この作品は、DK52057 と K.V.K. X.P に NIH から DK107498 は、NIH からの研修制度の助成金 2T32DK007201 によって支えられた研究補助金によって支えられました。

1. ペプチドの取り扱い
<ol><li>デザインとペプチドの順序<ol>
<li>ペプチドの任意のシーケンスを選択し、myc エピトープ (EQKLISEED) でそのいずれか N- または C 末端などのタグを追加します。</li>
		<li>ペプチドの溶解度電卓 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php を用いた水中ペプチドの予測の溶解度をチェックします。溶解度が低い場合は、電荷バランスを変更する別の水溶性タグを追加ましょう。 注意: 使用して GLUT4 myc エピトープ (太字) タグの最初の内腔ループ (fll) に対応するペプチド N 末端 (Myc-fll-GLUT4): 水に「良い」予測への溶解度は、 EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA.</li>
		<li>注文少なくとも 75% のカスタムのペプチド純度、試金のためだけで十分ですし、溶解テストのプロバイダーに依頼します。ペプチドの溶解と予期しない問題がある場合、少なくとも 2 つの因数に順序を分けます。 注: 2 つの因数で Myc fll GLUT4 が命じられました。純水で溶解性報告は ≤10 mg/mL です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペプチドの溶解 注: 超純水は最高の溶剤です。水溶性ペプチドが表示されない場合は、手順については http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html を参照してください。<ol>
<li>純水または 100 μ g/mL の濃度で選択、バッファーの中のペプチドの実用的なソリューション x 100 を準備します。</li>
		<li>50-100 μ 因数にソリューションを分離し、-20 ° C で保存</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞の取り扱い
<ol><li>細胞培養<ol>
<li>否定的な制御、および 6 ヒスチジン (HisP) が付いたターゲット蛋白質を発現する細胞として野生型 (WT) セルを使用します。 注意: 3T3 L1 前脂肪細胞安定発現するソーティリン myc/彼5を使用します。</li>
		<li>ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 高糖度, 10% 牛ウシ血清を添加した細胞を成長グルタミン (2 mM) とペニシリン/ストレプトマイシン (5 μ g/mL) 10% CO2の 37 ° C で。</li>
		<li>細胞の 4 つの 10 cm 皿に座る、HisP とそれらの 2 つを transfect し、transfect 制御プラスミド (WT) と他の 2 つ。トランスフェクション後 48 時間は、電池が 80-90% の confluency に達する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セル Lysates の準備<ol>
<li>換散バッファー (10 mM Hepes、30 mM の NaCl、5% グリセロール、10 mM のイミダゾール、0.5% トリトン X-100 およびプロテアーゼ抑制剤のカクテル edta、pH 7.4 の彼の付けられた蛋白質の分離) を準備し、4 でそれを維持 ° c:</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 4 ° C で × 1 の 10 mL で 3 回セルを洗浄します。</li>
		<li>氷の上の皿を入れて、それぞれの皿に換散バッファーの 500 μ L を追加します。細胞スクレーパーを使用してセル lysates を収穫します。</li>
		<li>場所別 1.5 mL チューブに各皿から細胞ライセート。WT pH6、WT pH8、HisP pH6、HisP pH8 チューブ ラベルを付けます。</li>
		<li>セル lysates を通過注射器 26 G 針、5 回上下、完全溶解。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間 16,000 x g でセル lysates を遠心分離します。</li>
		<li>培養上清を新しい同じラベルの付いたチューブに転送します。</li>
		<li>BCA タンパク質アッセイ キットや他のキットを使用して蛋白質の集中を分析します。</li>
		<li>換散バッファーを使用すると、すべての 4 つの溶解液のタンパク質濃度を均等化します。</li>
		<li>各ライセートの小 (約20 μ L) 因数を分離可能な制御実験やトラブル ・ シューティングのための-20 ° C で保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HisPur コバルト ビーズに彼の付けられた蛋白質の結合
<ol><li>市販の洗浄バッファーを使用または 1 つ (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール、pH 8) を準備し、4 ° C で維持</li>
	<li>準備洗浄バッファーを幸せそうな洗浄バッファー pH 8 による pH 6 塩酸維持それ 4 ° C で</li>
	<li>均質な懸濁液にコバルト ビーズのボトルを軽く旋回します。</li>
	<li>上記のようについた 4 つの 1.5 mL チューブ (ステップ 2.2.4) にコバルト ビーズ懸濁液 40 μ L を分注します。</li>
	<li>各管に 1 mL の溶解バッファーを追加し 5 s. 吸引、上澄みの 1000 x g でチューブを遠心し、定住ビーズに換散バッファーの 40 μ L を追加します。</li>
	<li>対応する管にセル lysates を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 20 rpm 管回転で 90 分の管を孵化させなさい。</li>
	<li>遠心分離機管 1000 g は 5 s、収集清 x。4 ° C で上澄みを維持します。</li>
	<li>対応するチューブに pH 8 の pH 6 洗浄バッファー 500 μ L を追加し、再優しくビーズを中断します。</li>
	<li>5 s と破棄のため 1000 x g でチューブを遠心培養上清。</li>
	<li>手順 3.9 および 3.10 を 4 回。</li>
</ol>4. ビーズに固定化した彼の付けられた蛋白質をペプチドの結合
<ol><li>PH 6 または 8 の pH 洗浄バッファー (各 2 つ 100 μ 因数、1 μ g/mL) で稼動するソリューション x 1 ペプチド (ステップ 1.2.1) の 100 倍実用的なソリューションを使用して準備します。</li>
	<li>対応する pH と洗浄のビーズに 1 x ペプチド溶液 100 μ L を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 20 rpm 管回転で 30 分のビーズをインキュベートします。</li>
	<li>5 1,000 x g でチューブを遠心分離機 s、上澄みを収集し、-20 ° C でそれを維持</li>
	<li>手順 3.9 および 3.10 を 4 回。 注: 可能なバック グラウンドを低減するために次の手順は 4.4 と 4.5 の手順を置き換えることができます。</li>
	<li>30 μ m の孔を持つ 4 つのマイクロ列を取り出して 2.2.4 には、ステップのようにラベルを貼ってコレクション チューブに列を配置します。</li>
	<li>4.3、ステップの終了時は、列にインキュベーション混合物を転送後、は、重力によって通過するソリューションを許可します。-20 ° C で流れを維持します。</li>
	<li>重力によって洗浄バッファー pH 6 または pH 8 対応する列との 500 μ L を渡します。流れを破棄します。</li>
	<li>手順 4.8 4 回繰り返します。</li>
	<li>最後の洗浄後遠心 15 1,000 x g で列 s。</li>
</ol>5. コバルト ビーズから溶出
<ol><li>商業トリシン サンプル バッファーを使用 (200 mM トリス-HCl、40% のグリセロール、2% SDS 0.04% pH 6.8 ブルー) と β-メルカプトエタノールを加える最終濃度 2%。</li>
	<li>ビーズ洗浄と渦サンプル (β-メルカプトエタノール) とトリシン サンプル バッファーの 40 μ L を追加します。</li>
	<li>100 ° C で 10 分間のサンプルを熱渦再度、サンプル 5 1,000 x g でチューブを遠心分離機と s。 注: 溶出の可能な非特異的結合を減少するために次の手順は手順 5.1 5.3 を置き換えることができます。</li>
	<li>洗浄に溶出イミダゾール バッファー (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM の NaCl、0.25 M イミダゾール) の 40 μ L を追加ビーズ、渦と 20 分間室温でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>3,000 x 30 g のチューブを遠心分離機 s、上清 (溶出サンプル) を収集し、新しいラベルの付いた管にそれを転送します。</li>
	<li>各管にトリシン サンプルバッファーの 40 μ L を追加、100 ° C、渦および遠心分離機で 10 分間のサンプルを加熱チューブ 5 1,000 x g で s。 注: は、20 分間インキュベート マイクロ列を使用すると、洗浄のビーズに溶出バッファーを追加する場合と 2 分 8,000 × g で遠心分離して溶出を収集します。 注: サンプルは電気泳動の実行まで、-20 ° C で保存できます。</li>
</ol>6. 電気泳動および西部にしみが付くこと
注: サンプルは SDS のページおよびそれに続く西部のしみによる分離の準備ができています。ゲル電気泳動 (https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5065/the-western-blot) 次の修正のプロトコルに従ってください。
<ol><li>市販の 10-20% トリシン勾配ゲルを使用します。</li>
	<li>ゲル、溶出サンプルの 20 μ L と 20 μ L の lysates (ステップ 2.2.10) をロードします。トラブルの撮影のため、非連結材 (ステップ 3.8) の 20 μ L をロードお勧め 10 ペプチド; ng、読み込み前にこれらのサンプルをトリシン サンプル バッファーの等しい量を追加します。</li>
	<li>商業トリス/トリシン/SDS バッファー (100 mM 100 mM トリシン、トリスと 0.1 %sds、pH 8.3) を実行しているの電気泳動を行います。</li>
	<li>転送バッファー (25 mM Tris ベース、192 mM グリシン、pH 8.4) 20% メタノールを添加したを使用して 0.45 μ m ニトロセルロース膜にゲルから材料を転送します。</li>
	<li>3% の膜をブロック ウシ血清アルブミン (BSA) 室温で 1 時間。事前にステンド グラスの分子量のマーカーを使用すると、ガイドとして、膜を水平にカット、HisP、抗体と上の部分のしみ、myc タグ付きペプチドを識別する myc エピトープ抗体に底の部分のしみ。 注: 特定の例、膜の切削は必要ありません HisP と Myc fll GLUT4 は反 myc 抗体を検出できるので。</li>
</ol>7. 結果の分析
<ol><li>イメージ ステーションや ImageJ のプログラムを使用してすべての西部のしみの信号の強さを定量化します。</li>
	<li>両方の pH 値で HisP から信号に対して myc タグ付きペプチドから信号を正規化します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes.">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li><li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+is+sIRVed:+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers.">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li><li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li><li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4.">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li><li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li><li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shortcut+to+the+lysosome:+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway.">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95/sortilin,+a+non-G-protein-coupled+receptor.">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li><li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor.">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li><li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain.">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li><li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death.">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ソーティリンは両方のシグナル伝達の細胞膜と細胞内の並べ替えイベント6,7に関連する進化的保存されている複数のリガンド蛋白質受容体です。ただし、本格的なソーティリン配位子 (一部が内腔や不可欠な膜蛋白質) の検索は、その結合パートナーのいくつかとソーティリンの相互作用が洗剤に敏感であるように複雑です。したがって、簡単およ?...

GLUT4 はそれが食後血ブドウ糖クリアランス1インスリンの効果を仲介する脂肪と骨格筋細胞に主に発現するグルコース輸送タンパク質です。非常に安定したタンパク質であること、GLUT4 は翻訳後修飾レベルで調整されます。インスリンのない場合は、GLUT4 は、主細胞膜 (それゆえ低グルコースの基底透水性) から除外され、主に小さなインスリン応答性小胞 (IRVs) の細胞内局在とトランスゴルジ ネットワーク (TGN) を表す可能性があります。IRV ドナー コンパートメントです。インスリン投与時に、IRVs は細胞膜と融合し、その機能のサイトに GLUT4 を提供します。脂肪細胞、骨格筋細胞に血液からブドウ糖取り込み上昇する 10 倍、これはグルコースの細胞膜の透過性を増加します。インスリン離脱後 GLUT4 は並べ替えと初期エンドソームに取り込ま、TGN、IRVs、再結成に取得されます。両方の並べ替え手順 GLUT4 経路、すなわち末梢早期エンドソームから核 TGN に取得し、IRVs の形成の TGN ドナーの Vps10p 家族のメンバー、ソーティリンは、型を表しますで膜が有効 I膜貫通型タンパク質と並べ替えの受容体。1 つのモデルによるとソーティリンは、膜貫通足場蛋白質として働く: それはエンドソームと TGN の内腔の GLUT4 を連結して、その C 末端の2、 、ドナー膜を介して細胞質側にレトロマーやクラスリン アダプターを募集3。 これは容易に細胞内コンパートメント間 GLUT4 を若し小胞のキャリアへの GLUT4 の分配。
ソーティリンの細胞質テール レトロマーとさまざまなアダプター蛋白質との相互作用はよく記載されています。ただし、ソーティリン GLUT4 (とその他のタンパク質のリガンドのいくつか) のバインドに証明するためにチャレンジしております。特に、co immunoprecipitate ソーティリンと GLUT4 の試みこれらの 2 つの蛋白質間の相互作用の洗剤に敏感な性質のためにおそらく成功されていません。また、典型的な輸送体タンパク質 GLUT4 が 12 の膜貫通ドメインと六つの内腔ループの組み合わせはソーティリン結合部位を表すことができる可能性があります。同時に酵母 2 ハイブリッド系の架橋膜透過性の DSP との相互作用のセルで、実質的なの共局在などの間接証拠の大きいボディは、そのソーティリンは GLUT4 にバインドすることをお勧めします。さらに、変異をスキャン アラニンと組み合わせで後者のアプローチを使用して、以前決定した GLUT4 の最初の内腔のループに主にソーティリンの Vps10p ドメインがバインドされていること。しかし、哺乳類細胞でこのような相互作用の証拠が行方不明になっています。ここでは、酸性の環境でのようなソーティリン コバルト樹脂を使用し、pH 6 および 8 の pH で GLUT4 の最初の内腔ループに対応する化学的に合成されたペプチドがやり取りできることを示した transfected 3t3-l1 細胞からの彼の付けられた分離した、エンドソーム内腔と TGN 膜の内腔で中立的な環境。同じビーズで非トランスフェクト細胞から調製した抽出物を読み込んだ制御実験のペプチド結合が見つかりませんでした。

<table><tbody><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>for use in purification of histidine tag protein</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1mL Insulin Syringe U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Wash buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td><td>For His-tag protein purification</td></tr><tr><td>HisPur Cobalt Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>Tricine sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0739</td><td>with SDS, bMercaptaethanol should be added</td></tr><tr><td>Elution&amp;nbsp; Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-236</td><td>For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole</td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>For seperation of peptide and small protein</td></tr><tr><td>Tris/Tricine/SDS running buffer&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td><td>Add 20% methanol</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&amp;nbsp; 0.45 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Anti Myc antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2272</td><td>Rabbit</td></tr><tr><td>Peptide</td><td>Genscipt</td><td></td><td>customize ordering</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual color Standarts</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins

蛋白質蛋白質の相互作用を探索する我々 の能力は、セル内の規制の接続を理解する鍵です。ただし、多くの場合タンパク質-タンパク質相互作用の検出は、重要な実験課題に関連付けられます。特に、並べ替えの受容体は、これらの蛋白質の免疫沈降の co を使用できなくなり、洗剤に敏感なファッション多いの膜区画のルーメン内タンパク質貨物と対話します。グルコーストランスポーター GLUT4 を膜タンパク質相互作用弱い内腔の例として役立つことを並べ替えの受容体ソーティリンの結合。ここでは、ソーティリンと GLUT4 の相互作用を検証するための高速、シンプル、かつ安価な試金を記述します。そのため設計し、GLUT4 の内腔の一部の潜在的なソーティリン-結合エピトープに対応する myc タグ付きペプチドを化学合成した.6 ヒスチジンが付いたソーティリンは、哺乳類細胞で発現され、コバルト ビーズを用いたセル lysates から分離されました。ビーズに固定化したソーティリンが異なる pH 値でペプチド溶液で培養された、溶出の材料は西部にしみが付くことによって分析しました。この試金は簡単に他の洗剤に敏感なタンパク質間相互作用の研究に適応することができます。

Lysates 3T3 L1 細胞安定発現するソーティリン myc/彼5と WT 3T3 L1 細胞、ネガティブ コントロールとして使用からの調製。両方の lysates は pH 6 または 8 の pH でコバルト ビーズをインキュベートされ、徹底的に洗浄します。固定された蛋白質とビーズ、Myc fll Glut4 のソリューションで培養。注意して洗浄後 0.25 M イミダゾールとビーズに結合蛋白質が溶出し?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

洗剤に敏感な例として並べ替え受容体、ソーティリン、GLUT4 グルコース輸送体タンパク質の最初の内腔のループに結合を用いた膜タンパク質相互作用の検出のためのプロトコルについて述べる。

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

detection-detergent-sensitive-interactions-between-membrane

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.9K ビュー.  Boston University School of Medicine. 洗剤に敏感な例として並べ替え受容体、ソーティリン、GLUT4 グルコース輸送体タンパク質の最初の内腔のループに結合を用いた膜タンパク質相互作用の検出のためのプロトコルについて述べる。

ビデオ: Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

生化学

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the investigation of biological materials, biofuel processing, and bio-inspired materials covering nanometer to micrometer length scales. The methods presented here for investigating physical properties (i.e., size and shape) of membrane proteins (here, MmIAP, an intramembrane aspartyl protease from Methanoculleus marisnigri) in solutions of micelle-forming detergents are well-suited for this small-angle neutron scattering instrument, among others. Other biophysical characterization techniques are hindered by their inability to address the detergent contributions in a protein-detergent complex structure. Additionally, access to the Bio-Deuteration Lab provides unique capabilities for preparing large-scale cultivations and expressing deuterium-labeled proteins for enhanced scattering signal from the protein. While this technique does not provide structural details at high-resolution, the structural knowledge gap for membrane proteins contains many addressable areas of research without requiring near-atomic resolution. For example, these areas include determination of oligomeric states, complex formation, conformational changes during perturbation, and folding/unfolding events. These investigations can be readily accomplished through applications of this method.

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

This protocol demonstrates how to obtain a low-resolution ab initio model and structural details of a detergent-solubilized membrane protein in solution using small-angle neutron scattering with contrast-matching of the detergent.

膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

膜脊柱：膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために、生化学的ツール<em&gt;インビボ</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

生物工学

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug targets. Yet, a major barrier to their characterization and exploitation in academic or industrial settings is that most biochemical, biophysical, and drug screening strategies require these proteins to be in a water-soluble state. Our laboratory recently developed the peptidisc, a membrane mimetic offering a &#8220;one-size-fits-all&#8221; approach to the problem of membrane protein solubility. We present here a streamlined protocol that combines protein purification and peptidisc reconstitution in a single chromatographic step. This workflow, termed PeptiQuick, allows for bypassing dialysis and incubation with polystyrene beads, thereby greatly reducing exposure to detergent, protein denaturation, and sample loss. When PeptiQuick is performed with biotinylated scaffolds, the preparation can be directly attached to streptavidin-coated surfaces. There is no need to biotinylate or modify the membrane protein target. PeptiQuick is showcased here with the membrane receptor FhuA and antimicrobial ligand colicin M, using biolayer interferometry to determine the precise kinetics of their interaction. It is concluded that PeptiQuick is a convenient way to prepare and analyze membrane protein-ligand interactions within one&#160;day in a detergent-free environment.

We present a method that combines membrane protein purification and reconstitution into peptidiscs in a single chromatographic step. Biotinylated scaffolds are used for direct surface attachment and measurement of protein-ligand interactions via biolayer interferometry.

PeptiQuick、合理化されたタンパク質結合アッセイのためのバイオチン化ペプチドディスクへの膜タンパク質のワンステップ組み込み

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

生物学

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

Source: Bird, L. E., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52357">Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli</a>. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー:界面活性剤の可溶化に伴う蛍光膜タンパク質の完全性を同定する技術

Source: Bird, L. E., et al. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)
In this ...

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

要約

さらに動画を探す

この動画の章