この作品は、健康の国民の協会 (R01 AR061164 01A1) によって支えられました。

すべての実験手順は、機関動物ケアとメイン州医療センター研究所利用委員会によって承認されました。
1. 管の準備
<ol><li>10% 牛胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンの 1% 最小値必要な媒体 α (MEM α) を補うことでボーマン培地を作る。</li>
	<li>1.5 mL 遠心チューブにボーマン文化メディアの 100 μ L を配置します。3 骨は、単管はそうそれに応じて準備に通常収まります。</li>
	<li>遠心チューブ内に収まるように、200 μ L ピペット チップを十分の両端をカットします。チューブ内側のヒントを挿入し、蓋が氷の上にチューブを配置する前に閉じることができます。 注: また、両端カットと 0.75 mL 遠心チューブ挿入できます 1.5 mL 遠心チューブに。</li>
</ol>2. マウスの骨の収穫
<ol><li>頚部転位続いて CO2を使用して動物の安楽死、70% エタノール スプレー、それら。 注: は、同じ性別、好ましくは同じ時代からの動物が使用されることを確認します。我々 は日常的に動物 7 ~ 8 週間を高齢者を使用します。良い代表で再現可能なセルの人口をもたらすための実験グループごとの少なくとも 3 の動物からの細胞のプールをお勧めします。</li>
	<li>
解離性基板の裏面には、euthanized のマウスを置きます。鉗子を使用すると、腹部の皮膚のテントを作成できます。滅菌解剖はさみを使用して小さな切開 (約 1 cm) を確認します。下腹部と脚を公開するために手足のカットから足に向かって皮をむいて戻る。
	<ol>
<li>足首から下の足を削除する共同をカットします。腰骨から大腿骨頭部を分離するヒップで腸骨稜に沿って裁断します。マウスはまだその裏には、2 つの腸骨骨を分離する寛骨の真ん中に切開を行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>糸くずのワイプを使用して、慎重に、大腿骨、脛骨、および腸骨骨から筋肉を取り外します。 注: は、迅速かつ容易に (例えばキムワイプ) 糸くずワイプ クリーニング可能と腱と骨から筋肉をできるだけ切削。彼らは壊れやすい傾向があるし、その脆弱性を特定の遺伝子を増やすことができます骨を操作するときは、注意をしてください。</li>
	<li>すべてのサンプルを解剖すると、一度 PBS 氷の上にそれらを置くし、無菌培養フード分離の残りの手順に移動します。 注: 可能な限り無菌作業の文化に汚染の可能性が減ります。</li>
	<li>遠心チューブ内断面のヒントでそれらを配置する前に、骨の近位および遠位端に小さなカット (約 1 ~ 2 mm) をします。 メモ: 骨髄は; 遠心できる十分な量を削減することを確認します。ただし、注意する必要があります避けるために骨髄空間内の近接性に基づいて切断あまり細胞集団が異なる傾向があるようです。</li>
	<li>10,000 × g で遠心する 15 の室温で s。すべての骨髄はフラッシュし、挿入 (どちらか 200 μ L ピペット チップまたは 0.75 mL 遠心チューブ) の中骨は、1.5 mL チューブの下部にペレットを確認します。すべての骨髄を収集した後は、コレクション チューブからの骨に挿入を削除します。 注: すべての骨髄がフラッシュされる場合骨が白表示されます。ただし、特定の骨の骨髄が残っている場合切断端をやり直して、遠心分離機します。</li>
</ol>3. 細胞懸濁液
<ol><li>25 G 針、プルを使用してセルのペレットを上下ゆっくり群生を分割し、すべてのサンプルを組み合わせて単一の 15 mL の円錐管に。サンプルの 500 μ L あたり 10 mL BMSC 文化メディアを追加します。</li>
	<li>50 mL コニカル チューブの上に 70 μ m フィルターを置き、このフィルターを可能な限り骨片を除去するために細胞懸濁液を通過します。</li>
</ol>4. めっきと骨髄細胞 (合計 Bmc) の混合集団の文化
注: セルは 37 ° c 5% CO2インキュベーターで培養されます。
<ol><li>セルの数を計算して培地の 10 の6セル/cm2 × 1.0 でそれらをプレートします。添付する細胞の混合培養の 72 時間を許可します。 注: 培地で細胞懸濁液 20 x とトリパン青の診断を使用してセルを数える前に再度希釈を希釈することをお勧めします。7 週齢雄 C57Bl6/J マウス、我々 は日常的に6セルを約 50 x 10 のセル数を得られるが、年齢、性別、およびひずみ大幅細胞数に影響することができます。 メモ: セルのミックス人口も文化の下部に添付する必要があります。</li>
	<li>72 時間後、メディアを取り出し、新鮮なメディアに置き換えます。他のすべての日と密度のチェック、メディアを変更するを続行します。セルが 80-100% の confluency に達したら、差別化のため準備ができています。 注: 理由はこの文化が BMSCs と HSCs 混合、それ直接使用できます osteoblastogenesis、脂肪細胞形成と破骨細胞形成のため。</li>
</ol>5. めっき BMSCs (付着 BMSCs) の分割の人口の文化
注: セルは 37 ° c 5% CO2インキュベーターで培養されます。
<ol><li>プレート 10 cm 培養皿 (55 cm の2つの文化圏の) に大腿骨、脛骨、および 1 つのマウスの腸骨骨から収集されたすべてのセル。 注: 2-3 c57bl/6 j マウスをプールする場合私たち通常板 150 cm2フラスコでこの '総' 骨髄人口。</li>
	<li>混合培養 48 時間後 (非付着 HSCs を含む) 文化メディアを削除します。破骨細胞形成実験を実行する場合は、非付着性のセルはさておき (セクション 7 を参照)、そうでない場合、吸引のこの集団を設定し、これらの細胞を破棄します。</li>
	<li>添付の細胞を邪魔しないよう慎重に PBS のプレート/フラスコを洗います。</li>
	<li>PBS を取り外し、0.25% トリプシンを追加し、細胞懸濁液をセルのメディアを追加することによって 1-3 分、トリプシンの抑制の 37 ° C で培養細胞を取り出します。この時点で、BMSCs が解除される、ことができます (以前にやった手順 4.1) としてカウントし将来実験用メッキします。</li>
	<li>めっきに必要なセルの数を計算します。室温で 5 分間 1,000 x g で細胞を懸濁液の必要量を遠心します。 注: セル通常めっきエンドポイント実験に基づいています。たとえば、タンパク質・ RNA を分離する場合より高い密度 (~1.0-2.0 x 106細胞/ウェルで 6 ウェル プレート) で私たちをプレートと通常。</li>
	<li>メディアを取り出し、めっきに必要な培地量で細胞ペレットを再懸濁します。実験によると培地で細胞をプレートし、数日間アタッチすることを許可します。BMSCs の confluency に到達、分化を実行に進みます。</li>
</ol>6. BMSCs の分化
<ol><li>
骨芽細胞
	<ol>
<li>骨芽細胞分化メディア 1 M β-グリセリンの 800 μ L を追加することによってリン酸 PBS で 200 μ L の PBS で 0.5 M アスコルビン酸 99 mL BMSC 文化メディア (手順 1.1 BMSC 培地の組成を参照してください)。<ol>
<li>BMSCs 文化 (4.3 のステップから合計 Bmc) または付着 BMSCs ステップ 5.6 から合流されたら、骨芽細胞によって区別骨芽細胞分化メディア文化メディアの切り替え。</li>
		</ol>
</li>
		<li>一日おき分化メディアを交換します。セルは、無機の白色結節を生産開始します。肉眼で、井戸の底にそれらを可視化します。このプロセスは、3 週間に数日以内に発生します。<ol>
<li>Osteoblastogenesis を評価するためにアルカリホスファターゼ染色および/またはコッサ染色セクション 8 で前述の井戸でを実行します。 注: セル単一層の混乱を避けるためにわずかな角度でプレートを傾けることによって慎重に、メディアを変更します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脂肪細胞
	<ol>
<li>ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 高グルコース、牛胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシンの 1 mL、100 μ L の 20 mM ロシグリタゾンと 2 mM インシュリンの 100 μ L の 10 mL の 90 mL を一緒に混合することによって脂肪細胞の基本メディアを作る。必要な場合は、分化実験中に週の 4 ° C でこのメディアを格納します。</li>
		<li>62.5 mM 3-イソブチル-1 - メチルキサンチン (IBMX) 200 μ L を追加することによって脂肪細胞誘導メディアを作ると脂肪細胞ベース メディア 25 mL に 1 mm デキサメタゾン 25 μ L。</li>
		<li>BMSCs 文化 (4.3 のステップから合計 Bmc) または付着 BMSCs ステップ 5.6 から合流されたら、脂肪細胞誘導メディアにメディアを変更します。この日 0 分化を検討してください。</li>
		<li>48 時間後に、メディアを取り出し、脂肪細胞誘導メディアと文化を更新します。</li>
		<li>4 日目の脂肪細胞基本メディアに切り替えます。 注: 脂質 2 日か 4 日早ければ掲載が開始します。</li>
		<li>7 日、セルが最大脂肪滴蓄積し、成熟した脂肪細胞に類似した表現型を表示を確認します。細胞の死/剥離可能性があります、このポイントを過ぎて文化はないです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. HSCs の破骨細胞への分化
<ol><li>25 μ g/mL の受容体活性化の NFKB リガンド (RANKL)、大食細胞のコロニー刺激的な要因 (mCSF) の 25 μ g/mL の 15 μ L の 50 μ L を 25 mL BMSC 文化メディアに追加することで破骨細胞分化のメディアを作る。</li>
	<li>いったん井戸に (手順 4.3) から合計 Bmc または (ステップ 5.2) から非付着性のセルを追加すると、文化メディアは破骨細胞分化メディアに切り替えることができます。一日おきの分化メディアを補充します。</li>
	<li>10 倍の倍率の顕微鏡で毎日破骨細胞文化を観察します。破骨細胞が融合し、分化の 5-7 日目の周りに通常の多核巨細胞の細胞を形成を観察します。</li>
</ol>8. 染色
<ol><li>
骨芽細胞 注: アルカリ性ホスファターゼ (AP) 染色、私たちはしばしば用 AP 染色キット (材料の表を参照してください) のガイドラインに従って。<ol>
<li>AP 染色キット製造元のガイドラインを実行します。<ol>
<li>メディアを吸引し、PBS のセルをすすいでください。4% のセルを修復するパラホルムアルデヒド (PFA) 室温で 12 分 PBS。</li>
			<li>一方で、ap を 500 μ L を追加することによってキットを染色試薬を使用して AP ソリューションを作る 500 μ L FRV アルカリ溶液と軽く; 混合する亜硝酸ナトリウム放置 2分追加 22.5 mL dH2O および 500 μ L ナフトール AS BI アルカリ。優しく混ぜます。 注意: PFA は毒性があり注意して処理する必要があります。</li>
			<li>セルが修正されると、PBS で洗い、AP ソリューションを各ウェル (ウェルあたり 1 ~ 2 mL) に追加します。アルミ箔と光から保護部屋の温度で 30 分間させて汚れをカバーします。ソリューションを吸引、蒸留水で洗うし、乾燥するプレートを許可します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ステンド グラスの植民地アルカリ性フォスファターゼ陽性細胞を観察するためにカメラを使用しての画像を取得します。</li>
		<li>また代わりにアルカリホスファターゼ染色コッサを実行します。このため、硝酸銀.に任意の残りの PBS を沈殿させるように蒸留水で十分に井戸を洗う
		<ol>
<li>4% のセルを修復する室温で 12 分 PBS で PFA。井戸をカバーし、室温で 1 時間強い光に露出する十分な 5% 硝酸銀溶液を追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>銀製硝酸塩の解決を削除し、蒸留水の各ウェルを洗浄します。セルに 5% チオ硫酸ナトリウム溶液を追加し、3 分間放置します。</li>
		<li>チオ硫酸ナトリウムを吸引し、蒸留水で洗ってください。プレート乾燥し、鉱床で肉眼で見えるダークブラウン/ブラックに染色の観察をしましょう。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脂肪細胞
	<ol>
<li>オイル赤 O (オロ) の染色、10% を使用してセルを修復する中性緩衝ホルマリン室温で 1 時間。</li>
		<li>一方で、0.035 g イソプロパノール 10 mL に溶解オロ在庫ソリューションを作る。これで 6 ウェル プレートで十分です。ミックスし、1 つのフィルター紙 (細孔サイズ 11 μ m) を使用して、ソリューションを渡します。</li>
		<li>6 mL の蒸留水とオロ原液の 9 mL を希釈してオロ作業ソリューションを作る。使用する準備ができるまで、ロッカーにソリューションを残します。</li>
		<li>蒸留水で 60% イソプロパノールを準備 (それぞれをカバーするために十分なことも)。</li>
		<li>セルは固定で後は、蒸留水と一度で定着性と洗浄を削除します。1 分 60% イソプロパノール溶液と水を交換してください。 注: は、プレートを転倒しながらゆっくりと液体を追加します。脂肪細胞を非常に簡単に取り除きます。</li>
		<li>イソプロパノールを削除し、すべてのセルをカバーする十分なオロ作業ソリューションを追加します。低速ロッカー室温で 15 分間インキュベートします。オロを外し、蒸留水で 2 回洗います。 注: この時点で、オロ ステンド脂質液滴視覚化できます顕微鏡下で。</li>
		<li>オロを定量化するには、各ウェルに 100% イソプロパノールの 1 mL を追加し、10 分間ゆっくりと揺動によって、オロをすすぐ。</li>
		<li>一方で、オロ作業ソリューションを使用して以下の 8 規格に基づく標準曲線を作成する希釈系列を準備 (2,100 μ g/mL) および希釈剤としてイソプロパノール: 500、350、300、250、150、100、75、および 0 μ g/mL。</li>
		<li>200 μ L 基準と皿の上をトリプリケートで destained のサンプルをロードし、490 で吸光度を読み nm。<ol>
<li>オロの基準曲線に基づいた各サンプルの濃度を決定します。 注: セル番号に濃度オロの正規化をお勧めします。細胞数は、クリスタル バイオレット染色または DNA の量によって定量化することができます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
破骨細胞 注: 準備ができたら、酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) トラップの染色を使用してキット (材料の表を参照) を破骨細胞を染色をお勧めします。<ol>
<li>TRAP 染色、PBS で 2.5% グルタルアルデヒドで室温で 30 分間セルを修正します。一方で、一緒に高速ガーネット ベース ソリューションの 50 μ L、亜硝酸ナトリウム、蒸留水の 4.55 ミリリットル、Napthol AS Biphosphate、酢酸溶液 200 μ L、100 μ L 酒石酸ソリューションの 50 μ L の 50 μ L を混合することによってトラップ ソリューションを作る。</li>
		<li>定着剤を離れて吸い出しなさい、37 ° C で 1 時間トラップ ソリューションを追加する前に 2 回 PBS のセルをすすいでください。</li>
		<li>顕微鏡 (倍率 10 X) 破骨細胞をカウントする前に蒸留水で洗います。トラップ+セルは 3 つ以上の核を持つ紫色の表示されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は、興味の金融紛争があるないことを開示します。

この記事で BMSCs の文化の 2 つの方法は、それぞれの利点と制限が表示されます。骨の髄から来る細胞を分離することは、比較的楽なプロセスです。ただし、間葉系幹細胞や破骨細胞前駆細胞の代表的な細胞集団を取得骨髄腔の多様な細胞内環境のために挑戦することができます。
骨髄内容の全体を養殖生体内微小環境の状態を提供します。まだ、非常に異なる数?...

1の初期の 1980年年の発見以来、プライマリ マウス BMSCs、間葉系幹細胞の in vitroモデルとして使用されます。確かに、長管骨の骨髄腔からフラッシュ プラスチック付着性細胞の培養骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または多くの研究2,3、で脂肪細胞に分化する能力を維持します。4,5します。 ただし、骨髄は、BMSCs、に限定されない、造血、内皮細胞と免疫細胞を含む多くの異なる細胞集団で構成されるユニークな組織です。したがって、分離と培養の技術は、異なる同質性を持つ細胞集団をもたらすことができます。細胞からの分化の能力をテストするようなテクニックを使用して挑戦することができます。たとえば、異なる遺伝子を持つマウスから細胞を比較すると、データの解釈に制限混合セル人口から始まります。逆に、技術的に難しいことができます BMSCs の HSCs 同種個体群を取得し、代表できない場合があります前のヴィヴォモデルの。
当研究室で主に脂肪細胞、破骨細胞、骨芽細胞に分化する潜在性のため BMSCs の活用に興味を持っております。ここでは、BMSCs と HSCs の分離、osteoblastogenesis または脂肪細胞形成の in vitro評価するために使用されるカルチャのテクニックだけでなく、破骨細胞に分化する造血の文化を提案します。1 つの方法は、BMSCs と脂肪細胞形成、osteoblastogenesis、破骨細胞形成 (合計 Bmc と呼ばれる) に直接適して HSCs を含む骨髄細胞 (Bmc) の混合された人口を使用します。このメソッドは、不均一性骨髄微小環境の細胞の中で見つかった前のヴィヴォ近い表現です。別の方法は、BMSCs と (呼ばれる付着 BMSCs) HSCs の文化「純粋な」集団にしようとの付着性の非付着性のセルからを分離します。以降のメソッドを使用する細胞培養 BMSCs または HSCs のより正確な数を開始する実験し、文化に残る他の細胞の複雑な間接効果の可能性が低くなります。両方の方法は以前発行し、さまざまな研究の質問6,7,8,9に対処するために使用します。

<table><tbody><tr><td>200&amp;mu;L pipet tips&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Silver Nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&amp;alpha;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerol phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer inverter microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

骨髄間質細胞 (BMSCs) は、間葉系幹細胞の表現として日常的に使用されるセル人口を構成するの in vitro 。彼らは、造血幹細胞 (造血)、赤血球、免疫前駆細胞と破骨細胞に上昇を与えることができると一緒に骨髄腔内に存在します。このように、様々 な細胞の集団があり、実験的なデザインの課題を提示することができますし、データの解釈を混同の非常に混在で骨髄の結果からセル人口の抽出。いくつかの単離と培養の技術は、BMSCs と HSCs体外のもっとまたはより少なく同質な人口を得るために実験室で開発されています。ここ、BMSCs の HSCs マウス長管骨からの分離のための 2 つの方法を提案する: BMSCs の HSCs の混合された人口を生成する 1 つの方法と 2 つの細胞集団を分離しようとすると、1 つのメソッド順守に基づきます。両方の方法に適した細胞を提供する骨と脂肪細胞分化実験機能的な試金。

細胞培養の概要 2 つのカルチャの技術は、BMSCs と造血 (合計 Bmc、図 1 a) から成る Bmc の混合された人口または人口 BMSCs の分化の評価は HSCs (付着 BMSCs、図 1 b) から分割を許可します。骨の髄からセルを分離して (図 1) をメッキ後の 48 時間は、彼らは急速にプラスチック培養プレートの下...

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

この記事で分離し、マウス長管骨から骨髄間質細胞と造血幹細胞を区別する手法を提案します。2 つの異なるプロトコル拡大と骨芽細胞、脂肪細胞、破骨細胞への分化誘導に適した多収の異なる細胞集団を掲載されています。

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.0K ビュー.  Maine Medical Center Research Institute. この記事で分離し、マウス長管骨から骨髄間質細胞と造血幹細胞を区別する手法を提案します。2 つの異なるプロトコル拡大と骨芽細胞、脂肪細胞、破骨細胞への分化誘導に適した多収の異なる細胞集団を掲載されています。

ビデオ: Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

発生生物学

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

免疫・感染学

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

生物学

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

胸腺および骨髄からの間質細胞単離の最適化

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

著者スポットライト:シングルセルシーケンシングのための間質細胞単離を用いた造血研究の推進

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

造血器官からの間質細胞の単離

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

要約

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マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

造血器官からの間質細胞の単離

造血器官からの間質細胞の単離

造血器官からの間質細胞の単離

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

ラット骨髄からの破骨細胞前駆体の分離・精製・分化