Name: imaging intermediate filaments and microtubules with 2-dimensional direct stochastic optical reconstruction microscopy
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
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ミカエル ・ Lelek、オレシティス Faklaris と有意義な議論のニコラス ・城下町、アンドレイ Aristov と超解像技術のヘルプについてエレナ練とシャイラージャ ・ Seetharaman 原稿の注意深い読書のために感謝します感謝するフランス国立研究機関 (ANR 10 INSB 04; サポート フランス バイオ イメージング インフラストラクチャ ネットワークと同様、UtechS フォトニック バイオ イメージング (Imagopole) Citech のパスツール研究所 (パリ, フランス)未来への投資)、および地方イル (ドメーヌ d プログラム ' 水利 Majeur Malinf) Elyra 顕微鏡の使用のため。この仕事に支えられ、リーグ Contre le がんとフランス国立研究機関 (ANR-16-CE13-0019)。

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プロトコルの重要なステップ
微小管の dSTORM 画像内のアーティファクトとグリア細胞における IFs を最小にするプロトコルをご紹介します。サンプル準備およびイメージ投射の各ステップでの成果物を作成できます: 固定、ブロック、反応、ドリフトの買収により、非最適な点滅条件23。我々 は、最も重要な手順以下リストします。
表面に蛍光物質の非特異的結合を制限する重要なステップは、クリーニング、coverslips したがって dSTORM 画像の背景ノイズを制限します。
PFA (パラホルムアルデヒド) (ステップ n ° 3) とグルタールアルデヒドとトリトン、および固定のミックスを使用して抽出し、固定のソリューションの手順とサンプルを修正お勧めします。固定のプロトコルは、Chazeau et al12から適応された: 我々 は 60 に抽出/固定ステップ インキュベーション時間を減少した s (ステップ 3.4) 骨格バッファーからブドウ糖を削除し、透過の余分な手順を省略しました。このメソッドの利点は、自由に移動する細胞骨格サブユニットが離れて排水が少ない背景12と超解像イメージングを可能ことです。一般的には固定ステップが重要ですのでフィラメント ネットワークの部分的な破壊に (古い PFA、コールド」ソリューションもロング/ショート インキュベーション手順を使用) 悪い固定リード (壊れた微小管、微小セルの前面に到達していないおよび/またはに、低密度)。特にルダックら15に従ってビメンチン ネットワークをイメージだけメタノール固定を使用することが可能ですもに注意してください。ただし、バック グラウンド ノイズは、セル (図 5) の中観察できます。DSTORM 画像を用いてメタノール固定が貧しい品質のセルが場合に彼らはまだものの両方の情報を提供、微小管ネットワークのフィラメント密度の長期的に例えばよう必要があります。のみグルタルアルデヒドで固定は、微小管固定23最高のプロトコルだが、IFs の非常に悪い結果を与えた。
免疫染色では、ラットで産生された抗体の交差反応を最小限に抑える抗マウス抗体を使用することが重要です。我々 の彼らはマウス抗ビメンチンに加えてラット抗チューブリンと非特異的交差反応するため、この理由のための Fab 断片 (抗マウス) を使用できませんでした。
利用可能な限られたレーザー力のため暗い状態に Alexa555 染料をポンプする 488 と 561 nm のレーザー ラインを使用する必要です。ハイパワー 488 レーザー (50% 以下) は、バック グラウンド ノイズも増加しますが良い点滅し、低いデューティ ・ サイクル (fluorophore は時間の割合をオンの状態で使う) を観察する集録時にも必要です。全反射照明モード制限薄い層に蛍光物質の励起 (~ 200 nm ガラス基板上)。それは背景光を減少させることによって信号対雑音比を増加が、励振電力も減少します。ヒロ モードにより、軸断面と効率的な信号対雑音比を最適化することができます。したがって、エピと全反射間の良い中間です。ヒロ モードを使用しては、Alexa555 の蛍光物質は、正しく点滅する高いレーザー パワーを必要とを効率的に刺激する不可欠です。
もう一つの重要なステップは、生データ (手順 6) の習得です。(露出、ゲイン、全反射ともフォーカス フォーカス ブロック デバイスが利用できない場合) アクイジション ・ パラメーターを調整する必要がある映画を取得中。明るい蛍光物質の最適濃度を保つことは重要である (図 1 a): 40 000 フレーム後全体の構造を視覚化するのに十分高いが、各色素の立体的な分離に十分に低いことが必要があります。活性分子の数が小さすぎる場合長いスタックを取得する必要があります。良いイメージを得た 〜 IFs、µm² あたり 5000 ローカライズと微小管の cm ² あたり 2 500 のローカライズ。
変更およびメソッドのトラブルシューティング
新鮮なサンプルで動作することが重要であり、バッファーをイメージングに最適化されました。pH 正確に調整してください、特に、MEA のため。
ビメンチンと微小管は、(WF) 標準的な広視野顕微鏡を用いたイメージング際に均一にラベル付けされたはずです。フィラメントは、古典的な顕微鏡による中断/破線を見て、この超解像を使用する場合は、増幅されます。この場合は、新しいサンプルを準備することをお勧めします。探して断片化された微小管の最適化されていない固定条件 (古い PFA 等) があります。ガラス表面に高いバック グラウンドは、非効率的なブロックから生じる。その場合は、BSA (ウシ血清アルブミン) を FBS (ウシ胎児血清)、置き換えし、インキュベーションの各手順で使用できます。
ラベリングの密度が高すぎる場合 (図 1 b) と押されることは十分に暗いオフ - 状態、最高のレーザー パワーとも中等量 (一次抗体の量を減少させるより良い) 下がるべきである抗体。ただし、新しいサンプルの準備が必要です。一般に、経験的に使用する二次抗体の量を評価する必要があります。
Fluorophores が正常に点滅しない場合 (彼らべき明るい状態で 1 つのフレームの間に)、イメージングのバッファーの pH が正しい (pH 8.3) であることを確認します。(特に MEA) を解決しない場合は、新しいソリューションを準備します。常にチェック (TIRF u_HP) に全反射コリメータがあります。限られたレーザーの力で適切な点滅を得るかもしれない挑戦 (オンとオフの料金と同様色素明るさによって異なりますレーザー パワーの説明に従ってヴァン ・ デ ・ リンデら11)。他の染料のように励起レーザーのより多くの電力が利用可能な14の場合、Alexa488 または Atto488 を探索することができます。
Fluorophores の 40 000 のフレームの終わりの前に点滅が停止する場合は、酸化されているイメージングのバッファーを変更します。バッファー変更後バッファーと蓋の間に気泡がないことを確認します。シール サンプルは、raw で数時間のイメージでした。
嵐映画は、EMCCD を搭載した正規の全反射蛍光顕微鏡で取得した、イメージを再構築に雷雨24を使用することが可能です。ドリフトの補正、画像のフィルタ リングや画像のレンダリングには同様のオプションがあります。雷雨は、フィジー/imageJ ソフトウェアで使用するプラグインです。メーカー ソフトウェアと雷雨 (図 6) 同様の結果が得られました。
ベビーベッド (シクロオクタテトラエン) は、単一分子の局在化の精度向上にイメージングのバッファーに追加することができます。それは Alexa64725サイクルあたり放出される光子の数を増やします。定位精度の向上は確かに観察された (6 まで nm) 嵐バッファーに 2 mM のベッドを追加するで説明されている場合手順 5 または 100 ミリメートルと MEA に従って参照25。ただし、これらの条件で取得中に明るい分子の数が多く減少ベビーベッド、買収の終わりに分子の局在化の合計数を制限して、アンダー サンプリングの場合ネットワークにつながる可能性のあるなしよりも高速です。他のイメージングのバッファーは、Alexa 染料、清掃システム26酸素としてラクターゼと oxyrase を使用する場合などでも動作するように報告されました。このプロトコルではサンプルとイメージング、セットアップの我々 のタイプの解像度の長期的に最良の結果を与えたバッファー組成を報告、各サンプル タイプ ラベルに加えて、バッファーの最適化と固定条件の最適化が必要です。
メソッドの制限と改善の可能性
ここで紹介した方法は、固定セルや 2 D 画像に限られます。標準の全反射蛍光顕微鏡と、EMCCD をセットをイメージングを使用して、最も制限する要因だったレーザー力 (100 mW 561 nm レーザーが点滅 Alexa555 染料を作る足りなかった)。532 nm レーザー ラインはこれらの染料を刺激する方が効率的かもしれません。法の可能な改善は 3 D dSTORM 光乱視27を使用してを実行するでしょう。ラベリングの密度が低いと高められたフレーム数を除いて、プロトコルの最小限の修正が必要になります。3 D デュアル カラー嵐画像は、微小管、特にバンドルを包んだ IFs の方のビューを提供します。同じ固定法と蛍光ファロイジン8の量を最適化を用いたアクチン フィラメントを観察するも可能性がありますに注意してください。3 色の嵐は、3 つの細胞骨格サブシステムの組織を観察するされる可能性があります。
二次抗体が 20 までローカライズ目的のオブジェクトのサイズを増加させる第一次および二次抗体を使用してターゲットから nm。通常、直径 25 nm の微小管の幅を持って 〜 50 nm にラベリングした後。ターゲットと染料との間の距離を向上させる 1 つの可能性は、直接適切な染料で一次抗体をラベルすることです。理想的な有機色素の付いた nanobodies は使用される28をする必要があります。
ここで、次の Endesfelder ら22単一分子の平均ローカリゼーション精度を推定する簡易法だけいたします。画像の全体の解像度を両方のローカリゼーションの精度を考慮し、密度、ラベリングも測定できますフーリエ リング相関アプローチ29を使用します。
チャネルの登録に関するビューのフィールドに完全にすべてのビーズをオーバーレイすることは困難です。複雑な補正は、Chazeau et al 12で見つけることができます。
DNA 塗料 (ナノスケール地形の投射のための DNA ポイント蓄積)30を使用して fluorophores の点滅・ プローブの漂白から生じる制限を克服できます。このメソッドで単一分子のローカリゼーションに必要な点滅が、相補的なターゲットに短い色素標識オリゴヌクレオチドの非定常バインディングによって作成されます。
結論
この記事は、固定細胞における細胞骨格フィラメントの 2 次元でデュアル カラー dSTORM イメージングを実行する堅牢なプロトコルを示します。発見された我々 のサンプルのタイプの固定、反応やイメージングのバッファー面で最適な実験条件の詳細に記載されています。その後、raw データ集録および記録するが点滅のイメージの種類のプロセス (分子密度、信号対雑音比、fluorophore デューティ サイクルなど) dSTORM 画像を再構成、ドリフトとフィルターのデータを修正する方法などを提示します。これらの手順は、一般的なデュアル色 dSTORM イメージングとないタイプ固有のサンプルします。最後に、このテクニックが 2 つの結合の骨格ネットワークの密度の低い組織の解決を支援する方法を示します。

細胞の中間径フィラメント (IFs) は、直径 10 nm のヒト - または場合蛋白質の特定のサブセットを携帯型の heteropolymers です。IFs は、細胞運動、増殖やストレス応答など細胞機能の広い範囲に参加します。その重要な役割が 90 以上の人間の病気直接場合蛋白質で突然変異によって引き起こされるという事実によって強調表示されます。例えば、腫瘍の増殖および1,2,3を広める場合組成の変化を伴います。細胞の極性形成、部門と移行2,3などの細胞機能を制御する共同で 3 つの骨格システムが働くという証拠が高まっています。建築の空間と機能の間の密結合なので、他のフィラメントの場合の構造への洞察力を得るし、細胞骨格のクロストークを理解することが重要です。この記事は、超解像技術のデュアル カラー dSTORM (直接確率再建顕微鏡)4との間の相互作用を調査する使用方法と微小管を実行するプロトコルを提供しますで固定、培養2 次元 (2 D) 内のセル。
いくつかの超解像技術は、過去に開発されている年とそこ発見 2014年5ノーベル化学賞の原点であった。これらすべての方法の間であるパーム6 (Photo-Activated ローカリゼーション顕微鏡) スイッチング蛍光タンパク質を使用して嵐7 fluorophores が付いてまたは dSTORM4 のペアのような単一分子局在に基づく方法従来 fluorophores が付いています。ローカライズするためにこれらすべてのメソッドは、「オフ」状態に (i) 蛍光レポーターのほとんどのスイッチから成っている同じ原理に基づいています」(非蛍光灯)、(ii) それらのサブセットを蛍光の確率論的活性化状態のナノメートル精度、および (iii) できるだけ fluorophores の多くのサブセットをアクティブにするためにこのプロセスの繰り返しと空間的な位置。最終的なイメージは、20 ~ 40 までの横方向の分解能を提供する活性化分子のすべてのローカライズを使用して再構築されます nm。パーム/嵐をできるようにいくつか商品化された光学系のルーチンの実験のための生物学者に今あります。ここでは、1 つのようなシステムは微小管と IFs の結合構造を研究に使用されました。非常に薄い層状の領域を観察する最適ですのですべて単一分子局在ベースのメソッドの間でデュアル カラー dSTORM 手法が選ばれた (< 1 μ m) 付着性のセルの画像解像度の大幅な改善を提供することができます、最小限の時間とお金の投資。確かに、dSTORM は、細胞染色と蛍光抗体法により定期的に使用される標準的な有機色素と互換性がある非常に便利な汎用性の高いテクニックです。
限られている場合は特に、選択バッファーに正しく 2 つの染料が点滅する場合もあるので、実験の条件を最適化する必要がありますデュアル カラー dSTORM 1色 dSTORM 画像は Alexa6478蛍光体を使用して取得する比較的簡単なレーザー パワー。優秀な論文は dSTORM9,10、11,12,13, マルチカラー イメージングをセットアップする方法に使用されておりこれらの書類は、詳細に説明の可能なソース成果物と劣化画像の解像度だけでなく、それらを克服する方法。この記事は、細胞の固定、染色、サンプル準備の面で最適な実験条件、画像取得と画像再構成が密な細胞質場合ネットワークと微小管の画像を得るために説明デュアル カラー dSTORM とグリア細胞。簡単に言えば、Chazeau ら12の抽出/固定方法がグリア細胞に適応されポスト固定ステップ、最適化された抗体濃度で使用、10 ミリメートルと嵐バッファー MEA の記載したデンプシー9ら実験のセットアップとサンプル タイプに最適なことが判明します。
グリア細胞は主に 3 種類の場合はタンパク質を表現: ビメンチン、ネスチンと GFAP (グリア細胞の酸性タンパク質の線維性)。これらの 3 つのタンパク質は、アストロ サイト14共重合に示されていた。我々 は以前超解像の構造化照明顕微鏡 (SR SIM) 同じ単一の場合フィラメントのこれらの 3 つの場合の蛋白質を見つけることができます、グリア細胞15と同様の分布と動態表示ことを示した。3 の場合蛋白質の間の類似点のため全体の場合ネットワークの腔は使用レポーターとして。DSTORM を使用すると、回折では不可能でしたが微小管に沿って場合フォーム バンドルが顕微鏡技術15に限られた解決することができた。これらの観察は、ビメンチン IFs にテンプレート微小管ことができる方法を理解し、彼らの成長の軌道の細胞移行16中極性軸の整備を推進を規制できます。超解像画像 2 つの細胞骨格サブシステムの相互作用に重要な情報を提供し、空間協会とセル型特定17となるローカル関数間のリンクへの洞察力をもたらした。一般に、密度と特異性の面で条件が良い染色に達した、デュアル カラー dSTORM を骨格要素やその他の細胞小器官間のクロストークを勉強する使用できます。この手法は膠芽腫と星の中に、細胞骨格の変化を特徴付けるより役に立つでしょう、最も一般的なと最も悪性の腫瘍の場合蛋白質の表現が、中枢神経系の変更18 、19,20,21。

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Media (MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>cell culture</td></tr><tr><td>non essential amino acid</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>cell culture 1/100e</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>cell culture 1/100e</td></tr><tr><td>F&amp;oelig;tal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>cell culture 1/10e</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>cell culture</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>fischer scientific</td><td>11540486</td><td>cell culture</td></tr><tr><td>coverslip 18 mm n&amp;deg;1,5H</td><td>Marienfield/Dominic dutsher</td><td>900556</td><td>coverslips</td></tr><tr><td>paraformaldehyde (PFA) solution</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>cell fixation</td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>cell fixation</td></tr><tr><td>triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>non ionic surfactant. Used for cell fixation</td></tr><tr><td>sodium borohydride (NaBH4)</td><td>Sigma</td><td>452904-25ML</td><td>cell fixation</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>sample passivation 3% in PBS</td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>primary antibodies</td></tr><tr><td>Rat anti alpha tubulin</td><td>Biorad</td><td>MCA77G</td><td>primary antibodies</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Fisher scientific</td><td>10635923</td><td>secondary antibodies</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Fisher scientific</td><td>10226162</td><td>secondary antibodies</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &amp;micro;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td><td>Fisher scientific</td><td>T7279</td><td>fluorescent beads</td></tr><tr><td>Chamlide magnetic chamber</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL</td></tr><tr><td>Cysteamine (MEA)</td><td>Sigma</td><td>30070</td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>glucose oxidase from Aspergillus niger</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>glucose</td><td>sigma</td><td></td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>catalase from bovine liver</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>Tris (trizma)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>Wash-N-Dry coverslip rack</td><td>Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>paraffin film</td></tr><tr><td>ultrasonic cleaner</td><td>Fisher scientific</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>plasma cleaner</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intermediate filaments and microtubules with 2-dimensional direct stochastic optical reconstruction microscopy

アクチン フィラメント、微小管、中間径フィラメント (場合) から成る骨格はセルの形状、極性・細胞運動の制御に重要な役割を果たしています。微小管とアクチン ネットワークの組織が広く研究されていますが、IFs のまだ完全に特徴付けられない。IFs は、細胞の細胞質に広がるネットワーク 10 nm とフォームの平均直径を有する。アクチンと微小管分子モーター、細胞骨格のリンカーを物理的に関連付けられています。このタイトな関連付けは、ほとんどの細胞機能に必要な 3 つの細胞骨格ネットワークの連携制御機構を確保する規制メカニズムの核心です。したがって、If だけで、また一緒にそれぞれの他の骨格のネットワークを可視化することが重要です。ただし、場合ネットワークはほとんどの細胞の種類、グリア細胞の特に中に非常に密な解像度に標準の蛍光顕微鏡と達成するために非常に困難なる (~ 250 の解像度を横 nm)。直接確率光再建顕微鏡 (dSTORM) はゲイン 1 桁の水平解像度で可能にする技法です。ここでは、横 dSTORM 解像度ある場合ネットワークの特に、もし束周囲の微小管の密な組織を解決するための十分なことを示します。このような緊密な関連が説明する、これら 2 つのネットワークの連携制御機構に参加する可能性がどのようにビメンチン IFs テンプレートと微小管の組織を安定させると同様、微小管依存の小胞輸送に影響を与える可能性があります。もっと一般に、デュアル カラー dSTORM 技術 2 つの細胞骨格成分の観測が彼らの相互作用に新しい洞察力をもたらす方法を示す.

アルファ Plan Apo 100 X 512 x 512 カメラ 50 mW 405 nm と 100 mW 488、561、642 nm 固体レーザ、EMCCD 搭載顕微鏡/570 650 を渡す/655 放出フィルターがロングパス 1.46 の目標とバンド以下に示す代表的な結果を得るのために使用されました。
図 1 aは、対雑音比 raw 画像取得時に使用する分子密度と信号の例を与えます。良い品質の画像は、隣接分子間 〜 1 μ m の最小値が得られます。良い点滅状態で fluorophores が付いてはのみ 1 つのフレーム内に存在する必要があります。画像バッファー条件 (pH、還元剤、酸素システムを消去) を調整する必要があります良い点滅とレーザーに- とオフ-料金の蛍光物質したがって、義務に影響を及ぼすサイクル (、fluorophore に費やしている時間の割合オン状態)9,11。図 1 b、それどころか、分子密度が高すぎる単一分子を解決できない raw 画像の例を与えます。
図 1は、すべての分子を検出し、20 000 フレームのスタックからメーカー ソフトウェアによって分析のため定位精度の典型的なヒストグラムを示しています。このヒストグラムは、図 3Bに示す微小管ネットワークの dSTORM イメージに対応します。製造元のソフトウェアによって提供されるローカリゼーション精度の値は、異なる時間ポイント22 (図 1) に局在する分子のポインティング精度を使って値推定次ステップ 8 とよく一致です。
図 2 aは、Alexa647 とビメンチン フィラメント カルビンディン抗体の dSTORM イメージの典型的な例を示しています。解像度の増加は、標準的な広視野顕微鏡 (図 2 b・ C) で取得した画像と比較に明確に観察できます。図 2 Dで表される蛍光強度分布を示す、超解像顕微鏡イメージングは、ビメンチン バンドルを解決することができます。DSTORM 解像度はフィラメント バンドルの現在の数をカウントするのに十分です。
図 3は、それぞれ Alexa647 と Alexa555 ビメンチンとチューブリン ネットワーク カルビンディン抗体のデュアル カラー dSTORM イメージの典型的な例を示します。ビメンチン バンドルがしばしば 2 つの骨格サブシステム間の結合に重要な構造情報を提供する微小管に沿ってローカライズされている 2 つのネットワークのオーバーレイが表示されます。
図 4は、非最適条件で得られた微小 dSTORM 画像のさまざまな例を示します。まず、Alexa488 とバッファーを使用して 143 mM β-メルカプトエタノール (MEA9,10,11の代わりに使用される別の還元的エージェント) と (0.5 mg/mL グルコースオキシダーゼと 40 μ G/ml から成る酸素清掃システムカタラーゼ)、フルオロ瞬いていたが、正確にローカライズされた (低すぎる光子の数) には十分に明るいでした (図 4 a)。第二に、143 mM β-メルカプトエタノール、50 mM MEA 清掃システム酸素と Alexa555 を使用して、fluorophores が付いて暗い状態に励起される可能性があります、したがってできませんよく空間的分離 (高すぎるのデューティ ・ サイクル、すなわち「オン」の状態での時間の割合長すぎます) (図 4 b)。最後に、143 mM β-メルカプトエタノール、50 mM MEA 清掃システム酸素と Alexa568 を使用して、fluorophores が付いてなかった明るいしがゆっくり点滅が非常に長い「オン」と「オフ」状態 (低光子数とあまりにも高いデューティ サイクル) (図 4)。これらのすべての非最適な条件で微小管ネットワークは不十分な超解像画像で表示されます。結論としては、最適な条件が高い光子数と fluorophores が付いてを必要とし、低デューティ サイクル9,10対応するイメージング バッファー。注意最適化密度をラベリングと良い点滅条件を取得するバッファーの状態をイメージング デュアル カラー dSTORM の標準的な手順は、場合に微小管のイメージングに固有ではありません。
ナイキスト ・ シャノンの定理によると少なくとも 10 fluorophores がある必要がある 20 の解像度を持つ nm nm。2次元構造を拡張、デンプシーら推定 μ m2あたり 10 〜4 fluorophores のラベル付けが必要であります。場合ネットワークは高密度のフィラメント、微小管ネットワークに細い (直径 10 nm 対 25 nm 第一次および二次抗体なし) 比較と、2 回以上のローカライズが場合ネットワークを記述するために必要なことを見ました。5 000 のローカライズ/μ m2の場合とそれぞれ 40 000 フレームと 20 000 フレームで得られた微小管の 2500 のローカライズ/µm² と良い画像を得た。最高解像度の画像が得られた σSMLMの局在化の精度 〜 8-12 nm の次のステップ 8 (別の時間に局在した単一分子のポインティング精度点22) プロトコルの推定します。ローカリゼーションの精度の推定 (例を図 1に示すように) の生のデータで検出されたすべての分子から抽出した定位精度のヒストグラムの製造元のソフトウェアによって提供される値とよく一致しました。このような定位精度が ~ 30 の解像度を持つ画像を提供できる nm (2.35 * 精度) 標識の密度が十分に高い場合。我々 は日常的に全角で半分最大 (FWMH) 〜 40 nm のビメンチン フィラメントと微小管幅 FWMH 〜 55 の観察 nm。定位精度とローカリゼーション密度の両方に依存する画像の解像度、両方の条件を考慮して最良の結果をできる実験条件を提供しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig1.jpg"> 図 1: 買収とローカリゼーションの精度推定時に単一分子の最適密度。 (B)左:抗ビメンチンと抗マウス(A)明るい状態の単一分子の最適密度と密度が高すぎて単一のフレームから代表的な raw 画像嵐取得 (ステップ 6.12。) 固定 U373 セルの中に(B)染色Alexa647。右:Raw 画像は、単一分子蛍光レベル (6 セット) ・ ノイズしきい値にピーク強度を超えるが円 (白または赤) に囲まれています。円の直径はピーク マスク サイズ (9 ピクセルに設定) によって設定され、色はない、または分子 (赤) と重なるかどうかを判断します (白)。重複は考慮されません嵐画像再構成のための分子を大量に ((B)) の単一分子鉛の高密度に注意してください。A埋め込み:赤で単一分子とそのガウスの一般的な蛍光強度分布を示すグラフがブラックに収まります。この例では、ローカリゼーションの精度は σx = 6.7 nm。スケール バー、1 μ m. すべての分子の局在精度の(C)の典型的なヒストグラム検出し、メーカー ソフトウェアによって分析します。それは視覚化することができます、オンライン処理のおかげで生データの取得中に定期的に更新されます。このヒストグラムは、図 3Bに示す微小管ネットワークの dSTORM イメージに対応します。(D)左:復興後ガラス表面上の単一分子の嵐画像を表します。右:ガウシアンフィッティング後に得られた X と Y の位置のヒストグラム。X と Y の分布のフィッティング ガウスの定位精度の見積もりを与えます。<a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig2.jpg"> 図 2: ビメンチン ネットワークの代表 dSTORM イメージ。dSTORM イメージ(A)、対応する標準的な広視野画像(B)と(C) U373 グリア細胞プロトコルで説明されているように固定し、Alexa647 とビメンチンのステンド グラスのリーディング エッジを表示のオーバーレイします。ハイライト表示領域の下: ズーム。(D)横強度プロファイル a 拡大画像の黄色の線に沿って B. スケール バー、2 μ m と 500 nm のズーム。<a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig3.jpg"> 図 3: ビメンチンと微小管ネットワークの代表的なデュアル色 dSTORM イメージ。(A)ビメンチン ネットワークに染まった Alexa647 (図 2 aと同じ)。(B)微小管ネットワークは、Alexa555 ラベルの付いた。ビメンチン (赤) と右上のズーム領域を微小管 (シアン) ネットワークの(C)オーバーレイ。40 000 フレームからローカライズの ~1.5 百万を得たビメンチンの dSTORM 画像。〜 850 000 20 000 フレームからローカライズを得た微小 dSTORM 画像。スケール バー、2 μ m と 500 nm のズーム。<a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig4.jpg"> 図 4: 微小管の非最適撮影条件の例です。とき、fluorophores が付いて点滅が、十分に明るい、Alexa488 ラベルによるチューブリン U373 グリア細胞と 143 mM BetaMercaptoethanol とイメージングのバッファー (A)、脱酸素剤、fluorophores が付いて十分に明るいが、正しくできない場合は枯渇 (利用可能な最大のレーザー力) で暗い状態で点滅ゆっくりで 143 mM の BetaMercaptoethanol、50 mM MEA チューブリンと酸素スカベン ジャー バッファー (B)というラベルの付いた Alexa555 と fluorophores が付いてゆっくりと点滅と明るい Alexa568 を使用してない場合143 mM BetaMercaptoethanol、50 mM MEA と脱酸素剤を含む嵐バッファーのチューブリンをラベル付け(C).これらのすべてのケースで dSTORM 画像は解像度を低下しました。スケール バー、2 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig5.jpg"> 図 5: U373 セルのビメンチンと微小管ネットワークの代表的なデュアル色 dSTORM イメージを 5 分のメタノール固定(A)ビメンチンと(B)の微小管ネットワークの付いた Alexa647 と Alexa555 それぞれ強調表示されているズーム。フィラメント ネットワークのグローバルの解像度を下げる細胞質に局在する細胞の前に単一の分子の存在を注意してください。スケール バー、2 μ m と 500 nm のズーム。<a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig6.jpg"> 図 6:DSTORM の比較再生像 (A) と雷雨 (フィジー プラグイン) (B) の製造元のソフトウェアによって再建された dSTORM イメージ。(C) オーバーレイのマゼンタの (A) と (B) のグリーン。スケール バー、2 μ m と 500 nm のズーム。<a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM イメージを実行するために、画像の獲得および復興にサンプル準備から最適な実験条件を与えるには

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

imaging-intermediate-filaments-microtubules-with-2-dimensional-direct

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K ビュー.  Institut Pasteur. この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM イメージを実行するために、画像の獲得および復興にサンプル準備から最適な実験条件を与えるには

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

生物工学

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

生化学

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

免疫・感染学

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

生物学

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as specialized arrays during mitosis to regulate chromosome segregation. Proteins that interact with microtubules include motors such as kinesins and dynein, which can generate active forces and directional motion, as well as non-motor proteins that crosslink filaments into higher-order networks or regulate filament dynamics. To date, biophysical studies of microtubule-associated proteins have overwhelmingly focused on the role of single motor proteins needed for vesicle transport, and significant progress has been made in elucidating the force-generating properties and mechanochemical regulation of kinesins and dyneins. However, for processes in which microtubules act both as cargo and track, such as during filament sliding within the mitotic spindle, much less is understood about the biophysical regulation of ensembles of the crosslinking proteins involved. Here, we detail our methodology for directly probing force generation and response within crosslinked microtubule minimal networks reconstituted from purified microtubules and mitotic proteins. Microtubule pairs are crosslinked by proteins of interest, one microtubule is immobilized to a microscope coverslip, and the second microtubule is manipulated by an optical trap. Simultaneous total internal reflection fluorescence microscopy allows for multichannel visualization of all the components of this microtubule network as the filaments slide apart to generate force. We also demonstrate how these techniques can be used to probe pushing forces exerted by kinesin-5 ensembles and how viscous braking forces arise between sliding microtubule pairs crosslinked by the mitotic MAP PRC1. These assays provide insights into the mechanisms of spindle assembly and function and can be more broadly adapted to study dense microtubule network mechanics in diverse contexts, such as the axon and dendrites of neurons and polar epithelial cells.

Here, we present a protocol for reconstituting microtubule bundles in vitro and directly quantifying the forces exerted within them using simultaneous optical trapping and total internal reflection fluorescence microscopy. This assay allows for nanoscale-level measurement of the forces and displacements generated by protein ensembles within active microtubule networks.

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as ...

細胞骨格ネットワークを可視化するカスタマイズ可能な蛍光顕微鏡

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the dynamics of these 3D, dense networks calls for optical sectioning, which is often associated with fluorescence confocal microscopes. However, recent developments in light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) have established it as a cost-effective and, at times, superior alternative. To make LSFM accessible to cytoskeleton researchers less familiar with optics, we present a step-by-step beginner's guide to building a versatile light-sheet fluorescence microscope from off-the-shelf components. To enable sample mounting with traditional slide samples, this LSFM follows the single-objective light-sheet (SOLS) design, which utilizes a single objective for both the excitation and emission collection. We describe the function of each component of the SOLS in sufficient detail to allow readers to modify the instrumentation and design it to fit their specific needs. Finally, we demonstrate the use of this custom SOLS instrument by visualizing asters in kinesin-driven microtubule networks.

著者スポットライト:ライトシート顕微鏡による平衡から遠い材料の知識の進歩

This protocol describes in detail how to build a single-objective, light-sheet fluorescence microscope and its usage for visualizing cytoskeleton networks.

細胞骨格ネットワークの可視化のためのカスタマイズ可能な単一対物レンズライトシート蛍光顕微鏡の設計と構築

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

要約

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ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

TIRF顕微鏡によるインビトロでの架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

細胞骨格ネットワークの可視化のためのカスタマイズ可能な単一対物レンズライトシート蛍光顕微鏡の設計と構築

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

要約

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ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

細胞骨格ネットワークの可視化のためのカスタマイズ可能な単一対物レンズライトシート蛍光顕微鏡の設計と構築

TIRF顕微鏡によるインビトロでの架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化