Name: custom engineered tissue culture molds from laser-etched masters
Uploaded: 2018-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
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著者は NIH R00 HL115123 とブラウン大学工学部からの資金を認めます。彼らは訓練のためブラウン デザイン ワーク ショップおよびクリス牛に感謝しています、レーザー カッターでサポートします。

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	<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protoc. 5, 491 (2010).</li><li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+soft+lithography.">Recent progress in soft lithography.</a> Mater. Today. 8, 50-56 (2005).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry.">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li><li>Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+microfluidic+PDMS+devices+from+reusable+PDMS+molds+using+laser+ablation.">Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation.</a> J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+Tissue+Engineering.">Hydrogels for Tissue Engineering.</a> Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).</li><li>Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+cellularly+responsive+hydrogels+and+their+experimental+determination.">Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination.</a> Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).</li><li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels.">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).</li><li>Jaiswal, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacancy-Driven+Gelation+Using+Defect-Rich+Nanoassemblies+of+2D+Transition+Metal+Dichalcogenides+and+Polymeric+Binder+for+Biomedical+Applications.">Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications.</a> Adv. Mater. 29, (2017).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).</li><li>Boxshall, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+surface+treatments+to+modify+protein+adsorption+and+cell+attachment+properties+within+a+poly(dimethylsiloxane)+micro-bioreactor.">Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor.</a> Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).</li><li>Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+collagen+fibers.+Influence+of+fibrillar+alignment+and+decorin+on+mechanical+properties.">Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties.</a> Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).</li><li>Pipan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antifibrinolytic+agents+on+the+life+span+of+fibrin+sealant.">Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant.</a> J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).</li><li>Roberts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Cells+in+Dense+Collagen+Promote+Cardiomyocyte+and+Microvascular+Patterning+in+Engineered+Human+Heart+Tissue.">Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue.</a> Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).</li><li>Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Cardiomyocytes+in+a+Fibrin+Hydrogel+for+Cardiac+Tissue+Engineering.">Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering.</a> JoVE. , (2011).</li><li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering+of+a+Differentiated+Cardiac+Muscle+Construct.">Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct.</a> Circ. Res. 90, 223-230 (2002).</li><li>McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolded+Gelatin+Hydrogels+for+Extended+Culture+of+Engineered+Cardiac+Tissues.">Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues.</a> Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).</li><li>Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Specimen+Geometry+on+the+Estimation+of+the+Planar+Biaxial+Mechanical+Properties+of+Cruciform+Specimens.">Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens.</a> Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).</li><li>Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-Etched+Designs+for+Molding+Hydrogel-Based+Engineered+Tissues.">Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).</li><li>Zhang, H., Chiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fouling+Coatings+of+Poly(dimethylsiloxane)+Devices+for+Biological+and+Biomedical+Applications.">Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications.</a> J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

組織培養と互換性のあるカスタムの PDMS 金型形状はあるセルの配置、拡散率、有効剛性などの重要なエンジニア リング組織プロパティをチューニングするための素晴らしいユーティリティです。さらに、これらの金型、ジオメトリは機械的テスト16,17など、重要な分析アプリケーションの組織を準備するため非常に便利です。否定的なマスター金型を提供しています時間と伝統的な微細加工に関連するコストと比べると、これらのツールを利用した迅速・簡便には、・低コスト法をカット レーザーからこれらのデバイスの準備します。レーザー切断は、カッターのベッドのサイズによってのみ制限さ最大金型の大きいサイズも可能です。我々 は正常にさまざまな設計された心臓ティッシュ、活動電位伝搬の光学マッピング、力生産とパッシブの機械的特性、および注入の評価などの研究を実行するのにこれらの汎用性の高い金型を使用しています。心筋梗塞13,18のラット モデル。心血管再生工学研究のニッチを超えて、薬剤・材料研究フィールド組織工学アプリケーションが広大なことと認識しています。
自分自身金型の作製にいくつかの技術的に挑戦的な手順がありますが、機能的な組織を作成するのに関与するいくつかの重要な手順があります。24 h 後周囲のマトリックスをコンパクトに構成が失敗した場合は、まず生存率は設計組織の染色によって細胞の生存率を確認します。細胞生存率が高い場合は、組織の次のセットの構造の組成を変更することを検討してください。結果は、細胞集団によって大きく異なりますが、一方我々 は、播種密度は高く、コラーゲン濃度に関連付けられている増加された圧縮を観察しました。最後に、圧縮を奨励する、線維芽細胞などの行列が改造に適していますセル型と共にシード セル人口を補うために役立ちますがあります。
これらの型の 1 つの制限です小さな疎水性の分子を吸着する PDMS の可能性です。我々 のアプリケーションにこれは問題となっていないが、これらの分子の損失に非常に敏感な試金の心配のそれかもしれません。これらのケースで、polyhydrophilic または polyzwitterionic 材料19などの防汚剤による PDMS タンパク質吸着を軽減できます。また、滅菌 PDMS 金型は、アガロースなどの別の非吸着素材でキャストする文化型の (レーザー エッチングの肯定的な金型) から否定的なマスターとして準備でした。

過去二十年以上ソフト リソグラフィに使用されています作製技術として広く特にマイクロ流体システム、材料研究と組織工学1、2の分野で科学的な研究をサポート 3。負のマスター型から所望の形状を持つオブジェクトを作成するレプリカ成形ヒドロゲルを形鋳造用、便利で低コストの製造方法 PDMS に複製は、正を使用ことができます提供しています。ただし、必要な負マスター金型は高価な時間のかかる、サイズに制限は、微細加工技術を使用して生成される通常、クリーン ルーム空間と高度な機器を必要とします。3 D プリントは、潜在的な代替手段を提供、その有用性はやや低価格プリンターと共通の 3 D プリンターのポリマーと硬化を阻害することができます PDMS の化学相互作用の解像度制限により限られています。
大幅により少なく高価なしたがってより研究ツールを製造するためのアクセス両方を切断、プラスチック、木材、ガラス、金属などの材料をエッチングできるレーザー カッター システムは近年します。商業用等級レーザー カッターは 25 μ m より小さい最小機能を備えたセンチ スケール上のオブジェクトの加工が可能なさらに最小限のトレーニング、専門知識、および使用する時間を必要とします。PDMS のアブレーションは、マイクロ流体デバイスの作製で以前使用されています、一方我々 の知識に原稿がプロセスを説明ないレーザー切断された否定的なマスター金型4 からミリとセンチ スケール金型を加工できます。.
栄養素の拡散、細胞の配置、および機械的性質5,6,7を向上させるために設計された組織の形状を操作する主にこのテクニックを使いました。ただし、この手法の汎用性は、成形ゲルが薬剤配達および材料科学研究8など、関心のある任意のフィールドで利用できます。レーザー カッターへのアクセス、PDMS 金型複製はほぼすべてジオメトリの場合 (つまり、本稿の範囲を超えているマルチパート金型なしの除去を阻害するだろう) のオーバー ハングせず作ることができるレーザーのベッドの寸法内に収まる。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Item&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F8630-5G</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Bovine thrombin</td><td>Sigma</td><td>T6634-250UN</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Bovine aprotinin</td><td>Sigma</td><td>10820-25MG</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Rat tail collagen I, 4 mg/mL</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5153-100MG</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Sodim chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer</td><td>Corning</td><td>4019862</td><td>PDMS Molds</td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>Fisher</td><td>15-901-5R</td><td>PDMS Molds</td></tr><tr><td>Acrylic, 1/4&quot; thick</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K356</td><td>PDMS Molds</td></tr><tr><td>HEPES Buffer, 1 M</td><td>Sigma</td><td>H3537-100ML</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, powder</td><td>Fisher</td><td>31800-089</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Fisher</td><td>AC423520250</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Fisher</td><td>M33 500</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9390-500G</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-25G</td><td>Constructs</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Histology</td></tr><tr><td>Frozen block molds</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Histology</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Fisher</td><td>3530 1</td><td>Histology</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Fisher</td><td>AC152880250</td><td>Histology</td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>Fisher</td><td>AC410530250</td><td>Histology</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td>Vector Graphics</td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>(Open Source)</td><td></td><td>Vector Graphics</td></tr><tr><td>UCP (Universal Control Panel)</td><td>Universal Laser Systems</td><td></td><td>Laser Cutter Interface</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS6.75 Laser Cutter</td><td>Universal Laser Systems</td><td></td><td>Laser Cutter</td></tr><tr><td>Micromechanical Analyzer</td><td>Aurora Scientific</td><td>1530A with 5 mN load cell</td><td>Mechanical Analysis</td></tr></tbody></table>

custom engineered tissue culture molds from laser-etched masters

組織工学の分野が成熟するにつれ組織形状を含む組織パラメーターの広い範囲で関心の高まりがあった。センチメートルのスケールにマイクロメータの組織形状を操作するで、セルの配置を直接し、効果的な機械的性質を変更し、栄養素の拡散に関連する制限に対処できます。さらに、ティッシュが用意されて容器は組織細胞とマトリックスの両方の構造に影響を与えることができますさらに応力場での機械的な制約を与えることができます。再現性の高い次元の形をした組織も、サンプルの寸法は、全体組織力学的解析など、重要なの in vitroアッセイするためのユーティリティがあります。
この原稿は、レーザー エッチングされたアクリルから調製した負のマスター金型を活用した代替製造方法をについて説明しますこれらの金型ポリジメチルシロキサン (PDMS) を発揮、センチ スケールと機能寸法とデザインを許可。25 μ m より小さいサイズし急速に設計し、作製、低コストと最小限の専門知識を持つ。最小限の時間とコストの要件は、最適なデザインを決定するまでに急速に反復処理してティッシュ エンジニア リングの分野を超えても含め関心の任意のアッセイに合わせて簡単に適応するレーザー エッチングされた金型の許可します。

レーザー カッターの光学系エッチング深さの増加と寸法は非常にわずかに減少するエッチング エリアとレーザー ビームの先を細くための結果金型の非常に微妙な傾斜が付いている壁。これはキャスト PDMS カビの除去を容易にするのに役立ちますが、負のマスター型を非常に深くエッチングする場合慎重に検討する必要があります (> 6 mm) が必須です (図 1)。
培養時間をかけて cellularized 構造がマトリックス割合と程度をこれに足場構成、セルの負荷によって異なりますが発生しますしかし、改造、培養条件により圧縮されます。
マトリックス改造再編と、周囲マトリックス (と同様の新しいマトリックスの沈着)、劣化を発生しますが、通常断面積の減少に伴う機械的剛性の増加に関連付けられています。1.6 mg/mL コラーゲンから成る 12 x 106心筋/mL コラーゲンだけの構造、構造がわかります 19.7 ± 2.8% 圧縮試金鋳造 (図 2) の後に 4 日間の最初の幅のコンパクト。この試金には、3 D プロセスの代表的な 2 D の近似値が得られます、データ収集と非破壊的な性質を容易すること構築開発プロセスを研究するための強力なツール。細胞の不在でも、細胞培養条件下コラーゲン力学することができます変更両方のため時間をかけて自己集合と架橋11。フィブリンは線溶系で急速に低下する可能性が両方との in vitro antifibrinolytic、アプロチニンまたはアミノカプロン酸12など存在にない場合。したがって、構造の定式化を選択するとき長期的組織開発と組織形成だけでなく足場のコンポーネントの影響を考慮する必要があります。金型設計と経験的に最終的な組織のサイズが特定のアプリケーションにとって重要な場合、圧縮を考慮されなければならないまた決定細胞型とマトリックスの組成に基づきます。その組織の圧縮することができますセルの配置 (図 4) を奨励する cellularized 構造で操作することができます組織内の応力場を誘導するも注意してください。
足場高分子濃度および初期細胞播種量の広い範囲は、文学、エンジニア リング組織を作成する使用されている、これは様々 な細胞の種類、細胞、およびアプリケーションのさまざまな要件に主に起因することができます。による由来心筋細胞と私たち自身の仕事に基づいて、我々 は信じているコラーゲン濃度 1.25 mg/mL と播種の ~ 1500 万セル/mL は良い開始点13。また、フィブリンは広く使用同様、心臓組織の足場材料として通常 3-4 mg/mL14の範囲で。アプリケーションによっては、要素の数に基づく細胞播種密度を選択可能性がありますが、ネイティブの組織の細胞の密度は良い参照ポイントを提供します。また高濃度細胞を特に量が少ないため、動作するように困難になることことを検討してください。特定のセル人口の足場の定式化を調整ことができます。一般的に高分子濃度を増やして組織も壊れているまたは分割圧縮、および組織が硬いまたは15をコンパクトに失敗したときに高分子濃度を増加させるとき。
文化の中にポイントいつでも受動的力学解析を実行する前に、機械的に構築サンプル前提、裏付けに適切なことがあります。天然高分子ゲルの前処理・設計組織が材料の粘弾性によりテスト結果の再現性を高める・ コンストラクトが臨床で示すプロパティのより良い指標を提供アプリケーション。力学的評価 (図 3) を開始する前に 10% のひずみ/分の速度で三角形の波形に 10% ひずみの 8 サイクルを使用します。
組織と細胞型の特定の形態は、従来の方法で組織および免疫組織化学によって評価できます。しかし、我々 は、パラフィン加工、埋め込み、断面、抗原検索、染色が必要されていると比較して設計された心筋細胞をメッキまたはネイティブ断面のほぼすべての手順の最適化を発見した組織 (図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57239/57239fig1.jpg"> 図 1: 設計・ レーザーから PDMS 金型製作プロセスのアウトライン カット アクリル マスター 。(A) モールド設計ベクトル グラフィックス形式で準備します。(B) クリーニング レーザー エッチング アクリル否定的なマスターです。(C) PDMS は録音されたアクリル マスター金型の表面にキャストします。(D) 結果 PDMS カビ培養前に殺菌のため準備ができています。Inset: 平面図、同じスケールします。<a href="/files/ftp_upload/57239/57239fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57239/57239fig2.jpg"> 図 2: 文化の時間をかけて圧縮を作成します。(A) 文化に時間をかけて帳票の最適化の準備長方形の構造の画像。緑のオーバーレイが表す画像解析の表示構成領域を計算するために使用するマスク。(B) 面積 (構造圧縮の二次元測定基準) 時間をかけて構成のプロット。水平の線は平均値を表し、エラーバーは標準偏差を示します。すべてのグループ、n = 3、* pを示します < 0.05 分散分析により評価。<a href="/files/ftp_upload/57239/57239fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57239/57239fig3.jpg"> 図 3: 人工心臓組織の力学特性評価の生のトレース。インセットは、単一の代表的な筋収縮トレース (主要なプロットとして同じ軸) を表示します。(A) アクティブな力学応答 5% ひずみ増分で保持しているに続いて急速な手順から生じる。(B) 受動的力学応答 10% ひずみ/分の速度で引きを破るテストから生じる。すべてのサンプルはタイロード液の 37 ° C お風呂に行った。<a href="/files/ftp_upload/57239/57239fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57239/57239fig4.jpg"> 図 4:パラフィンは、様々 なデザインの人工心臓組織構造組織画像をブロックします。様々 なデザインの設計された心臓ティッシュの構成要素のパラフィン ブロック組織画像染色 (A) ヘマトキシリンとエオシン、(B) ジアミノベンジジン (抗心筋トロポニン T、ブラウン)、ヘマトキシリン核対比染色 (C) picrosirius 赤染色対比高速グリーン細胞質染色および (D) マウス抗 α-アクチニン抗体 (緑) 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核対比染色 (青) とコラーゲン。セルの配置は、構造設計と組織の圧縮の結果として異なります。スケール バーでは B と C に同様に適用されます。D のはめ込みは、横紋筋性心筋細胞を示しています。<a href="/files/ftp_upload/57239/57239fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

ここハイドロゲルを用いた複雑な形状設計組織を生成するために使用できるカスタム ポリジメチルシロキサン金型を製造するため急速な安易なと低コスト手法を提案します。さらにこの手法を使用して生産設計された心臓ティッシュの実施される力学的および組織学的評価の結果について述べる。

カスタム設計されたレーザー エッチングのマスターから培養金型

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.4K ビュー.  Brown University. ここハイドロゲルを用いた複雑な形状設計組織を生成するために使用できるカスタム ポリジメチルシロキサン金型を製造するため急速な安易なと低コスト手法を提案します。さらにこの手法を使用して生産設計された心臓ティッシュの実施される力学的および組織学的評価の結果について述べる。

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

生物工学

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

医学

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

生物学

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

疾患における細胞間相互作用を研究するためのマウス腱アッセンブロイドの作製

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell populations. This load-bearing core is encompassed, nourished, and repaired by a synovial-like tissue layer comprising the extrinsic tendon compartment. Despite this sophisticated design, tendon injuries are common, and clinical treatment still relies on physiotherapy and surgery. The limitations of available experimental model systems have slowed the development of novel disease-modifying treatments and relapse-preventing clinical regimes. 
In vivo human studies are limited to comparing healthy tendons to end-stage diseased or ruptured tissues sampled during repair surgery and do not allow the longitudinal study of the underlying tendon disease. In vivo animal models also present important limits regarding opaque physiological complexity, the ethical burden on the animals, and large economic costs associated with their use. Further, in vivo animal models are poorly suited to systematic probing of drugs and multicellular, multi-tissue interaction pathways. Simpler in vitro model systems have also fallen short. One major reason is a failure to adequately replicate the three-dimensional mechanical loading necessary to meaningfully study tendon cells and their function. 
The new 3D model system presented here alleviates some of these issues by exploiting murine tail tendon core explants. Importantly, these explants are easily accessible in large numbers from a single mouse, retain 3D in situ loading patterns at the cellular level, and feature an in vivo-like extracellular matrix. In this protocol, step-by-step instructions are given on how to augment tendon core explants with collagen hydrogels laden with muscle-derived endothelial cells, tendon-derived fibroblasts, and bone marrow-derived macrophages to substitute disease- and injury-activated cell populations within the extrinsic tendon compartment. It is demonstrated how the resulting tendon assembloids can be challenged mechanically or through defined microenvironmental stimuli to investigate emerging multicellular crosstalk during disease and injury.

著者スポットライト:細胞メカニズムを理解するためのマウスアッセンブロイドの開発による腱研究の進歩

Here, we present an assembloid model system to mimic tendon cellular crosstalk between the load-bearing tendon core tissue and an extrinsic compartment containing cell populations activated by disease and injury. As an important use case, we demonstrate how the system can be deployed to probe disease-relevant activation of extrinsic endothelial cells.

カスタム設計されたレーザーエッチングのマスターから培養金型

要約

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機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュリング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

カスタム設計されたレーザー エッチングのマスターから培養金型

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腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

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カスタム設計されたレーザーエッチングのマスターから培養金型

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュリング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製