Name: high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
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この作品は、J.C.S.B. にユタ大学の病理からのスタートアップ助成金によって支えられました。

1. 重複2法 (O2M) による化学遺伝学データセットから相乗効果予測の突然変異を識別します。
注: これはニコルズらから公開されたデータセットを使用したシナジー予測変異を識別する方法です。17 大腸菌。ただし、これは任意の化学遺伝学データセットや微生物を行うことができます。これらのデータ セットには、各変異体それぞれの小さな分子の量的成長スコアを与える以上 100 の小さな分子の存在下で成長してノックアウト変異のライブラリが含まれています。知られなければ 1 つ相乗ペアと、データセットに含まれる両方の小さい分子の成長スコアする必要があります。
<ol><li>
各小分子の単一濃度の存在下で成長してすべての突然変異体の平均成長スコアと標準偏差を計算します。 メモ: これは実行することができます、スプレッドシート ソフトウェアを使用します。ブラウンの実験室を使用して、Excel や関数 =AVERAGE(B3:B3981) および小分子の各列の計算のための =STDEV(B3:B3981)。<ol>
<li>別のデータセットを使用している場合、この方向が異なる可能性がありますが、手段と小分子の各列からの標準偏差を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>・ ニコルズらから同じデータセットを使用した小分子の各濃度の Z スコアを計算します。スプレッドシート プログラムで17 。このため、負の z スコアになります Z(2.5) = 意味 - 2.5 * 標準偏差と正の z スコア Z(2.5) になります = 平均 + 2.5 * 標準偏差。</li>
	<li>遺伝子変異体を含むそれらの分子のすべての濃度を確認されている既知の相乗ペアを作る小さな分子で重要な Z スコアを決定します。否定的な Z (2.5) 未満の変異体のスコアは、成長スコアまたはその小さな分子のための肯定的な Z (2.5) のスコアをより大きく、重要なと見なされます。</li>
	<li>オペロンに属している重大な遺伝子変異体のいずれかを決定します。 注:エシェリヒア属大腸菌、著者チェックお勧めします「Ecoli wiki」の情報について遺伝子がコードする RNA の一部として書き換えられます。</li>
	<li>異なる濃度で興味の小さい分子の大部分に共通する遺伝子/オペロン変異体を特定 (e.g抗生物質のトリメトプリムと相乗作用分子を識別する重要な Z を示す変異体を探しているとき、。スコア トリメトプリムとスルファメトキサゾールなど sulfamethizole 知られている相乗パートナーの存在下で育てられたとき)。これらは推定上シナジー予測変異体です。</li>
</ol>2. O2M によって化学遺伝学データセット内の Synergizers の予測
<ol><li>データセット17に戻ると、シナジー予測突然変異体から大きな成長スコアを引き出す小さな分子の各濃度を特定します。これは、Z スコアの小さい分子の各濃度の計算を見ることによって行われます。もう一度、大きな成長スコアは小分子の濃度の正の Z スコアを超える負の Z スコアよりも小さいかです。 注: 分子は、1 つでもその濃度に表示されている場合は、予測 synergizer が分子で見なされます。大きな成長スコアは発生しませんすべての分子は、予測非 synergizer です。</li>
</ol>3. 予測の相乗作用の検証
<ol><li>予測 synergizers の最小発育阻止濃度 (MIC) を見つけます。
	<ol>
<li>M9 最小媒体を 37 ° C での大腸菌の一晩の文化を育てる 注: 任意の一晩の文化は興味の有機体のための適切に定義された媒体で栽培できます。ブラウンの実験室では、LB や YPD のようなリッチ メディアは推奨しません。M9 最小媒体で構成される 10.5 g/L M9 スープ 0.2% カザミノ酸、0.1 M CaCl20.4% グルコース、1 M MgSO40.25% ニコチン酸 0.33% チアミン H2o.</li>
		<li>MIC データの関心の病原体は小分子を受け取ったら文学溶解する場合ないジメチルスルホキシド (DMSO) で高濃度 (> 10 mg/mL)。</li>
		<li>96 ウェル プレートで、M9 媒体の 100 μ L を各ウェルに追加します。200 μ L の合計が含まれていますので、M9 媒体の余分な 100 μ L を列 1 に追加します。</li>
		<li>1 列目の集中の小分子ソリューションの任意の量 (~ 10 μ L) を追加します。列 1 (プレートごと 8 小分子) の井戸あたり 1 つの小さい分子。 注: これらは相乗効果と予測されている関心の小さな分子です。ブラウンの実験室は一般に大腸菌を抑制することができます 100 %dmso 量以下である高濃度低分子溶液 10 μ L を追加します。</li>
		<li>小さな分子を追加すると、プレートの x 軸では小分子を希釈します。1 列からソリューションの 100 μ L を取る、2 列の配置し、混ぜます。列 2 から 100 μ L を取るの 3 列配置し、混ぜます。100 μ L は 11 の列に配置されるまで、このプロセスを続けます。ミックス 11 列、その列から 100 μ L を取るし、破棄します。データを正規化するだけのメディアで 12 列をまま。</li>
		<li>プレートを接種します。一晩かけて培養から光学濃度 (OD600) を取得します。文化と 0.002 の OD600 M9 メディア ソリューションを準備 (または興味の目的の有機体のための 500 細胞/μ L を表す濃度を適切な)。ウェルあたり 1000 個の細胞がありますので、プレートの各ウェルに培養液 2 μ L をピペットします。</li>
		<li>優しくプレートを振るし、読んで 0 h の OD600を取得します。24 時間取得を読んで 24 時間外径600の 37 ° C で成長板ができます。 注: 適切な関心を持つ他の有機体の条件を成長しています。</li>
		<li>よくスプレッドシート プログラムを使用してそれぞれの純成長率を計算します。</li>
		<li>取得平均ない薬成長する 12 柱の純成長率を平均します。スプレッドシート ソフトウェアを使用していない薬剤成長のなかに他の井戸を正規化します。10% 未満で、よく探して、MIC90 を識別するために成長します。50% 未満でも成長を示します、MIC50。これらの井戸で小さな分子の濃度を計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>相乗作用の市松模様の試金
	<ol>
<li>前に、として M9 最小媒体のエシェリヒア属大腸菌の一晩の文化を育てます。 注: 適切な成長する他の有機体のための条件。</li>
		<li>M9 媒体の 100 μ L を各ウェルの 96 ウェル プレートと 1 列目の余分な 100 μ L に追加します。</li>
		<li>テスト小分子を追加 (~ 8 時マイク x) 各列 1 でよく、濃度 2 倍を追加 (~ 16 マイク x) も A1 に (1 つの小さな分子テスト プレートごと)。 注: この金額マイク テスト完了前から決定され、それぞれの潜在的な synergizer は異なります。</li>
		<li>X 軸の列 1 から 100 μ L を取り、列 2 に転送することによってグラデーションの希釈を作成します。11 列に 100 μ L を追加するまで、このプロセスを続けます。ミックス、列 11 から 100 μ L を取るし、処分します。12 (図 1 a) の列に任意の薬物を追加しないでください。</li>
		<li>入力の薬を y 軸に 2 つ目の薬のグラデーションを設定します。A. ミックスの行入力分子のマイクと行 A および B. 続行に 100 μ L が g. ミックスの行に配置されるまでを置くことから前に、希釈として、100 μ L x 2 を含むメディアの 100 μ L を追加、100 μ L と dispose をように行秀の任意入力の薬剤を追加これにより、H の行と列 (図 1 b) テスト薬ペアの個々 のマイクを含む 12。</li>
		<li>プレートを接種します。外径600 0.002 の大腸菌培養の 2 μ L を各ウェル (ウェルあたり 1,000 セル) に追加します。</li>
		<li>0 h 読書用プレートの各ウェルの OD600を測定します。</li>
		<li>37 ° C で 24 時間のプレートを孵化させなさい</li>
		<li>24 h での OD600を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>チェッカー ボードから小数の発育阻止濃度指数 (FICI) を計算します。
	<ol>
<li>スプレッドシート プログラムで 24 h で OD600 0 h 外径600を減算することによって、プレートの各ウェルの純成長率を計算します。</li>
		<li>除して各も H12 は、小分子が含まれていないソフトウェアの成長を正常化します。</li>
		<li>12 欄入力分子の MIC90 と行英に潜在的なレチノイドシナジストの MIC90 を見つける</li>
		<li>90% の成長を阻害するすべての井戸を探します。</li>
		<li>いずれか最も低い (相乗) 以下よくのため FICI90 を計算または最高 (拮抗) 上記方程式を使用して、両方の MIC90 値。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>任意 FICI ≤ 0.5 として相乗効果を検討、FICI ≥ 4 拮抗 (図 2)。 注: これも行えます MIC50 と (成長の 50% 阻害) それらの MIC の値に基づいて、FICI50 を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>ブリス独立アッセイ 注: 至福の独立は、独自に、マイクを持っていなかったすべての潜在的なレチノイドシナジストが実行されます。<ol>
<li>37 ° C で M9 媒体のエシェリヒア属大腸菌の一晩文化を前に成長します。 注: 再度、関心を持つ他の有機体の適切な成長条件使用できますこの手順で。</li>
		<li>潜在的な相乗的分子、入力分子、組み合わせ、および無処理コントロール テストの 96 ウェルのプレートを準備します。</li>
		<li>M9 媒体の 50 μ L を各ウェルに追加することによって潜在的なレチノイドシナジスト プレートを作成します。行の各ウェルに、潜在的なレチノイドシナジストの設定濃度 (10 μ M または 100 μ M) を含むメディアの 50 μ L を追加します。プレートごと 8 分子をテストします。</li>
		<li>メディアの 50 μ L を各ウェルに追加することによって入力分子プレートを作成します。4 x を含む 50 μ L を追加 1 列目のウェルに入力薬剤の MIC。マイク板、列 1 から 50 μ L を取り、分散、2 カラムで混合する x 軸に沿ってグラデーション希釈を作成します。列、12 列 12 から 50 μ L を破棄までこのプロセスを続行します。各ウェルの最後の合計は 100 μ L 各ウェルにメディアの追加の 50 μ L を追加します。</li>
		<li>96 ウェル プレートを使用したコンビネーション プレートの作成、メディアの 50 μ L を各ウェルに追加します。4 x を含む 50 μ L を追加 1 列目のウェルに入力薬剤の MIC。X 軸のマイク プレート、列 1 から 50 μ L を取り、分散、列 2 の混合のように希釈します。これは列、12 列 12 から 50 μ L を破棄に全体の方法を続けます。10 μ M または行の各ウェルに 100 μ M で潜在的なレチノイドシナジストを含むメディアの 50 μ L を追加します。もう一度、1 つの濃度または行ごと薬する必要があります。</li>
		<li>無処理コントロールを作成するには、プレートのすべての井戸に M9 媒体の 100 μ L を追加します。</li>
		<li>前に各同様に 0.002 や 1000 個の細胞の OD600細菌培養の 2 μ L を追加することによってすべてのプレートを接種します。</li>
		<li>0 から 24 h での OD600を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>至福の独立性スコアを計算します。
	<ol>
<li>スプレッドシート プログラムを使用して 24 h に成長から 0 h 外径600を減算することによって、プレートの各ウェルの純成長率を計算します。</li>
		<li>スプレッドシート プログラムでない薬板から平均成長率に井戸を正規化します。</li>
		<li>表計算ソフトを使用して、1 から純増を差し引くことによって阻害を計算します。</li>
		<li>表計算ソフトで入力のグラデーションのみを含む制御板の列を平均します。</li>
		<li>式により各ウェルのブリス スコアを計算します。 至福のスコアも X を組み合わせる- (よく X + 入力列 X) =
</li>
		<li>入力の MIC90 の下の井戸で負のスコアを探してください。 注: 複数の濃度間で負のスコアの相乗作用を示します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 高スループット画面新規相乗ペアを識別するシナジー予測変異
<ol><li>
シナジー予測変異体を特定します。 注: ステップ 1.5 には、推定されるシナジー予測変異が識別されます。ここでは、相乗効果の薬剤のための高スループット画面で最高機能するこれらの変異体を決定します。Bioscreen マシンでこのアッセイを行ったが、96 well プレート リーダーは許容する必要があります。<ol>
<li>各推定シナジー予測変異体と野生型細胞 M9 最小媒体を成長します。</li>
		<li>100 の設定も適切な成長媒体、成長培地 + 入力薬、成長培地 + 入力薬物と成長培地 + 知られていた非相乗薬剤知られている相乗パートナー プレート (または 96 ウェル プレート) をハニカムします。車両のコントロールを含めることを確認します。 注: 各ひずみ/薬/集中のための井戸を複製 4 をお勧めします。</li>
		<li>まあ、空白制御井戸を含むあたり 1000 個の細胞を接種します。</li>
		<li>37 ° c、振動、48 h を成長し、OD600 20 分毎を読みます。</li>
		<li>予測入力の薬と知られている相乗パートナーの存在下で変異細胞に野生型との相乗効果の最大の成長の違いを示す薬物濃度と時間のポイントを決定します。最適な時点で濃度、べきである多く成長違い野生型と相乗効果予測変異細胞 (図 3) の入力の薬物と相乗的行動に知られている薬の存在下で成長しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
相乗効果の薬剤のための高スループット画面
	<ol>
<li>野生型細胞とシナジー予測変異細胞 M9 最小媒体を成長します。 注: は、関心の有機体の適切な成長媒体を使用します。</li>
		<li>ライブラリからメディアにそれぞれを前の手順で設定濃度で低分子 100 μ L メディアが含まれる薬を追加します。(セル) を持たない空井戸などの車両コントロールと井戸 (e.g。、DMSO) 薬剤希釈車両によって任意の成長の抑制を考慮します。<ol>
<li>プレート、よく位置の影響を考慮して板に理想的に散在しているあたり、少なくとも 4 つの車両制御井戸を準備します。試金は変数である場合、行/列あたりも、少なくとも 1 つの車両の制御を含めるし、全体板 (ステップ 4.2.5) の代わりに各の行/列の Z スコアを計算するコントロールとしてよく行/列の各コントロールを使用します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>前に各同様に文化の 2 μ L を追加します。(野生型細菌と予測シナジー変異バクテリア用プレート 1 枚用プレート 1 枚)。</li>
		<li>クリプトコッカスに対する 0 と 18 h大腸菌または 48 h で OD600を評価します。</li>
		<li>表計算ソフトを使用して、車両制御井戸から空白の井戸の OD600を引いて純成長率を計算します。Z スコアが-2.5 の井戸を識別 (Z スコア = 平均 - 2.5 * 標準偏差)。これらの井戸には、潜在的なレチノイドシナジスト小分子が含まれています。</li>
		<li>手順 3 で説明した方法を使用して画面のヒットを検証します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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相乗効果の小さい分子のペアは、微生物感染症の治療に強力なツールをすることができますまだ彼ら相乗ペアが識別するために挑戦的なのでその完全臨床的可能性に達していません。本稿では、シンプルなペアの組み合わせよりもはるかに高速の相乗組み合わせを識別するためのメソッドについて説明します。化学遺伝学データセットを使用して、O2M は相乗的組み合わせを予測するために小...

抗生物質耐性菌は、1CDC によると米国の毎年以上 200 万感染症や 23,000 の死を引き起こします。新しい治療法は、これらの感染症を克服するために必要です。これらの新しい治療法を特定する戦略には、新しい抗菌薬の開発や小さな分子微生物感染症2,3、4を治療するために他の条件のために承認の転用が含まれます。しかし、新しい薬剤の発見は非常に高価な時間のかかるです。新薬を識別できないことがあります薬を転用または薬剤ターゲット5,6。私たちの研究室は、相乗的組み合わせ療法として知られている 3 番目の戦略について説明します。相乗的な組み合わせは、2 つの小さい分子は一緒に彼らの個々 の効能7の添加効果より大きい薬効を持つ場合に発生します。さらに、相乗的な組み合わせすることができますレンダリングすること偉大な潜在的な8,9、以下の不要なオフターゲット効果だけでなくペアの小さな分子のいずれかに耐性病原体に対して有効であります。 10。
相乗ペアは、薬物の組み合わせ11,12,13の約 4-10% に発生するまれな。このように、ペアワイズ画面などの伝統的な技法、挑戦的な 100 分子の小さなライブラリからの潜在的な組み合わせの何千もの時間がかかる。さらに、相乗作用通常予測できない化合物14の活動から。ただし、相乗的組み合わせは、重複2メソッド (O2M)12と呼ばれる画面に高スループットのアプローチを開発しました。このメソッドは、ここで説明はこれらの相乗のペアをより速くより効率的な識別するためことができます。O2M は、知られている相乗ペアと化学遺伝学データセットの使用を必要とします。ノックアウト変異体のライブラリは、多くの異なる小さな分子の存在下で育てられたとき、化学遺伝学データセットが生成されます。その同じ突然変異体の表現型を引き出す他の小さな分子が既知の各メンバーと相乗効果も知られている相乗ペアで 1 つの分子が 2 番目の相乗的分子として特定ノックアウト変異体から同じ表現型を引き起こす場合相乗のペア。この根拠は、相乗抗生物質ペアエシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)に対してアクティブと病原性の真菌クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス(c. に対してアクティブな相乗的抗真菌薬のペアを識別するブラウンの実験室で使用されていますネオフォルマンス)11,12。O2M は様々 な病原体に適応できるだけでなく、分子の大規模なライブラリのスクリーニングは、簡単かつ迅速に相乗のペアを識別します。O2M によって識別される遺伝的変異スクリーニングの相乗効果の予測小さな分子のみを検証することができます。したがって、あった場合のみ 20 分子の相乗効果を予測したライブラリで、今相乗効果の試験日の問題を受け取る一方で、2,000 分子ライブラリーのペアワイズ テストと、月がかかるでしょう。O2M は、プログラミングスキルは不要、必要な機器はほとんどのラボや中核施設で利用可能です。薬の組み合わせに興味がある研究者に加えて O2M 分析薬物画面が完了し、重要な薬物相互作用を識別することによって彼らのヒット曲を拡大したい人誰にも興味深いものです。以下、細菌、相乗効果の小さい分子を識別するだけでなく、よく知られている試金15,16の予測の相乗作用を検証するプロトコルです。

<table><tbody><tr><td>Bioscreen C</td><td>instrument</td><td>Growth Curves USA</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1</td><td>instrument</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>M9 broth</td><td>reagent</td><td>Amresco</td><td>J863-500G</td></tr><tr><td>Casamino Acids</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-500</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>reagent</td><td>Sigma</td><td>G7021-10KG</td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>reagent</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12683</td></tr><tr><td>Thiamine</td><td>reagent</td><td>Acros Organics</td><td>148991000</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Dihydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;Heptahydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td></tr><tr><td>chemical-genetics dataset</td><td>dataset</td><td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td><td></td></tr><tr><td>trimethoprim (example input drug; any can be used)</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19552701</td></tr><tr><td>sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15671125</td></tr></tbody></table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

抗菌薬は20 世紀に劇的に寿命や生活の質を増加している、抗菌薬耐性は、全身性の感染症を治療するために私たちの社会全体の能力を脅かしています。単独で米国で抗生物質耐性感染症は年とコスト追加医療で約 200 億米ドル約 23,000 人を殺します。抗菌薬耐性に対処する方法の 1 つは療法前に感染源の生物とその薬剤耐性プロファイルが確認されている感染症の重要な初期段階で特に有用であります。多くの抗菌薬治療は併用療法を使用します。しかし、これらの組み合わせのほとんどは、添加剤、結合された効果は個々 の抗生物質の効果の合計と同じであることを意味します。いくつかの併用療法は相乗効果: 結合された効果は添加物よりもはるかに大きい。相乗的な組み合わせは、抗菌薬耐性菌の成長を抑えることができますので特に便利です。ただし、これらの組み合わせが珍しいとを識別することは困難です。これはペアの方法でテストするために必要な分子の膨大な数によるもの: 1,000 分子のライブラリには 100 万の潜在的な組み合わせ。したがって、相乗効果のための分子を予測する努力がされました。この資料では、重複2法 (O2M) として知られている小分子で相乗ペアを予測するための私たちの高スループット方法について説明します。O2M が過敏相乗ペアの各分子が他の分子に変異を識別するのに化学遺伝的データセットのパターンを使用します。ブラウンの実験室は、変異がない野生型の細胞の増殖を抑制する分子の高スループットの画面を実行することによってこの成長の違いを悪用します。ラボの仕事は、以前抗生物質のトリメトプリムと抗真菌薬のフルコナゾールこの戦略を使用して相乗効果の分子を識別されます。著者らは、複数の微生物のため変更することができます新しい相乗的な組み合わせの方法画面を紹介します。

市松模様の試金は、相乗作用を測定するための半定量的方法です。出力の最終的なスコア、FICI、決定薬の組み合わせ相乗 (FICI ≤0.5) を考えると、非相互作用 (0.5 < FICI < 4)、または拮抗 (FICI ≥4.0)。図 1は、市松模様のアッセイで薬物グラデーションを設定する方法を示しています。図 2は、一般的な結果を示しています。90% ...

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

相乗効果の薬剤の組み合わせは難しいと経験的に識別するために時間がかかるです。ここでは、識別し相乗小分子を検証する手法について述べる。

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.6K ビュー.  University of Utah. 相乗効果の薬剤の組み合わせは難しいと経験的に識別するために時間がかかるです。ここでは、識別し相乗小分子を検証する手法について述べる。

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Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

抗がん剤抗体抗悪性腫瘍薬による効果の増強: 組み合わせインデックス式を用いた抗体医薬の相乗作用の検出

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

がん研究

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of both synthetic lethal interactors leads to loss of cell viability or cell death. The best studied synthetic lethal interaction is between BRCA1/2 and PARP1, with PARP1 inhibitors being used in clinical practice to treat patients with BRCA1/2 mutated tumors. Large genetic screens in model organisms but also in haploid human cell lines have led to the identification of numerous additional synthetic lethal interaction pairs, all being potential targets of interest in the development of novel tumor therapies. One approach is to therapeutically target genes with a synthetic lethal interactor that is mutated or significantly downregulated in the tumor of interest. A second approach is to formulate drug combinations addressing synthetic lethal interactions. In this article, we outline a data integration workflow to evaluate and identify drug combinations targeting synthetic lethal interactions. We make use of available datasets on synthetic lethal interaction pairs, homology mapping resources, drug-target links from dedicated databases, as well as information on drugs being investigated in clinical trials in the disease area of interest. We further highlight key findings of two recent studies of our group on drug combination assessment in the context of ovarian and breast cancer.

Large genetic screens in model organisms have led to the identification of negative genetic interactions. Here, we describe a data integration workflow using data from genetic screens in model organisms to delineate drug combinations targeting synthetic lethal interactions in cancer.

合成致死的相互作用を対象とした薬剤の組み合わせを特定するためのデータ統合ワークフロー

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in glioblastoma (GBM), the most prevalent and devastating primary brain tumor. The presence of GSCs makes the GBM very refractory to most of individual targeted agents, so high-throughput screening methods are required to identify potential effective combination therapeutics. The protocol describes a simple workflow to enable rapid screening for potential combination therapy with synergistic interaction. The general steps of this workflow consist of establishing luciferase-tagged GSCs, preparing matrigel coated plates, combination drug screening, analyzing, and validating the results.

患者由来グリオーマ幹細胞を用いたGBMの潜在的併用療法を同定するための迅速スクリーニングワークフロー

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens are performed on cells grown in a monolayer. However, these two-dimensional (2D) models are considered less accurate compared to three-dimensional (3D) spheroid cell models; this is especially true for glioma stem cell lines. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening of spheroid lines; mouse and human glioma stem cell lines are used as an example. This protocol describes a 3D spheroid drug sensitivity and synergy assay that can be used to determine if a drug or drug combination induces cell death and if two drugs synergize. Glioma stem cell lines are&#160;modified to express RFP. Cells are plated in low attachment round well bottom 96 plates, and spheres are allowed to form overnight. Drugs are added, and the growth is monitored by measuring the RFP signal over time using the Incucyte live imaging system,&#160;a fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator. Half maximal inhibitory concentration (IC50), median lethal dose (LD50), and synergy score are subsequently calculated to evaluate sensitivities to drugs alone or in combination. The three-dimensional nature of this assay&#160;provides a more accurate reflection of tumor growth, behavior, and drug sensitivities in vivo, thus forming the basis for further preclinical investigation.

In vitro drug sensitivity screens are important tools for discovering anti-cancer drug combinations. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening for spheroid lines.

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

免疫・感染学

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The goal of computational methods for drug repurposing is to enable solutions for safer, cheaper and faster drug discovery. Towards this end, we developed a novel method that integrates genetic and clinical phenotype data from large-scale GWAS and PheWAS studies with detailed drug information on the concept of transitive Drug-Gene-Disease triads. We created "RE:fine Drugs," a freely available, interactive dashboard that automates gene, disease and drug-based searches to identify drug repurposing candidates. This web-based tool supports a user-friendly interface that includes an array of advanced search and export options. Results can be prioritized in a variety of ways, including but not limited to, biomedical literature support, strength and statistical significance of GWAS and/or PheWAS associations, disease indications and molecular drug targets. Here we provide a protocol that illustrates the functionalities available in the "RE:fine Drugs" system and explores the different advanced options through a case study.

Here we describe a protocol using the web-based drug repurposing hypothesis generation tool: "RE:fine Drugs." This protocol can be modified to a user's preferences at the level of the query type (gene, drug or disease) and/or the range of available advanced options.

薬物転用仮説生成の使用」RE：罰金薬「システム

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

医学

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカー ボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

生物学

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

任意の数の薬のメジャーの相乗効果に対角線論法

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

要約

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抗がん剤抗体抗悪性腫瘍薬による効果の増強: 組み合わせインデックス式を用いた抗体医薬の相乗作用の検出

合成致死的相互作用を対象とした薬剤の組み合わせを特定するためのデータ統合ワークフロー

患者由来グリオーマ幹細胞を用いたGBMの潜在的併用療法を同定するための迅速スクリーニングワークフロー

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

薬物転用仮説生成の使用」RE：罰金薬「システム

インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカーボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

任意の数の薬のメジャーの相乗効果に対角線論法

4倍のチェッカーボード:薬物の組み合わせを研究するための三次元チェッカーボードの変形

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

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抗がん剤抗体抗悪性腫瘍薬による効果の増強: 組み合わせインデックス式を用いた抗体医薬の相乗作用の検出

合成致死的相互作用を対象とした薬剤の組み合わせを特定するためのデータ統合ワークフロー

患者由来グリオーマ幹細胞を用いたGBMの潜在的併用療法を同定するための迅速スクリーニングワークフロー

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

薬物転用仮説生成の使用」RE：罰金薬「システム

インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカー ボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

任意の数の薬のメジャーの相乗効果に対角線論法

4倍のチェッカーボード:薬物の組み合わせを研究するための三次元チェッカーボードの変形

重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカーボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果