトール中断セルを 200 μ l 添加フュージョン PCR を含む EP 管の構築、ミックスも、および電気キュベットにサンプルを転送します。</li>
	<li>Electroporate 次のオプションを持つセル: 菌類、ShS (2.00kV、1 パルス)。</li>
	<li>800 μ L の総ボリュームの場合は、各電気キュベットに 1.2 M ソルビトール 600 μ L を追加し、広がる 4 つはいプレート (200 μ L/プレート) のセル。10 電気キュベットをはいプレート 40 に分配されます。</li>
	<li>30 ° C 24 時間で版を孵化させなさい。</li>
	<li>はい + G418 レプリカ メッキを行い、3 日間の 30 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>8. 各種ヘテロクロマチン不安定変異体や偽陽性を確認
<ol><li>各はい + G418 プレート レプリカ メッキはいエイド (低 Ade) と PMG エイド (いいえ Ade) プレートを実行します。はい Ade プレート上の植民地のいくつかは赤い着色 (図 1) を示すまで 30 の ° C で 1-2 日のレプリカ版を孵化させなさい。</li>
	<li>比較はい Ade と PMG Ade のプレート地図はい Ade プレートにピンクや白、PMG Ade プレートでも育つセルを選択します。彼らは偽陽性 (例えば、菅カセットがゲノムの他の非ターゲット ・ サイトで統合されていることを反映して)、PMG エイドに成長せずコロニーを選択しないでください。</li>
	<li>各植民地から約 1 x 10 の5セルを選ぶし、SPZ 溶液 2.5 mg/mL ザイモリエイス 100 T コロニー PCR (図 1 H) の開始テンプレートとしてを実行するこのソリューションの少なくとも 30 分使用 1 μ L の 37 ° C で 10 μ L で孵化させなさい。<ol>
<li>15 mL の蒸留水 (最終 pH 7.5) 0.95 mL NaH2PO4 1 M Na2HPO44.05 mL 2 M ソルビトール 30 mL を混合することによって SPZ (50 mL) を作る。サンプル (5 mL) をザイモリエイスを補充し、使用するまで 500 μ 因数-20 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲル電気泳動 (1.2% の agarose のゲル、180 v、20 分) の結果 + コロニー PCR を視覚化するを実行します。適切なサイズの PCR バンドを展示、 Xhoと各反応生成物の 5 μ L を消化反応を選択 (4 U 酵素、1 x 消化バッファー、37 ° C の水浴、1 h) 偽陽性 (図 1 H) を選別する私。</li>
	<li>XhoIダイジェスト (1.2% の Agarose のゲル、180 V、20 分) を視覚化するゲルの電気泳動を行います。コロニー PCR 製品XhoI、によってカットされ、はい + G418 プレート (図 1I) それらをパッチをマークします。</li>
	<li>分裂酵母細胞から gDNA を分離し、PCR の製品23のシーケンスを実行します。(図 1I) の突然変異を識別するために野生型シーケンスで得られたシーケンスを比較します。</li>
	<li>直接融合構造変異細胞23から PCR によって増幅にそれらを変換することによって野生型細胞に遺伝を再導入します。スポッティング スコープを使用すると、新しく作られた突然変異体の細胞 (図 1 j) の表現型を確認できます。<ol>
<li>プライマー p1 と p10 簡単に融合変換コンス トラクター PCR によって増幅することができます (〜 1 μ g DNA、20 U 酵素反応バッファー x 1)、50 μ L の総ボリュームでテンプレートとして変異体のゲノム DNA を使用し、表 2 に記載されている反応サイクルを適用.コンス トラクターの変換は、7.1 7.13 の手順で行うことができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

エラーを起こしやすい PCR によってランダムな突然変異は、特定の地域の突然変異体の多様なプールを生成するための強力なツールです。この手法は、特定の状況下でのタンパク質の機能を査定しようとする研究の場合に特に便利です。たとえば、我々 はここヘテロクロマチン メンテナンスで、Rpt4、19 秒プロテアソーム サブユニットの機能を評価するためにエラーを起こしやすい PCR を使?...

順遺伝学は、研究者が特定の表現型を表示する自然発生する突然変異体を求めるし、遺伝学的解析を行う古典的な方法です。逆遺伝学の興味の遺伝子に突然変異を導入し、表現型を検討します。後者の場合、ターゲット遺伝子のランダムな変異は突然変異体感温性などの所望の表現型を選択、その後または酵素活性の変更のプールを生成するよく使用されます。エラーを起こしやすい PCR1を含むランダムな突然変異の誘発を達成するために様々 な方法を使用する場合があります。UV 照射2;亜硝酸3; メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学変異原物質mutD5 4の発現などの一時的なミューテーター系統の使用DNA シャフリング5。
ここでは、分裂酵母のターゲット遺伝子の突然変異体のプールを生成するエラーを起こしやすい PCR を利用逆遺伝学的方法をについて説明します。1 つは、その名前から推測かもしれない、この方法意図的に PCR の間にエラーが発生して突然変異を生成します。他の突然変異誘発の方法とは異なりエラーを起こしやすい PCR はある突然変異誘発する領域を定義するユーザーをことができます。これにより、目的のタンパク質/ドメインの機能を勉強する努力に特に役立ちます。
このランダム変異導入手順を示すためには、我々 ここrpt4 +を使用分 19 秒プロテアソームのサブユニットをエンコードし、例として。Rpt4 分裂酵母6,7,8,9, 以外の生物のタンパク質分解に依存しない機能を持っている示されている、タンパク質分解の欠陥の原因タンパク質を変えることによって間接効果レベル。我々 は、したがって、ヘテロクロマチンのプロテアソームの機能の調査の目標の分解に依存しない変更を引き起こした突然変異体のスクリーニングします。
エラーを起こしやすい PCR プライマーのバインド場所をチューニングすることによって遺伝子領域に適用できます。目的の表現型変更を示す変異体は、適切な記者と識別できます。ここでは、我々 は挿入、 ade6 +記者を利用、セントロメア 1 外側を繰り返す (otr) 地域10。11この地域では、構成のヘテロクロマチンを形成すると、野生型条件でade6 +記者を黙らせたのでこれは、赤色のコロニー10で示されます。動原体で構成のヘテロクロマチンを不安定化突然変異は、白人の植民地として可視化ade6 +記者、発現に します。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phthalate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Sodium molybdate dihydrate</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, geneticin</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Enzyme reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>For site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>For error-prone PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>For fusion PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&amp;nbsp;DNA Polymerase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>For general PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen square, black</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>For replica</td></tr><tr><td>Replica-plating tool</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>For replica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td><td>Biorad</td><td>1652086&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>For fusion PCR ramp reaction&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

ターゲット遺伝子のランダムな変異は、所望の表現型をもたらす突然変異を識別するために使用されます。ランダム変異導入を達成するために使用できるメソッドのエラーを起こしやすい PCR は突然変異体の多様なプールを生成するための便利で効率的な戦略 (すなわち。、変異ライブラリー)。エラーを起こしやすい PCR は、影響を受けない他のゲノム領域を残しながら遺伝子のコーディングの地域などの定義済みの領域の変異するように努める研究者選択の方法です。変異ライブラリーは、エラーを起こしやすい PCR によって増幅は後、に適切なプラスミド複製する必要があります。エラーを起こしやすい PCR によって生成されたライブラリのサイズは、クローン作成のステップの効率によって制限されます。ただし、分裂酵母、分裂酵母、クローン作成のステップは非常に効率的なワンステップ融合変換の構成要素を生成する PCR を使用して置き換えることができます。所望の表現型の変異体は、適切な記者を使用して選択できます。ここでは、我々 例、動原体ヘテロクロマチンに挿入されるレポーターとしてこの戦略を詳細をについて説明します。

以下の図 1に示した手順で取得した Rpt4 変異体は、コロニーの色を評価することによって分析できます。コロニーの色が図 2の細胞数の減少に関連するプレートに斑点を付けます。異質染色質領域に挿入ade6 +記者は、野生型の沈黙し、はい Ade プレートで赤色のコロニーを示しています。Ade6 +記者の表現をヘテ?...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s プロテアソームと不安定にする異質染色質の変異のためのスクリーンの亜単位を符号化します。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K ビュー.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s プロテアソームと不安定にする異質染色質の変異のためのスクリーンの亜単位を符号化します。

ビデオ: Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

遺伝学

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

生物学

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

酵母Proteinopathyモデルを用いた増強Hsp104のバリアントを分離

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

要約

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この動画の章

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発

ターゲットを絞りました

酵母の過剰発現の交尾ベースライブラリスクリーニング

分裂酵母分裂酵母のディープシーケンスアシスト、自発的な抑制画面

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

酵母Proteinopathyモデルを用いた増強Hsp104のバリアントを分離

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

指向進化方法で

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

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でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発

ターゲットを絞りました

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

酵母Proteinopathyモデルを用いた増強Hsp104のバリアントを分離

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

指向進化方法で

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

酵母の過剰発現の交尾ベースライブラリスクリーニング

分裂酵母分裂酵母のディープシーケンスアシスト、自発的な抑制画面

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で