The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.

LEDイルミの1建設注：必要なLED装置は、材料のリストにまとめられています。全体LEDセットアップは小さく、我々はそれがワーム4の露光量を制御するために、暗い部屋に置くことをお勧めしますが、ラボのどこにでも配置することができます。 <ol><li>ケーブル（ 図1A、D）でコントローラにLEDを接続します。 </li><li> BNCケーブルでデジタルファンクションジェネレータ/アンプ（ 図1A、C、D）にコントローラを接続します。 </li><li>カスタムホルダー（ 図1A）を使用して、ステージ上のLEDライト10センチ修正。 注：我々は、金属部品とホルダーを作りました。 </li><li>部分的にLED照明のセットアップをカバーしますが、ワームが病気になり、熱の蓄積（ 図1B）を 、避けます。 注：私たちは、オープントップとボトム（ 図1A）とのカスタムメイドのハードプラスチック製のカバーを使用します。カバーは、突然変異誘発、それ自体のために必要とされていませんが、トン使用されていますO周囲に青色光の不要な露出を制限。私たちは、ワームの過熱を防止するために、LEDセットアップ完全に（ 図1B）を覆わないように助言します。 </li><li>レーザー保護メガネを着用してください。 注：光は非常に明るいですので、私たちは、レーザー保護メガネを着用してください。サングラスも同様に動作する可能性があります。 </li><li> LEDコントローラのレバースイッチ」のIntを。」連続照明（ 図1D）および最大電力（ 図1C）の65％に設定します。 </li><li>ワームは、製造業者のプロトコルを使用して配置され、ステージ上の青色光の強度を測定するための光度計を使用してください。セットアップは、連続的な照明の下で2.0ミリワット/ mm 2とを与えます。 </li></ol> 2.ブルーライト治療注：[miniSOG-3&#39;UTR（TBB-2）:: Pmex-5-HIS-72 + CB-UNC-119（+）]株CZ20310 juSi164を使用して、UNC-119（ED3）III 4株が利用可能です。線虫遺伝学センター（CGCでは、http：//www.cgc.cbs.umn.edu/）。 <ol><li> E.と標準線虫の増殖培地（NGM）プレート上に暗闇の中のHis-mSOG株を維持標準プロトコル10,11以下の大腸菌 OP50。 注：周辺光の下では、juSi164含有株は自然発生率4以上の突然変異率を表示しません。ハロゲンランプと解剖スコープを使用してルーチン歪み通路は、一般的に、同様の突然変異を引き起こすことはありません。それにもかかわらず、注意が標準暗い内部のインキュベーター中で株を維持、またはホイルで株をカバーし、例えば 、光への不要な暴露を避けるために注意すべきです。不必要な変異は時間をかけて蓄積する場合には、それを受信した後、株のアリコートを凍結することをお勧めします。 </li><li>ワームに妊娠若年成人（約12時間後にL4）の動物を選んで11を選択します。 注：古い動物は低いひなサイズを有することができる若い動物は、より少ない変異原効果4を示します。 </li><li>フィルタpをカットAPERは25ミリメートル×25 mm角の穴が60ミリメートルプレートに適合し、播種していないプレート（ 図1E）上に配置します。 注：正方形のパンチを使用することができるが、パンチの大きさが正確である必要はありません。 </li><li>プレート上の四角い穴の中にワームを制限するために均等にろ紙上の100mMのCuCl 2の100μLをドロップします。 </li><li>妊娠若年成人雌雄同体の所望の数を選択してください（例えばステップ3を参照）とのCuCl 2板の中央に移します。 </li><li>レーザー保護メガネを着用してください。 </li><li> LEDとファンクション・ジェネレータをオンにします。 </li><li> LEDコントローラのレバースイッチの内線を。」関数発生器（ 図1D）によってそれを制御します。 </li><li>最大電力の65％で、コントローラおよび正弦波、4ヘルツ（ 図1C）などのファンクション・ジェネレータを設定します。 </li><li> &lt;LEDの下にステージ上で蓋をせずにステップ2.5からのCuCl 2プレートを置きます （ 図1A/強いです&gt;）。 </li><li> 30分間の青色光で動物を照らします。 </li><li> P 0としてシードのプレートに健康探してワームを転送します。 注：P 0の所望の数が画面の種類によって異なります。例えば、ステップ3を参照してください。 P 0のワームは、光処理後すぐに調整されていないように見えることがあり、時間の経過とともに回復します。 </li><li>インキュベーター内または暗闇の中で箔を使用して覆われたワームをキープ。そしてそれらの子孫2,10の間で希望の表現型をスクリーニングを開始するための標準的な手順に従ってください。 </li></ol>前方遺伝画面の3例注：これはLEDや歪みが機能しているかどうかを確認するために120半数体ゲノムを有するクローン画面の例である図2は、手順の概略を示しています。 <ol><li> 【1日目】青色光処理後、P 0としてOP50とNGMプレート上に5人の健常探してワームを選ぶ20℃のインキュベーターでそれらを維持し、それらを1産卵しましょうD（「1日目」板）。 </li><li> [2日目]新しいシードされたプレート上に転送P 0（ &#39;2日目」板）。 </li><li> [3日目]、それらを燃焼させることによって「2日目」板にP 0を選択し、殺します。 </li><li> 【Day4] &#39;1日目」のプレートから30産卵期の若い成人F 1を選択し、個々のプレート（&#39; 1日目」の30 F 1プレート）上に転送します。 </li><li> 「2日目」板用【Day5]を繰り返し、ステップ3.4（「2日目」の30 F 1のプレート）。 </li><li> 【Day7-9]彼らが大人になる、標準的な実体顕微鏡下でのWT株（ 図3A）と比較して、異常な形態および/またはF 2ワームの動作を確認してください。 注：それは高い浸透と劣性であるF 2間で同じ表現型を持つワームの約四分の一遺伝変異が表示されます。しかし、いくつかの変異体は、ゆっくりと成長および/または部分的な浸透度を示すことができます。したがって、変異体未満の四半期に見つけることができる可能性がありますプレート。 </li><li>個別に見える表現型とワームを選択し、次の世代の表現型の遺伝を確認してください。 </li></ol>体外導入遺伝子の統合の4例<ol><li> [72 Pmex-5-HIS-:: miniSOG-3&#39;UTR（TBB-2）+ CB-UNC-119（+）] CZ20310 juSi164への関心のDNAを注入し、UNC-119（ED3）とを有するトランスジェニックワームを準備標準的な注入プロトコル12,13以下の低透過率（10〜30％）。 注：別の方法として、確立された染色体外アレイはjuSi164株に交差することができます。 juSi164ための遺伝子型決定を回避するために、juSi164ヘテロ接合体は、効率が低下する可能性があるが、P 0として使用することができます。 juSi164ための遺伝子型決定方法は、第5章で説明されています。 </li><li> [1日目]ステップ2で説明したように青色光とP 0として〜20トランスジェニック動物を扱います。 注：詳細P 0のワームは、TRに応じて必要とされます<html> ansmission率。導入遺伝子は、表現型または共射出マーカー12,13によって同定することができます。 </li><li> 、個々のプレート上に10 P 0探して健康を選んで20℃のインキュベーターでそれらを維持し、それらを（P 0プレート）数日間卵を産むしましょう</li><li> 【Day4]シングルアウト20トランスジェニックF 1個々のプレート上に各P 0のプレートからワーム、彼らは卵を産むしましょう。 （20 F 1×10 P 0プレート=合計で200 F 1プレート。） </li><li> 【Day7] Fを&gt; 75％のF 2を有する導入遺伝子を持つ1プレートを検索します。 </li><li> &gt; 75％の透過率F 1プレート（F 2板）から5トランスジェニック動物を選択してください。 </li><li> 【Day10]潜在的な統合されたラインとして100％の透過率とF 2のプレートを保管してください。 </li><li>メンデル分離を確認し、潜在的なバックグラウンドの変異を削除するには、標準的な手順10を使用して、潜在的な統合された行を異種交配。 </li></ol>ル &quot;&gt; 5。ジェノタイピング<ol><li>溶解20は、標準的なプロトコル14を使用して、溶解緩衝液中F 2ワームを外部交配しました。 </li><li>標準プロトコル14以下の58℃のアニーリング温度でMosSCI挿入9、juSi164、（ 表1）のためのプライマーを用いてPCRを行います。 注：UNC-119（ED3）は、次のステップ5.4および5.5に救出導入遺伝子（juSi164）を除去した後、非協調行動によって検出することができるので、UNC-119（ED3）の遺伝子型が不要です。 </li><li>アガロースゲル電気泳動15を実行し、juSi164ためのWTを見つけるために、バンドのサイズ（ 表1）を調べます。 </li><li> F 2子孫は、UNC-119（ED3）の存在にワームを麻痺しているかどうかを調べます。 </li><li>非協調ワームはステップ5.4で発見された場合は、1つのいくつかのnonuncoordinatedワームは、次の世代内のすべてのnonuncoordinatedワームを取得します。 </li></ol>

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C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> J Vis Exp. (82), (2013).</li><li>Lin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+inhibition+of+synaptic+release+with+chromophore-assisted+light+inactivation+(CALI).">Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI).</a> Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).</li><li>Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. 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The authors have nothing to disclose.

ここで、我々は彼の-mSOGを使用して、光遺伝学の突然変異誘発の詳細な手順を説明する生殖細胞系列で発現し、小規模前方遺伝画面の例を提供します。標準的な化学的突然変異誘発と比較して、この光遺伝学突然変異誘発方法は、いくつかの利点を有します。第一に、それによって離れて、このようなEMS、ENUなどの有害化学変異誘発物質からラボの人材を維持し、紫外線（TMP / UV）とトリメチ...

フォワード遺伝子スクリーニングは、広くそのような線虫（C.エレガンス）1などのモデル生物において様々な生物学的プロセスを破壊する遺伝子変異体を生成するために使用されてきました。このような変異体の分析は、機能的に重要な遺伝子およびそれらのシグナル伝達経路1,2の発見につながります。 C.で伝統的に、突然変異誘発エレガンスは、変異原性化学物質、放射線、またはトランスポゾン2を用いて達成されます。このようなメタンスルホン酸エチル（EMS）とN -エチル- Nの -nitrosourea（ENU）などの化学物質がヒトに対して毒性があります。ガンマ線または紫外線（UV）放射線変異誘発特別な装置を必要とします。そして、このような突然変異誘発株3、などのトランスポゾン活性株は、保守時に不必要な突然変異を引き起こす可能性があります。我々は遺伝的にコード光増感剤4を用いて、遺伝的変異を誘発するための簡単なアプローチを開発しました。 活性酸素種（ROS）DNA 5に損傷を与えることができます。ミニ一重項酸素発生器（miniSOG）がLOV（光、酸素、及び電圧）2 6フォトトロピンシロイヌナズナのドメインから設計された106個のアミノ酸の緑色蛍光タンパク質である。青色光（〜450 nm）のに曝されると、miniSOG ROSは、すべての細胞に存在する補因子6-8としてFL AVINモノ、と一重項酸素を含む生成されます。我々は、ヒストン-72、CのC末端にminiSOGをタグ付けすることによって彼の-mSOG融合タンパク質を構築しましたヒストン3のエレガンス変異体は、私たちはCの生殖細胞系列に彼-mSOGを表現するために単一コピーの導入遺伝子9を生成しましたエレガンス。暗闇の中で、通常の培養条件の下では、彼の-mSOGトランスジェニックワームは、通常のひなのサイズと寿命4を持っています。青色LEDの光に曝されると、彼の-mSOGワームは、それらの子孫4間の遺伝的変異を生成します。誘導された突然変異のスペクトルは、Gなどのヌクレオチド変化を含む：TからC：AとG：CからC：G、および小chromoso私は4を欠失。この突然変異誘発手順は実行が簡単で、かつ最小限のラボの安全設定が必要です。ここでは、LED照明のセットアップと光遺伝学突然変異誘発のための手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>Ultra High Power LED light source</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-mic-LED-460</td><td>460 &amp;plusmn; 5 nm</td></tr><tr><td>LED controller</td><td>Prizmatix</td><td>UHPLCC-01</td><td></td></tr><tr><td>Digital function generator/amplifier</td><td>PASCO</td><td>PI-9587C</td><td>PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.</td></tr><tr><td>BNC cable male/male</td><td>THORLABS</td><td>CA3136</td><td></td></tr><tr><td>USB-TTL interface</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>Optional</td></tr><tr><td>Photometer</td><td>THORLABS</td><td>PM50 and Model D10MM</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate</td><td></td><td></td><td>Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 &amp;micro;g/mL cholesterol in 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. After autoclaving, add 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(pH 6.0).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis solution</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 100 &amp;micro;g/mL Proteinase K</td></tr></tbody></table>

optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

私たちは8 F 1のプレートを見つけ、120変異誘発半数体ゲノムに対応する60 F 1のプレートのうち、第2条及び3に記載されている標準的なプロトコルに従って、30分間の露光を用いて、（ED3）CZ20310 juSi164 UNC-119とフォワード遺伝学的スクリーニングを行いましたこのようなボディサイズの欠陥（ 図3B）、非協調運動（ 図3C）、...

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C. elegans における Histone-miniSOG を用いた光遺伝学的ランダム突然変異誘発 |遺伝学 |ビデオ

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

遺伝的にコードされたヒストンminiSOGは、青色光依存的にゲノムワイドな遺伝変異を誘発します。この突然変異誘発法は、高速で、単純な有毒化学物質の自由、およびフォワード遺伝子スクリーニングおよび導入遺伝子組込みに適しています。

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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9.0K ビュー.  University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute. 遺伝的にコードされたヒストンminiSOGは、青色光依存的にゲノムワイドな遺伝変異を誘発します。この突然変異誘発法は、高速で、単純な有毒化学物質の自由、およびフォワード遺伝子スクリーニングおよび導入遺伝子組込みに適しています。 

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Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

遺伝学

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

発生生物学

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

神経科学

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

ワームの研究室の紹介：培養ワームから変異へ

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

生物学

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

RNAi Feeding in Liquid Culture: A High-Throughput Method to Knockdown Gene Expression in C. elegans

Source: Groh, N. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/56464/methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age">Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in&#160;Caenorhabditis elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017).
RNAi is powerful genetic tool available to C. elegans researchers. This video introduces a method to treat more worms with RNAi than plate feeding by utilizing liquid culture conditions.

液体培養におけるRNAiフィーディング:C.エレガンスにおける遺伝子発現をノックダウンするためのハイスループット法

Source: Groh, N. et al. Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017).
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でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発

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分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

ワームの研究室の紹介：培養ワームから変異へ

イメージング C.エレガンス胚

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

液体培養におけるRNAiフィーディング:C.エレガンスにおける遺伝子発現をノックダウンするためのハイスループット法