この出版物で報告された研究は、国立老化研究所、高齢者の齧歯動物のコロニー (ナンシー ネイドン) から 14 ヶ月歳雌 CBA マウスの気前のいい贈り物とユタ州立大学獣医学校、動物、酪農サポートされています。・獣医科学。

ここで説明したすべてのメソッドは、国家研究評議会ガイドは、ケアと実験動物の使用のためのガイドラインとユタ州立大学機関動物のケアおよび使用委員会によって承認されているの下で開発されました。
注: 卵巣移植の手順は、生後 18 カ月に 21 日齢からマウス (CBA/J ひずみ) を伴うことがあります。CBA/J 系統のマウスの生殖年齢の 45 から 60 日の間有能ななり、生殖年齢の 10 と 12 ヶ月の間老化。
1. 老齢マウスにそのまま卵巣の移植
メモ: この最初のプロトコルでは、転送中に卵巣の若いマウス (60 日齢) から女性の postreproductive に (年齢 12 ヶ月) 同じ交の使用手順について説明します。同じ手順は、任意の 2 つのメスのマウスの卵巣移植に用いられます。
<ol><li>重量を量るし、腹腔内 (i. p.、27 ga 針) によるドナー動物を麻酔注射、たとえばケタミン ・ キシラジン アセプロマジンのカクテルを使用して (65 mg/kg ケタミン、13 mg/kg キシラジン 2.0 mg/kg, アセプロマジン; カクテル線量 - 6.5 ml/kg)。麻酔が効いたまで温水ホーム ケージに動物を返します。</li>
	<li>麻酔、一度ホーム ケージと温水ペーパー タオル上の場所から動物を削除します。バリカン (#40 刃優先)、削除正中線側、肋骨のすぐ下を開始し遠位に移動、準備、切り取られた髪に数 mm 外側を 'パッチ' 髪のストリップを残して傾向があるマウスの両側に約 2-3 cm 角を使用約 1-2 cm 正中線をカバーします。</li>
	<li>軽く 70% エタノールでクリップされた領域を拭くし、betadine ソリューションを綿棒でクリップされたサイトに適用されます。</li>
	<li>目の保護のため抗生物質のジェルし、メロキシカム (2.0 mg/kg) を皮下管理 (サウスカロライナ州 27 ga 針) 術後鎮痛のための動物の首の外側の面に。</li>
	<li>加熱滅菌手術野腹臥位で動物を置き、70% エタノールに浸した 2 cm × 2 cm の綿ガーゼでクリップされた領域を拭いてください。</li>
	<li>1.0 〜 1.5 cm paralumbar 切開そしてぶっきらぼう基本的な筋膜から皮膚を解剖します。もう一つ、筋膜切開を確認します。ぶっきらぼう解剖横方向にこの筋膜の下で可能な限り表面的腹腔内に到達するまで</li>
	<li>場所切開 (2 cm × 2 cm ガーゼから切り取り) とウェット ドレープ滅菌生理食塩水と小さな手術ドレープ。</li>
	<li>小鉗子を使用して、腹腔内に卵巣を取り囲む脂肪組織優しく脂肪パッドと卵巣を抽出し、接液ガーゼのドレープの上に置きます。卵巣の脂肪パッドは周囲の脂肪組織よりも「白」で表示されます。</li>
	<li>(卵巣の嚢を妨げない世話) 脂肪パッドに 1.5 インチ ブルドッグ クランプを置くプロシージャの間に場所で、管を保持します。</li>
	<li>所定の位置に解剖顕微鏡を移動し、卵巣の嚢を明確に識別します。2 つの時計鉗子で滑液包をつかみ、卵巣を公開する卵巣門部反対側卵巣嚢を切開します。滑液包の目的のアクセス領域は血管高度場合は、断裂の時に出血を減らすためにファブリキウス嚢の表面に注射器でエピネフリン (1: 100, 000) のドロップを適用します。</li>
	<li>優しく卵巣嚢から卵巣を削除し、卵巣門部での出血を防ぐために時計鉗子でクランプで卵巣を切除します。</li>
	<li>ドナー卵巣が、4 ° C 滅菌生理食塩水で満たされた時計ガラス、緩くカバー、移植の準備ができるまで置いておきます。理想的には、卵巣は、移植の時に外科医が簡単に把握できるように追加の解剖顕微鏡の下で見るガラスを配置します。</li>
	<li>この時点でか、安楽死させるまたは後時点でプレース ホルダー ガラス ビーズ細胞や組織移植卵巣を受信する (する必要があります継続的に監視する) ドナー マウスをおきます。</li>
	<li>清潔な手術野と楽器、上記として受信者の動物を ovariectomize します。古いマウス脂肪組織の増加量を持っている傾向があるし、増加の麻酔薬投与量 (最大 20%) を必要とする場合があります。</li>
	<li>受信者から卵巣の切除、出血制御と凝固を支援し生理食塩水に浸したガーゼの小片を置きます露出サイト空の滑液包内止血泡パッドの小片を置きます。</li>
	<li>ドナー卵巣 (または組織、細胞、プレース ホルダー ガラス ビーズ) 1 つの鉗子手し、顕微鏡の視野に移動時計とを検索します。反対側の手で別の鉗子、ガーゼを削除し、同時に滑液包から滑液包内新しい卵巣を配置しながら止血泡パッドを取り外します。</li>
	<li>受信者の滑液包内に収まらない新しい卵巣半分または 1/3 (1/4) のドナー卵巣を切り取っての部分の滑液包に配置。滑液包は全体の卵巣を完全に覆っていない場合配置嚢、卵巣および場所で卵巣を保持する滑液包を通って縫合 (ディスカッション セクションを参照)。 注: ガラスビーズ プレース ホルダーを時計師の鉗子で処理することは困難にすることができます。</li>
	<li>滑液包の中のガラス玉を置くとき大きい鉗子でビーズを拾うし、卵巣嚢の横の脂肪パッドの上にドロップします。滑液包にビーズをロールバックします。</li>
	<li>テーパー針と 9-0 または 10-0 のモノフィラメント縫合糸で既に読み込まれてカストロヴィーホー針ホルダーをピックアップ、滑液包の引き裂かれたエッジを検索し、1 つまたは 2 つのホルステッド縫合糸を使用してブルサを閉じます。 注: 縫合は、時計職人やその他の小さな鉗子で代わりに実行できます。</li>
	<li>滅菌生理食塩水で軽くサイトを灌漑、脂肪パッド クランプを削除し、卵巣/脂肪パッドを腹部に戻します。</li>
	<li>ドレープを削除し、6-0 クロム腸または vicryl に腹壁を閉じます。顕微鏡の有無、この手順を実行することができます。</li>
	<li>脇 (前の手順で移動していない) 場合に、顕微鏡を移動して傷 9 ミリメートル クリップで皮膚を閉じます。</li>
	<li>光から遮断された温水回復ケージに動物を配置し、麻酔から回復まで継続的に動物を監視します。その他メロキシカムは示される場合は手術後 24 時間使用できます。手術後約 9 日間傷クリップを削除します。 注: 免疫抑制技術は採用ないと移植後または死で移植片対宿主病の証拠を検出できません。</li>
</ol>2. 胚細胞の移植は、そのままマウス卵巣を消耗されています。
注: このプロトコルには、若い、生殖細胞枯渇マウスから卵巣の postreproductive 女性への転送が含まれます。このプロトコルでは卵巣の受信者と卵巣摘出と移植の手順は、上記のように例外に原始、プライマリ卵胞/生殖細胞の劣化移植卵巣が化学的にされていること。残りのセカンダリと幽門卵胞募集/閉鎖生殖細胞に欠けている卵巣を残してが行われます。4-ビニルシクロヘキセン diepoxide (VCD) と生殖細胞の枯渇はよく説明16です。VCD は毒素であります。VCD 治療卵巣非投与マウスに移植されている、ためこの手順 VCD の毒性にさらされていないマウスで VCD 治療卵巣から寄与します。このプロトコルでは、若い卵巣移植モデルにおける生殖細胞枯渇のための手順について説明します。
<ol><li>使用するまで注入と 4 ° C でストアのごま油で VCD (64 mg/mL) を希釈します。</li>
	<li>卵巣ドナー一日一回 VCD i. p. (160 mg/kg) での注入 28 日齢から 15 日間。ごま油の同じスケジュールを以下にコントロール マウスを注入します。</li>
	<li>50 日齢、上記 10 日間 VCD 処理し、オイルだけで扱われるマウス生殖周期の停止を確認します。60 日齢、VCD 処理マウスない生殖腺入力の細胞学的証拠が表示されます。</li>
	<li>60 日齢マウスから卵巣を回復し、上記のように移植します。</li>
	<li>生殖サイクルの欠如、アンドロステンジオンの循環の増加されたレベルの検出による卵巣の生殖細胞枯渇の巧妙な移植を決定します。VCD17生殖細胞枯渇後、アンドロゲン: エストロゲンの比率が大幅に増加します。</li>
	<li>10-14 日術後膣細胞診を開始し、少なくとも 10 日間周期の正確な測定を確保するためのデータを収集します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>National Institutes of Health, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, Fertility and Infertility Branch. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Fertility+Status+as+a+Marker+of+Overall+Health'.+"Support+studies+that+investigate+fertility+status+as+a+marker+of+overall+health+for+both+men+and+women".">'Fertility Status as a Marker of Overall Health'. "Support studies that investigate fertility status as a marker of overall health for both men and women".</a> New Research Priorities. , (2016).</li><li>Eisenberg, M. L., Li, S. F., Behr, B., Cullen, M. R., Galusha, D., Lamb, D. J., Lipshultz, L. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+conservation+at+the+time+of+hysterectomy+and+long-term+health+outcomes+in+the+nurses'+health+study.">Ovarian conservation at the time of hysterectomy and long-term health outcomes in the nurses' health study.</a> Obstet Gynecol. 113, 1027-1037 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

卵巣摘出とそのままで、生殖細胞枯渇卵巣の移植は、21 日から生後 18 カ月までマウスで行われています。実行すると、卵巣摘出卵巣の嚢をそのまま維持することが望ましいが、ファブリキウス嚢の組織を切開するときに注意する必要があります。マウスは生後 6 か月よりも古い、滑液包の多くなる脂肪のパッドは、アクセスに使用できる領域を制限がかぶせてありました。これらのケースで...

生殖の健康と寿命に及ぼす影響はしばしば誤ってとして生殖能力を取囲む期間だけに限定されると考えます。一方、ライフ スタイルや寿命の生殖能力の段階に関連付けられている表現型は前後 postreproductive の段階から簡単に区別、生殖状態寿命のすべてのフェーズを通じて健康に影響します。生殖能力の期間は、時系列の寿命と違い生殖の寿命としても呼ばれます。この用語は、現実に 2 つの寿命指定の人工分離にそれ自身を貸す、両方がイベントで互いに密接に結ばれた影響を与える 1 つは、多くの場合、他にも影響を与えます。
過去 10 年間の証拠では、個々 の生殖の状態が慢性の健康条件1を開発のリスクの増加に関連付けられていることを示します。1 つの研究では、男性2のコホートの短い寿命のスパンと繁殖障害間の関連付けを記載されています。協会は、女性にももっと印象的です。心血管疾患は閉経前の女性3、まれであるが、卵巣障害更年期障害4で鋭く、早発閉経5若年成人女性の心血管疾患が増加します。インスリン抵抗6骨損失更年期障害7増加、ほぼ 3 分の 2 のアメリカ人のアルツハイマー病の女性8。卵巣シグナル伝達の明確な変化は、閉経前、耐病性の状態から閉経後、疾病負担の状態への移行をマークします。この安定した移行では、老化で病気リスクを加速するメカニズムを識別するために機会を示します。
最近では、凍結保存した卵巣組織の移植は、生殖細胞、化学療法などを危険にさらす可能性があります医療を受ける女性の出生率を復元する使用されています。卵巣のティッシュの移植は、トランスジェニック マウス9を含む非卵巣のベース不妊症動物の実行可能な子孫を生成する使用できます。卵巣移植、生殖機能や日付順エージング自体から生殖加齢の影響を分離する効率的な方法です。
女性の健康の多くの面で卵巣ホルモンの支持の役割を確立は、積極的に更年期障害で増加病リスクの主要な原因として生殖細胞を自転車からのホルモンの生産の損失を関係づけます。女性健康で卵巣ホルモンの値は疑わしいが、更年期と閉経後の女性でこれらのホルモンの交換されている若い卵巣で若い女性によって楽しんだ健康上の利点の復元で信頼性の高い。これらの健康上の利点は、heterochronic postreproductive の雌マウス10、11,12,13,14に若い卵巣移植による確実に復元されます。
ドナーとレシピエントの両方のマウスの生殖の状態前に、移植や卵巣摘出手術の手順の後決定してください。看板を生後 12 ヶ月で手術前に性腺の入力の推定の postreproductive マウスは、これらの実験から除外されます。生殖腺の入力は、膣細胞診によって決定されます。膣細胞診上のデータは、少なくとも 10 日間連続受信者マウスで postreproductive 状態とドナー マウスの卵巣を積極的にサイクリングできるように手術前の収集されます。日から期間が上皮細胞を核として、発情のサイクルが定義されている 1 つが最初に表示されます (すなわちproestrus) 漢方薬の期間があること、前日核上皮細胞は膣塗抹標本の次の外観に間で (すなわち発情) の存在。発情は、大規模な扁平上皮細胞、核の有無の存在によって決定されます。マウスを表示しない周期的活動前に 10 日間の期間または期間の生殖腺の入力がないように手術が決定された後。マウスは前に 10 日間でおよび/または生殖腺入力する当該期間の手術が決定された後、少なくとも 1 つの完全発情周期を表示します。雌マウスは雄マウスの存在下で収容またはサイクルを誘発する刺激に一貫性のある露出を確保するため男性のケージから汚れた寝具にさらされる必要があります。
移植手順は、二つの外科医が同時にドナーと受信者のマウス作業で最も効率的に行われます。ただし、手順は簡単に、受信者のマウスの卵巣摘出手術の手順を開始する前にほとんどの場合回復ドナー卵巣 1 つの外科医によって実行されます。このプロトコルでは、単一の外科医のための手順について説明します。通常、取り外しと卵巣の交換は顕微鏡下で行われるに対し、生殖管の露出とサイトの閉鎖を顕微鏡なし行われます。あらゆる手術の方法を学習、切開サイトが大きい場合があり、手術が最初にプロシージャを学びながら長い時間がかかるし、一般的に経験と低下します。

<table><tbody><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Any dissecting scope with an adjustable working distance.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field.</td><td>Stryker/Gaymar</td><td>TP700</td><td>Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields.</td></tr><tr><td>Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract</td><td></td><td></td><td>Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific</td></tr><tr><td>Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure.</td><td></td><td></td><td>Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific</td></tr><tr><td>Suture material for abdominal wall</td><td>eSutures</td><td>G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18&quot; HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED</td><td></td></tr><tr><td>Suture material for ovarian bursa</td><td>eSutures</td><td>2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5&quot; BV130-5 TAPER</td><td>10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field.</td></tr><tr><td>Absorbable gelatin sponge</td><td>PFIZER.</td><td>Gelfoam- PFIZER 09-0315-08.</td><td>cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions.</td></tr><tr><td>Staples for skin closure</td><td>Becton Dickinson</td><td>MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment.</td><td>MWI Veterinary Supply Co.</td><td>Puralube sterile opthalmic ointment</td><td></td></tr><tr><td>Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine</td><td>MWI Veterinary Supply Co.</td><td>BD 305536</td><td>27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml</td></tr><tr><td>Syringes for saline.</td><td>MWI Veterinary Supply Co.</td><td>BD 309657.</td><td>3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle</td></tr><tr><td>Clippers/blade</td><td>Andis</td><td>Super AGR+&amp;trade; Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge&amp;reg; #40 blade.</td><td>Any clippers with a fine blade.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>University chemical supply</td><td></td><td>dilute to 70% for use.</td></tr><tr><td>Betadine solution</td><td>MWI Veterinary Supply Co.</td><td>003233</td><td></td></tr><tr><td>2x2 gauze pads</td><td>MWI Veterinary Supply Co.</td><td>003073</td><td>autoclaved with surgery packs</td></tr><tr><td>Borosilicate glass beads</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>Z273619</td><td>Autoclave in sintilation vials</td></tr><tr><td>4-vinylcyclohexene diepoxide</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>94956</td><td></td></tr><tr><td>Sesame oil</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>S3547</td><td></td></tr></tbody></table>

orthotopic ovarian transplantation procedures to investigate the life- and health-span influence of ovarian senescence in female mice

卵巣移植は 1963 年にユタ州立大学に初めて実施されました。最近の作品で哺乳類卵巣の heterochronic 移植を若い女性で若い卵巣の健康保護効果を調査するため使用されています。現在のプロシージャでは、卵巣嚢の元の位置に戻って同種卵巣を移植するところ、同所性同種移植法を採用しています。これは、皮下や腎被膜下卵巣・卵巣組織のより一般的に使用される異所性移植とは対照的です。すべての 3 つの場所は、移植された組織の効率的な血行再建術を提供します。しかし、同所性同種移植は、最も自然な信号環境に卵巣を提供し、術後自然を再現する動物のための機会を提供する唯一の手順です。1 つは卵巣摘出のプロシージャの間にすべての内因性卵巣組織を除去する世話をしなければなりません。内因性の任意の組織が残っている場合、または 1 つの卵巣が削除された場合にのみ、既存の組織には老齢になるまで移植された組織は休眠残ります。臓器移植レシピエントがかなりの政権が、移植に関連するシグナル伝達、新しい視床下部/下垂体・性腺・副腎 (HPG/A) 軸に適応する時間を取ることができる移植卵巣の血行再建術は非常に迅速に行われている間組織。通常マウスに約 100 日かかります。したがって、移植実験はこの適応期間に合わせて設計する必要があります。典型的な卵巣移植により受信者の暦年齢ではなく移植卵巣の年齢を反映する受信者の健康の変更が含まれます。

21 日齢で卵巣が思春期の発症時の生殖器系の主要な発現を回避し、女性の生殖腺は生殖腺ホルモンの直接的な影響するさらに必要がありますその他の影響を除去します。CBA/J マウスの生殖減少は通常 8-10 ヶ月の不規則な周期で始まります。歳 11 ヶ月でマウスのこのラインのほとんどの女性が 12 カ月齢で応答卵母細胞の完全な損失と繁殖障害15ポイン...

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Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice

ここで説明した、受信者のマウスの生理学的卵巣の影響を修正するための卵巣移植プロトコルです同所性同種。この手術は、メスのマウス卵巣の影響の様々 なタイプの公開に使用し、heterochronic 移植と様々 な前のヴィヴォトリートメントを受けた卵巣の移植があります。

卵巣の老化雌マウスで寿命と健康影響を調査するため同所性卵巣移植手順

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K ビュー.  Utah State University. ここで説明した、受信者のマウスの生理学的卵巣の影響を修正するための卵巣移植プロトコルです同所性同種。この手術は、メスのマウス卵巣の影響の様々 なタイプの公開に使用し、heterochronic 移植と様々 な前のヴィヴォトリートメントを受けた卵巣の移植があります。

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An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all gynecologic malignancies among US women 1,2,3. Serous tumors are the most widespread forms of ovarian cancer and 4,5 the Tg-MISIIR-TAg transgenic represents the only mouse model that spontaneously develops this type of tumors. Tg-MISIIR-TAg mice express SV40 transforming region under control of the Mullerian Inhibitory Substance type II Receptor (MISIIR) gene promoter 6. Additional transgenic lines have been identified that express the SV40 TAg transgene, but do not develop ovarian tumors. Non-tumor prone mice exhibit typical lifespan for C57Bl/6 mice and are fertile. These mice can be used as syngeneic allograft recipients for tumor cells isolated from Tg-MISIIR-TAg-DR26 mice.
Objective: Although tumor imaging is possible 7, early detection of deep tumors is challenging in small living animals. To enable preclinical studies in an immunologically intact animal model for serous ovarian cancer, we describe a syngeneic mouse model for this type of ovarian cancer that permits in vivo imaging, studies of the tumor microenvironment and tumor immune responses.
Methods: We first derived a TAg+ mouse cancer cell line (MOV1) from a spontaneous ovarian tumor harvested in a 26 week-old DR26 Tg-MISIIR-TAg female. Then, we stably transduced MOV1 cells with TurboFP635 Lentivirus mammalian vector that encodes Katushka, a far-red mutant of the red fluorescent protein from sea anemone Entacmaea quadricolor with excitation/emission maxima at 588/635 nm 8,9,10. We orthotopically implanted MOV1Kat in the ovary 11,12,13,14 of non-tumor prone Tg-MISIIR-TAg female mice. Tumor progression was followed by in vivo optical imaging and tumor microenvironment was analyzed by immunohistochemistry.
Results: Orthotopically implanted MOV1Kat cells developed serous ovarian tumors. MOV1Kat tumors could be visualized by in vivo imaging up to three weeks after implantation (fig. 1) and were infiltrated with leukocytes, as observed in human ovarian cancers 15 (fig. 2).
Conclusions: We describe an orthotopic model of ovarian cancer suitable for in vivo imaging of early tumors due to the high pH-stability and photostability of Katushka in deep tissues. We propose the use of this novel syngeneic model of serous ovarian cancer for in vivo imaging studies and monitoring of tumor immune responses and immunotherapies.

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

To study in vivo tumor growth and tumor microenvironment, we used a syngeneic and orthotopic mouse model of ovarian cancer in immunocompetent animals. We transduced a mouse tumor cell line (MOV1) with Katushka fluorescent protein (MOV1KAT) and here we show its orthotopic implantation in ovary and in vivo imaging.

のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで</em腫瘍免疫応答の>腫瘍イメージングとモニタリング

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

免疫・感染学

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

発生生物学

Assessment of Sexual Behavior of Male Mice

Sexual behavior is highly species-specific. Although rodents have slightly different sexual behaviors, mice and rats have a similar sexual behavioral pattern. The purpose of this article is to describe the hormone-induced estrus ovariectomized female model and the experimental procedure for the assessment of sexual behavior of male mice. The most important sexual behavioral elements are demonstrated in the video and illustrations. The critical steps, advantages, and limitations of the sexual behavior test are explained as well. Finally, the behavior parameters are presented, and mounting, intromission, and ejaculation processes in mating are distinguished. Behavioral parameters are assessed in terms of the occurred duration and counts during the test period.

This article describes how to perform sexual behavior tests in male mice.

雄マウスの性行動評価

Sexual behavior is highly species-specific. Although rodents have slightly different sexual behaviors, mice and rats have a similar sexual behavioral ...

行動学

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

マウスの卵巣脂肪パッドに移植

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

医学

Cell-Specific Paired Interrogation of the Mouse Ovarian Epigenome and Transcriptome

Assessing cell-type-specific epigenomic and transcriptomic changes are key to understanding ovarian aging. To this end, the optimization of the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and the isolation of nuclei tagged in specific cell types (INTACT) method was performed for the subsequent paired interrogation of the cell-specific ovarian transcriptome and epigenome using a novel transgenic NuTRAP mouse model. The expression of the NuTRAP allele is under the control of a floxed STOP cassette and can be targeted to specific ovarian cell types using promoter-specific Cre lines. Since recent studies have implicated ovarian stromal cells in driving premature aging phenotypes, the NuTRAP expression system was targeted to stromal cells using a Cyp17a1-Cre driver. The induction of the NuTRAP construct was specific to ovarian stromal fibroblasts, and sufficient DNA and RNA for sequencing studies were obtained from a single ovary. The NuTRAP model and methods presented here can be used to study any ovarian cell type with an available Cre line.

In this protocol, the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and the isolation of nuclei tagged in specific cell types (INTACT) method were optimized for the paired interrogation of the cell-specific ovarian transcriptome and epigenome using the NuTRAP mouse model crossed to a Cyp17a1-Cre mouse line.

マウス卵巣エピゲノムとトランスクリプトームの細胞特異的ペアインプロゲーション

Assessing cell-type-specific epigenomic and transcriptomic changes are key to understanding ovarian aging. To this end, the optimization of the ...

生物学

FSHレベルが上昇した卵巣摘出マウスモデルの開発

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological changes, including decreased bone mass, increased blood lipids, and increased visceral adiposity. Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition. Many studies have shown that FSH in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important. In this study, C57BL/6 female mice were ovariectomized and supplemented with estradiol valerate (OVX + E2) to eliminate the effect of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The OVX + E2 mice received solvent (N.S.) or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection to create a mouse model (OVF) characterized by relatively stable estrogen and rising FSH levels. Thus, we successfully generated an experimental mouse model to mimic the early stage of menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels. The OVF model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extragonadal actions of FSH. Here, we describe detailed protocols for the mouse OVF model.

著者スポットライト:閉経周辺期の女性におけるFSHと病態生理学的変化との関係の調査 - マウスモデルからの洞察 

Follicle-stimulating hormone (FSH) in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. The ovariectomized and FSH-treated mouse model (OVF) can be used to explore the extragonadal actions of FSH.

卵巣の老化雌マウスで寿命と健康影響を調査するため同所性卵巣移植手順

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のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで腫瘍イメージングとモニタリング

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

雄マウスの性行動評価

成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

マウスの卵巣脂肪パッドに移植

マウス卵巣エピゲノムとトランスクリプトームの細胞特異的ペアインプロゲーション

マウスモデルにおける卵胞刺激ホルモンの in vivo での独立効果の探索

マウスモデルにおける卵胞刺激ホルモンの in vivo での独立効果の探索

マウスモデルにおける卵胞刺激ホルモンの in vivo での独立効果の探索