Name: determining the optimal inhibitory frequency for cancerous cells using tumor treating fields (ttfields)
Uploaded: 2017-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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インビトロアプリケーション・システムにおいて TTFields -ベースプレート皿メンテナンス<ol><li>水道水の下で料理や皿のカバーをすすぎます。次いで、脱イオン水及び空気乾燥フェイスダウンでリンス。 </li><li>化学療法剤/薬剤は、実験前に皿に追加された場合、5％の光洗剤溶液を各皿に充填し、一晩残します。 <ol><li>皿の内側に洗剤の痕跡を避けるために、水道水の下で徹底的に料理をすすぎます。お皿をすすぎ、料理は、脱イオン水と空気乾燥フェイスダウンでカバーしています。 </li></ol></li><li>滅菌袋に彼らのカバーで清潔で乾燥したお料理を挿入します。料理は下向きで、オートクレーブ内袋を密封して配置します。 121°Cより高くないで30分間オートクレーブ。 </li><li>乾燥プログラムにオートクレーブを設定し、一部はオートクレーブドアを開け、そして30分間食器を乾燥させます。 </li><li>軽く70％エタノールで湿らせた布でベースプレートを拭きます。 </li> &lt;/ ol&gt; 2.実験セットアップ注記：このプロトコールで使用されるすべての機器および材料は、材料リストに記載されています。以下のすべてのステップは、無菌状態を維持しながら、層流キャビネット内で行う必要があります。 <ol><li>清潔で滅菌したTTFieldの皿とカバーを第1節で説明したように準備します。ベースプレートを70％エタノールで軽く湿らせた布で拭きます。 </li><li> TTFieldsディッシュをベースプレートに取り付けます。ディッシュを静かに押し、ディッシュのリムがベースプレートの3つのピンに固定されるまで時計方向に約5 mm回転させます。各皿の底に滅菌22 mmのカバーガラス（処理プラスチックまたはガラス）を置きます。 </li><li>完全増殖培地（U-87 MGおよびF98のダルベッコ変法イーグル培地; A2780およびOVCAR-3のRPMI; 材料リスト）。 注： ceLL濃度は80％-90％コンフルエントの細胞増殖を、実験の終了までに超えてはならない、細胞型および実験期間に依存します。 注意：ヒト細胞系は、生物学的ハザードを表すことができ、適切な安全対策で処理されなければなりません。 </li><li>各カバースリップの中央に低下として（倍加時間に応じて、72時間の実験のために200μLで通常5,000〜20,000細胞）の細胞懸濁液200μLを配置し、皿の蓋で覆います。 </li><li>細胞が接着するまでCO 2インキュベーター中で37℃でインキュベートします。一晩のインキュベーションは、この段階でも可能です。 </li><li> 200-または1000μLピペットを用いて滴から流体を吸引します。 </li><li>穏やか各皿を充填する完全増殖培地2mlをピペット。ピペットに無菌チップを使用して、そっと時折スライドの下でキャッチ気泡を放出するためにカバースリップの端をタップ。 </li><li>彼らのふたで料理を覆い、それらにインを置きますTTFields処理の開始まで37℃でCO 2インキュベーターでインキュベートする。 </li></ol> 3. TTFieldsアプリケーション<ol><li>添付のTTFields皿を備えたベースプレートを冷蔵CO 2インキュベーターに移す。 注： インビトロ TTFieldsアプリケーションは熱を生成します。したがって、料理の温めを補うために、冷蔵インキュベーターが必要です。より高いTTField強度はより多くの熱を生成し、インキュベーター周囲温度をより低くする必要があります（ 表1参照）。臨床的に関連するTTFieldの強度は、TTFieldのインキュベータ温度が18〜30℃の範囲にあるときに達成されます。 </li><li>フラットケーブルのメスコネクタをベースプレートに接続します。 TTFieldsジェネレータをオンに切り替えます。 </li><li> TTFields in vitroアプリケーションシステムソフトウェアを起動し、実験設定を選択します。 <ol><li>新しい実験を定義する。 expの名前を入力してくださいerimentとコンピュータ画面上のソフトウェアのユーザーインターフェイスでの実験の所有者。各皿又はベースプレートのための周波数と目標温度を調整します。 </li></ol></li><li>ソフトウェアを使用してTTFieldsアプリケーションを起動します。 </li><li>すべての料理が正しく接続されていることを確認してモニタに水色で表示されます。料理が赤枠で囲んだされた場合（それが正しく接続されていないことを意味する）、軽く下に押し、連絡先が復元されるまで、前後にゆっくりと回転させると料理が水色に表示されます。 </li><li>最大24時間のために実行されている試験管内のアプリケーションシステムで TTFieldsを残します。 </li><li>実験はそのエンドポイントに到達した場合は、ソフトウェアでのEND実験]ボタンをクリックして、実験を停止しない場合は手順5に進み、PAUSE実験をクリックしてください。 </li><li>ベースプレートからフラットケーブルコネクタを外し。クリーンベンチにインキュベーターから料理をベース板を外します。 </li><li>すべての皿にメディアを交換してください24時間毎にベースプレートを冷蔵インキュベーターに戻します。フラットケーブルを使用してベースプレートを発電機に接続します。 CONTINUEボタンをクリックして実験を続行します。 </li></ol> 4.コントロールサンプル 注： TTFieldsアプリケーションを除くTTFields処理細胞と同様の条件でコントロール細胞を増殖させる。 <ol><li> TTFields処理したサンプルをプレーティングするために使用した同じ懸濁液および同様の表面上のプレートコントロールサンプル。 </li><li>コントロール皿を37℃のCO 2インキュベーターに入れます。 </li><li> TTFieldsで処理したディッシュの培地条件と一致するように、ディッシュ中の培地を24時間ごとに交換する。 </li></ol> 5.実験終了<ol><li> END EXPERIMENTをクリックした後、ソフトウェアがシステムからすべてのレコードを取得し、レコードをコンピュータに保存するのを待ちます。 </li><li> REPORTSボタンを使用して、温度、電流、および抵抗のログfすべての料理が実験計画に従って処理されたことを検証するために、各ベースプレートのilesを作成しました。 注：すべてのレポートとログは実験終了後にコンピュータに保存され、いつでも確認することができます。 </li><li> TTFieldsジェネレータをオフにします。 </li><li>フラットケーブルをベースプレートから外し、保育器から取り出します。 </li><li>セラミック製の皿を取り外すには、押し下げて皿を反時計回りに回してベースプレートからロックを解除します。 </li><li>皿を層流キャビネットに入れ、カバースリップを無菌的に除去する。さらなる検査と評価のために新鮮な培地またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む滅菌ペトリ皿に移す。 </li></ol> 6.TTFieldの効果の評価注：TTFieldの効果は、いくつかの点で決定できます。以下の方法の1つ以上を使用して、処理細胞を未処理の対照細胞と比較する： <ol><li>細胞数<ol><li>各カバースリップ含有ディッシュから培地/ PBSを除去する。 </li><li>各ディッシュに0.25％トリプシン/ EDTA 0.5 mLを添加し、CO2インキュベーター内で37℃で10分間（ すなわち、細胞がカバーガラス表面から剥がれ始めるまで）インキュベートする。 </li><li> 0.5mLの完全増殖培地を添加してトリプシンを中和し、上下に穏やかにピペッティングすることによって細胞を再懸濁する。 </li><li>低細胞濃度（ すなわち、約20,000細胞/ mL）を計数することと適合する標準的な細胞計数技術を用いて細胞を数える。 </li></ol></li><li>クローン化アッセイ<ol><li>各ディッシュから同様の数の細胞（1皿あたり100-500細胞）を、新しい、無菌ペトリ皿または2mLの新鮮な完全増殖培地を含む6ウェルプレートにプレートする。 </li><li>約50個の細胞からなるコロニーが形成されるまで、37℃のCO 2インキュベーターで1〜3週間インキュベートする（各細胞株の特性に応じて）。細胞を評価する光顕微鏡によるコロニーあたりの数。 </li><li>培地を除去し、PBSですすいでください。 </li><li> PBSを除去し、氷冷メタノール（1 ml）を加えます。 10分以上のために-20°Cでインキュベートします。 </li><li>メタノールを除去します。 </li><li>クリスタルバイオレット溶液（水中25％v / vのメタノール中のw / vの0.1％）を添加し、20分間インキュベートします。 注意：クリスタルバイオレットは、潜在的な発がん性物質です。クリスタルバイオレットでの作業中に手袋を使用しています。 </li><li> 、クリスタルバイオレットを除去する脱イオン水で3回洗浄し、そして空気乾燥。 </li><li>各皿に形成されたコロニーを数えます。 </li></ol></li></ol>

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ポラットYaara、Giladiのモシェ、シュナイダーマンS.ローザ、BLATロニ、Shteingauzアンナ、Zeevi Einav、ミュンスターMijal、Voloshinタリ、ケイナン・ノア、タル・オーナ、およびKirson D.エイロンDはNovocure社、イスラエルの従業員を支払っています。ワインバーグウリはNovocure社、ルツェルンの有給従業員です。 Yoram PaltiはNovocure社、NYでの株主です。

TTFieldは、適切に調整された交番電界1,2,8,9,10,17の連続的な適用に基づく、新たな抗腫瘍モダリティである。抗腫瘍効果を最大にすることは、すべての治療様式にとって望ましい結果である。したがって、癌細胞増殖阻害の追加のパーセントごとに「戦う」ことは、患者の長期的な臨床結果に重要な影響を及ぼし得る。これは、TTFieldsアプリケーションの必要な連続性とその結果の累積効果のためです。 TTFieldアプリケーションの最大化は、（1）電界強度の増加、（2）治療期間の延長、（3）最も効果的な組み合わせの発見最適な周波数1,2,4,6,7を規定する他の治療様式18,19 、および（4）を使用している。腫瘍の部位での電場強度を最大にすることは、患者の皮膚上のアレイの位置を最適化することによって達成される。これは、患者20の個々の解剖学的構造に基づいて腫瘍への最大電界強度の送達を可能にする。治療期間の延長は、主に患者の治療遵守に依存している（少なくとも18時間/日）。他の治療法との適切な組み合わせを見出し、最適な頻度を決定することは、TTFields治療結果のための有効なマーカーが現在利用可能でないため、 インビトロの結果に大きく依存する。この作業では、実験的なproceduresはTTFields インビトロのアプリケーションシステムを使用して、癌細胞株に対する最適TTFields周波数を決定するために必要。ここに記載された方法は、潜在的にTTFieldsと他の癌治療法の組み合わせ（ 例えば、化学療法剤または放射線照射）をスクリーニングするために、各特定の併用治療のためのTTFields投与のための最適な周波数を決定するために用いることができます。 以前の刊行物に沿って、ここに示す結果は、両方の神経膠腫細胞および卵巣癌細胞の治療のための最適な周波数は、200 kHzの1、7であることを実証しています。本研究では、クローン原性の可能性を低減するための最適なTTFields周波数が最大の細胞毒性効果につながる頻度と関連していることを初めて実証しました。 TTFields（ すなわち、細胞傷害性およびクローン原性）の効果を定量化するために、この研究で使用される方法A治療成果を評価するための多くの可能な標準的エンドポイントアッセイのうちの2つだけである。さらなる治療成果検査には、（1）細胞内構造の可視化のために細胞を顕微鏡で覆うカバースリップを固定し、染色し、マウントすること、 （2）TTFields皿自体から、または新しい使い捨て皿にカバースリップを移した後に、タンパク質およびRNA抽出物のアッセイを行う; （3）フローサイトメトリー分析のために染色された細胞をトリプシン処理すること。 慎重な実験計画は、TTFieldの送達後の治療成果に影響を与える。重要なステップは、鋭敏な細胞株に適用すると高すぎる強度が必要なアッセイのために必要なアッセイのために少なすぎる結果になるため、実験を通して細胞増殖が過増殖に至らず適切な電場強度を使用することを保証することを含む最適な周波数。逆に、非常に低い強度で適用されたTTFieldより感受性の低い細胞株では、固有の変異によってマスクされ得る小さな効果が生じる。治療ログは、実験を通して、各皿ごとに温度安定性、電流、および抵抗に関する貴重な情報を調べるべきである。治療開始時に誤った皿を交換し、所望の治療パラメータを満たさない皿からのデータを除外することは、複製間の変動性を最小にする。 要約すると、TTFieldsは臨床現場ですでに有効性と安全性が証明されている新たな抗がん治療法である8,9,10。ここに記載されているプロトコルを使用してインビトロ設定でTTFieldを試験することは、臨床設定におけるTTFields処置パラメータの最適化を可能にし、基礎となる作用機序の理解を広げる可能性がある。

腫瘍を治療する腫瘍（TTFields）は、多形性グリア芽細胞腫および潜在的に他の種類の癌の治療のための抗有糸分裂様式である。これらのフィールドは、低強度（1-3V / cm）、中間周波数（100-500kHz）の交番電場を腫瘍領域1,2に連続的に印加することによって供給される。 インビトロおよびインビボでの TTFieldsの適用は 、様々な癌細胞株の増殖およびいくつかの動物腫瘍モデル1,2,3,4,5,6,7における腫瘍の進行の両方を阻害することが示された。グリア芽細胞腫および非小細胞肺癌を含む固形腫瘍患者のパイロット臨床試験およびより大きなランダム化研究では、連続TTFieldsアプリケーション8,9,10の安全性と有効性を評価しました。 TTFieldの有効性は、（1）周波数依存性であり、特定の最適な頻度で異なる起源1,2,4,5,6,7から細胞株の細胞数が最も減少すること; （2）電界強度に依存し、約1V / cmでの活動の最小閾値およびより強力なより高い強度1,2,7,11; （3）処置期間がより長くなると増強される; 5 。 （4）2方向TTFieldが各Othに垂直に適用された場合単一の方向から印加された電界と比較して、上記の知見に基づいて、患者の皮膚に局在する2セットのトランスデューサアレイを用いて腫瘍床12,13の電場強度を最大にするために、長期間にわたって患者にTTFieldを適用することができる。 インビトロで癌細胞に対するTTFieldの効果を研究することは、現在、特定の腫瘍型に適用する最適な頻度を決定する唯一の方法を提供する。最適な周波数を試験するには、細胞培養物に対して100〜500kHzの範囲および3V / cm 2の最大二乗（RMS）の強度で異なる周波数を印加することを可能にする装置が必要である。 TTFieldsアプリケーションでは熱が発生するため、アプリケーションシステムでは過度の熱を放散し、温度を厳密に制御する必要があります。 いくつかのデバイスEは、細胞培養1、2、5、14、15、16 TTFieldsアプリケーションを可能にするために、長年にわたって開発しました。これらの装置の全てにおいて、使用される電極は、電極表面でのそのような電子交換などの導電性電極の使用及び媒体1に有毒な金属イオンの放出に伴う注意事項を回避するために絶縁されました。試験した様々なTTFieldsアプリケーションシステムとの間の主な違いは、絶縁碍子2の薄膜、14、15、16又は高誘電率材料で絶縁金属ワイヤからなる電極（ 例えば、いずれかで、使用される電極の絶縁体の一種でありますニオブ酸鉛マグネシウム - titanatE（PMN-PT））6。絶縁ワイヤ電極がTTFieldsアプリケーションの比較的簡単でコスト効果の高いソリューションを提供するが、それらはしばしば、1 V / cmの閾値を超えると細胞播種のために利用可能な表面によって効果的な電界強度を達成するのに必要な高電圧によって制限されます電極間の距離が比較的小さいです。高誘電率材料を用いて絶縁電極に基づくシステムは、特別な設計と製造能力を必要とし、まだ彼らは、高電圧を必要とせず、電極間の細胞増殖のための大きな面積を提供することができます。 この研究で使用TTFields インビトロアプリケーションシステムは、コアユニットは、高誘電率セラミック（ すなわち、PMN-PT）からなるペトリ皿（TTFields皿、 図1を参照）であると、システムの後者のクラスに属します。 2つの電極対が外側WALに垂直に印刷されています2方向からの電界の印加を可能にするためのTTFields皿を使用した。電極は正弦波形発生器と増幅器に接続されており、50~500kHzの周波数範囲でTTFieldを印加することができます。過度の熱を消散させるために、TTFieldsディッシュは、ディッシュ温度の絶え間ない監視およびシステムによって印加される電圧の調整を使用して実行される中温制御が行われ、冷蔵インキュベーター内に保持される。実際には、ディッシュ内の目標温度が達成されるまで、システムが電圧を増加させるので、インキュベータをより低い温度に設定すると、より高い電界強度につながる。ディッシュ内の温度とインキュベーターの温度との差は、温度勾配に依存して、いくらかの蒸発を引き起こし得る。したがって、適切な増殖条件を維持するために、培養培地を24時間毎に交換する必要がある。 以下のプロトコル細胞数の最大の減少とコロニーを形成する生存細胞の電位の低下が達成されるように、癌細胞にTTFields周波数のアプリケーションを最適化するための実験手順を説明します。

<table><tbody><tr><td>inovitro system and software</td><td>Novocure</td><td>ITG1000 and IBP1000</td><td>Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sterilization bags</td><td>Westfield medical</td><td>24882</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cover slides</td><td>Thermo Scientific (NUNC)</td><td>174977</td><td>Pre treated and sterilized</td></tr><tr><td>Glass cover slides</td><td>Thermo Scientific (Menzel-Gl&amp;auml;ser)</td><td>CB00220RA1</td><td>Sterilize if necessary</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>01-055-1A</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>04-007-1A</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &amp;micro;g/mL Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution 100 mM&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hepes buffer 1 M</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Insuline solution from bovine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>03-050-1B</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck</td><td>1.06009.2511</td><td>Cool to -20 &amp;deg;C in the freezer before use</td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>120M1445</td><td>Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water.</td></tr><tr><td>Light detergent</td><td>Alcononx</td><td>242985</td><td>Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer&#039;s instrutions.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries (Israel)</td><td>02-023-1A</td><td>Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>A2780</td><td>ECACC</td><td>93112519</td><td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100&amp;nbsp;U/mL / 100&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL), sodium pyruvate (1&amp;nbsp;mM) and Hepes buffer (12&amp;nbsp;mM).</td></tr><tr><td>F98</td><td>ATCC</td><td>CRL-2397</td><td>Grow in Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100&amp;nbsp;U/mL / 100&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL), sodium pyruvate (1&amp;nbsp;mM) and glutamine (2&amp;nbsp;mM).</td></tr><tr><td>Ovcar-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100&amp;nbsp;U/mL / 100&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL), sodium pyruvate (1&amp;nbsp;mM), Hepes buffer (12&amp;nbsp;mM) and insulin (10&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL).</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>Grow in Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100&amp;nbsp;U/mL / 100&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL), sodium pyruvate (1 mM) and glutamine (2&amp;nbsp;mM).</td></tr><tr><td>refrigirated CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>CARON</td><td>7404-10-3</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>ADS Laminair</td><td>Bio12 and VSM12</td><td></td></tr></tbody></table>

determining the optimal inhibitory frequency for cancerous cells using tumor treating fields (ttfields)

フィールド（TTFields）を治療する腫瘍は数百キロヘルツの周波数範囲の電界を交互に、低強度の連続的、非侵襲的なアプリケーション（1-3 V / cm）とを介して送達される有効な治療法です。組織培養におけるTTFieldsの研究は、高誘電率（ここでε&gt; 5,000）を有するセラミックペトリ皿に変化する周波数と強度の電界の印加を可能にするTTFields インビトロのアプリケーションシステムを用いて行われます。セラミックペトリ皿の底部にカバーガラス上に播種癌細胞株は、細胞数およびクローン原性アッセイなどの治療結果試験を容易にするために、様々な周波数で二つの直交方向で送達TTFieldsに供されます。この報告書に示された結果は、細胞数およびクローン原性アッセイの両方に関してTTFieldsの最適な周波数は、両方の卵巣癌および神経膠腫細胞のための200 kHzであることを示しています。

<html> TTFields適用後の結果は、細胞数、比色アッセイ、クローン原性アッセイ、および特別なハイウォールTTFields内に配置されたBoydenチャンバーを用いた侵入細胞の数の変化に関する検査など、異なるアッセイに基づいて定量することができる細胞培養皿。所定の細胞倍加時間に基づく慎重な実験計画は、細胞が治療期間中に有糸分裂事象の最大数に達し、それにより治療結果を最大にすることを可能にする。 図2は、A2780（ すなわち、ヒト卵巣癌細胞; 図2A ）およびF-98（ すなわち、ラット神経膠腫細胞; 図2A ）の平均細胞数（ すなわち、細胞数）およびクローン原性アッセイの典型的な周波数スキャン結果を示す。「&gt;図2B）1は、2つの方向TTFields（周波数範囲で処理：100〜500 kHzの、RMS：1.7 V / cmであり、インキュベータの温度：18°C）の結果は、全てで細胞数の有意な減少は、周波数を適用実証、（複数の比較で一方向ANOVA）試験した全ての細胞株について200 kHzで最大の減少と。クローン原性ポテンシャルの最も高い減少をもたらす最適な周波数は、A2780およびF98細胞（ 図2BおよびC）の両方で同じでした。細胞数および各周波数におけるクローン原性効果の間のピアソン相関係数は、それぞれ、A2780およびF98のために0.967（P = 0.002）および0.755（P = 0.083）でした。 （ すなわち、ヒト卵巣癌細胞; 図3A） 図3は、OVCAR-3の平均細胞数に対する周波数スキャン結果を示し、U-87 M異なる強度（RMS：それぞれ1.7,1.3,1.0V / cm、インキュベーター温度：18℃、24℃および28℃）で2方向のTTFieldで処理したG（ すなわち、ヒト神経膠腫細胞; 図3B ） C）。結果は、1.3-V / cmのTTField（インキュベーター温度：24℃）で処理した後のOVCAR-3細胞数の有意な減少はあるものの、細胞を処理したときに得られた結果1.7V / cm（インキュベーター温度：18℃）である。 1.0V / cmのTTField（インキュベーター温度：28℃）で処理したU-87 MG細胞も、1.7V / cmで処理した場合と同様に細胞数の減少において同様の傾向を示したが、その効果は低強度では有意ではなかった。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig1.jpg" /> Figure 1 。 TTFieldsディッシュをベースプレートユニットに取り付け、フラットTTFieldsコントロールケーブルに接続しました。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55820/55820fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig2.jpg" /> 図2 （A）A2780および（B）F98細胞についての最適なTTFields阻害頻度の決定のための頻度スキャン。細胞を異なる周波数のTTField（1.7V / cmおよび100-500kHz）で72時間処理した。 TTFields処理の効果は、細胞数およびクローン化アッセイを用いて評価した。矢印は最適な周波数を示します。結果は、試験した各頻度について少なくとも6反復に基づく平均±SDを表す。 （ C ）クローン原性の代表的な画像<html>様々な頻度でのTTField治療後のA2780細胞の寛解<a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55820/55820fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig3.jpg" /> 図3 （A）OVCAR-3および（B）U-87MG細胞についての最適なTTFields阻害頻度の決定のための頻度スキャン。異なる周波数（100〜500kHz）および強度（OVCAR-3：1.3および1.7V / cm; U-87MG：1.0および1.7V / cm）のTTFieldで細胞を72時間処理した。細胞数を用いてTTFields処理の効果を推定した。矢印は最適な周波数を示します。結果は、試験した各頻度において少なくとも6反復に基づいて平均±SDを表す。pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> インキュベータ周囲温度 </td><td> 期待されるTTField強度 </td></tr><tr><td> （℃） </td><td> （V / cm RMS） </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 1.62 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 1.55 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 1.48 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 1.41 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 1.33 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 1.26 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 1.19 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 1.12 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 1.04 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 0.97 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 0.83 </td></tr><tr> &lt;td&gt; 30 </td><td> 0.76 </td></tr></tbody></table> 表1.インキュベーターの周囲温度と予想されるTTFields強度（TTFieldsディッシュ内）。

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Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

腫瘍治療領域（TTFields）は、低強度、中周波、交番電界の連続非侵襲的適用によってもたらされる効果的な抗腫瘍治療法である。 TTFields in vitroアプリケーションシステムを使用して細胞株にTTFieldsアプリケーションを適用すると、細胞数が最も減少する最適な頻度を決定することができます。

腫瘍治療領域（TTFields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度の決定

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

determining-optimal-inhibitory-frequency-for-cancerous-cells-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

14.8K ビュー.  Novocure Ltd., Haifa, Israel. 腫瘍治療領域（TTFields）は、低強度、中周波、交番電界の連続非侵襲的適用によってもたらされる効果的な抗腫瘍治療法である。 TTFields in vitroアプリケーションシステムを使用して細胞株にTTFieldsアプリケーションを適用すると、細胞数が最も減少する最適な頻度を決定することができます。 

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

免疫・感染学

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% with current standard of care. Tumors often recur within 9 months following initial surgery, radiation and chemotherapy, at which point treatment options become limited. This highlights the pressing need for the development of better therapeutics to prolong survival and increase the quality of life for these patients.
Tumor Treating Fields (TTFields) therapy was developed to take advantage of the effect of low frequency alternating electrical fields on cells for cancer therapy. TTFields have been demonstrated to disrupt cells during mitosis and slow tumor growth. There is also growing evidence that they act through stimulating immune responses within exposed tumors. The advantages of TTFields therapy include its noninvasive approach and increased quality of life compared to other treatment modalities such as cytotoxic chemotherapies. The Food and Drug Administration approved TTFields therapy for the treatment of recurrent glioblastoma in 2011 and for newly diagnosed glioblastoma in 2015. We report on the effects of TTFields during mitosis, the results of electric fields modeling, and proper transducer array placement. Our protocol outlines the clinical application of TTFields on a patient post-surgery, using the second-generation device.

Glioblastoma is the most common and aggressive primary brain malignancy in adults, with most tumors recurring after initial treatment. Tumor Treating Fields (TTFields) therapy is the newest treatment modality for glioblastoma. Here, we describe the proper application of TTFields-transducer arrays on patients and discuss theory and aspects of treatment.

腫瘍神経膠芽腫でフィールド療法を治療の臨床応用

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

がん研究

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Cancer therapies which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly desirable. The use of RF electric-fields that penetrate deep into the body, causing minimal toxicity, are currently being studied as a viable means of non-invasive cancer therapy. It is envisioned that the interactions of RF energy with internalized nanoparticles (NPs) can liberate heat which can then cause overheating (hyperthermia) of the cell, ultimately ending in cell necrosis.
In the case of non-biological systems, we present detailed protocols relating to quantifying the heat liberated by highly-concentrated NP colloids. For biological systems, in the case of in vitro experiments, we describe the techniques and conditions which must be adhered to in order to effectively expose cancer cells to RF energy without bulk media heating artifacts significantly obscuring the data. Finally, we give a detailed methodology for in vivo mouse models with ectopic hepatic cancer tumors.

We describe the protocols used to investigate the interactions of 13.56 MHz radiofrequency (RF) electric-fields with gold nanoparticle colloids in both non-biological and biological systems (in vitro/vivo). These interactions are being investigated for applications in cancer therapy.

非侵襲ハイパーサーミアがん治療のための金ナノ粒子と生体系とラジオ波の相互作用を評価するためのプロトコル

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

医学

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

再発神経膠芽腫の治療のためのベバシズマブと組み合わせてフィールド療法の治療腫瘍

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

固形腫瘍を治療するためのイオンチャネルの薬理学的標的化

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development of a broad range of disorders or channelopathies. Cancer cells utilize ion channels to drive their own development, as well as to improve as a tumor and to assimilate in a microenvironment that includes various non-cancerous cells. Furthermore, increases in levels of growth factors and hormones within the tumor microenvironment can result in enhanced ion channel expression, which contributes to cancer cell proliferation and survival. Thus, the pharmacological targeting of ion channels is potentially a promising approach to treating solid malignancies, including primary and metastatic brain cancers. Herein, protocols to characterize the function of ion channels in cancerous cells and approaches to analyze modulators of ion channels to determine their impact on cancer viability are described. These include staining a cell(s) for an ion channel(s), testing the polarized state of mitochondria, establishing ion channel function using electrophysiology, and performing viability assays to assess drug potency.

著者スポットライト:がんにおけるイオンチャネルの役割の探索:特性評価と潜在的な治療アプローチ 

The pharmacological targeting of ion channels is a promising approach to treating solid tumors. Detailed protocols are provided for characterizing ion channel function in cancer cells and assaying the effects of ion channel modulators on cancer viability.

がん細胞におけるイオンチャネルのスクリーニング

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

未処理および処理腫瘍細胞のソニック感受性を決定するための生成およびパルス低周波超音波の定量分析

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

Cytotoxic T cells play a key role in the elimination of tumor cells and are, therefore, intensively studied in cancer immunology. The frequency and activity of cytotoxic T cells within tumors and their tumor microenvironment (TME) are now well-established prognostic and predictive biomarkers for numerous tumor types. However, it is well-known that various tumor treatment modalities, including radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy, and targeted therapy, modulate not only the immunogenicity of the tumor but also the immune system itself. Consequently, the interaction between tumor cells and T cells requires more intensive study in different therapeutic contexts to fully understand the complex role of T cells during tumor therapy. To address this need, a protocol was developed to analyze the activity and proliferative capacity of human cytotoxic (CD8+) T cells in co-culture with pre-treated tumor cells. Specifically, CD8+ T cells from healthy donors are stained with the non-toxic proliferation marker carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) and stimulated using CD3/CD28-coated plates. Subsequently, T cells are co-cultured with pre-treated tumor cells. As a readout, T cell proliferation is quantified by measuring CFSE signal distribution and assessing the expression of surface activation markers via flow cytometry. This can be further complemented by quantifying cytokine release using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This method facilitates the evaluation of treatment-induced changes in the interaction between tumor cells and T cells, providing a foundation for more detailed analyses of tumor treatment modalities and their immunogenicity in a human ex vivo setting. Additionally, it contributes to the reduction of pre-clinical in vivo analyses.

The present protocol describes an experimental workflow that allows for the ex vivo analysis of human T cell stimulation in an allogenic co-culture system with pre-treated tumor cells.

前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトT細胞活性の解析

Cytotoxic T cells play a key role in the elimination of tumor cells and are, therefore, intensively studied in cancer immunology. The frequency and ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

腫瘍治療領域（TTFields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度の決定

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