Name: murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies at JoVE.com

我々は、神経生理学研究所のワークショップと動物施設が提供する支援を認めています。この作品は、Walter und Marga Boll-Stiftung、KölnFortune、Deutsche StiftungfürHerzforschungによって支持されました。

動物の取扱いは、地域の動物福祉委員会の指針と、欧州議会の2010/63 / EU指令に適合していなければならない。 1.ソリューションの準備<ol><li> NaCl 136、KCl 5.4、NaH 2 PO 4 0.33、MgCl 2 1、グルコース10、HEPES 5,2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）30を用いて、Ca 2+ （mMの組成）を含まないTyrode溶液を調製する。 4℃でNaOHで処理した。 </li><li> NaCl 136、KCl 5.4、NaH 2 PO 4 0.33、MgCl 2 1、グルコース10、HEPES 5、BDM 30、CaCl 2 0.9のCa 2+ （mM単位の組成）でTyrodeの溶液を調製する。 4℃でNaOHでpHを7.4に調整する。 </li><li> 4％低融点アガロースの調製：Ca 2+を含まないTyrode溶液15 mLに低融点アガロース0.6 gを入れます。アガロースが溶解するまで、混合物を電子レンジで750Wで10-15秒間2回加熱する。溶液を37℃の一定温度に保ち、＃176; Cを添加し、連続的に攪拌する。 </li><li> 37℃で血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）をカルボゲン（5％CO 2、95％O 2 ）で泡立てた状態に保つ。 </li></ol> 2.ミクロトームの準備<ol><li>ミクロトームのスイッチを入れる。 </li><li>外側のミクロトームチャンバーを氷で満たします。 </li><li>内部ミクロトームチャンバーをCa 2+を含まない氷冷Tyrode溶液で満たし、溶液を100％O 2で連続的に酸素化する。 </li><li>スチールブレードをミクロトームのブレードホルダーに置きます。 </li></ol> 3.マウス心臓の分離<ol><li> 2,500Uのヘパリンを皮下に注射する。 15分待ちます。 </li><li>頚椎脱臼によって動物を犠牲にする。 </li><li>胸骨を開ける。 </li><li>慎重に小さなはさみと鉗子＃5を使用して心膜を切開する。 </li><li>上行大動脈にカニューレを挿入し、 その場で冠状動脈を氷で冷やすTyrode&#39;s残りの血液が取り除かれるまで、Ca 2+を含まない溶液である。 </li><li>穏やかに鉗子とはさみで心臓を切除し、冷たいタイロードの溶液をCa 2+なしで乗せて移します。 </li><li>メスまたはハサミで心房を心室から分離する。 </li></ol> 4. 4％低融点アガロースへの心室の埋め込み<ol><li>アペックスを上向きにして心室をアガロースモールドに置きます（ 図1 ）。左心室の金型の中央にピンを置きます。 </li><li>心臓が完全に覆われるまで、37℃で4％低融点アガロースでモールドを満たす。 </li><li>金型を氷上に置き、アガロースのより速い硬化が組織の浮きを防止するようにする。 </li><li>メスを用いて、心室を含むアガロースブロックを金型から取り出す。 </li><li>ブロックを裏返しにして、心室と、アガロースブロックの裏側の隙間を満たします。20Gの針を備えたシリンジを用いて4％低融点アガロースを用いてモルトのピンによって放置された。 </li><li>メスでアガロースブロックをトリムして、ブロックの平坦な底部および心尖部の直立位置を達成する。 </li></ol> 5.心室のスライス<ol><li>シアノアクリレート接着剤を滴下してミクロトームの試料ホルダーにブロックを固定する。心尖部を上に向けます。 </li><li>標本ホルダーをミクロトームの内部標本チャンバーに置き、Ca 2+を含まない氷冷タイロードで満たします。タイロードの溶液でアガロースブロックを完全に覆います。 </li><li>さらなる適用（シャープな電極記録150-200μmの場合）に応じて150〜400μmの厚さの短軸スライスを準備し、ブレードの振動周波数を60〜70Hzに保ち、できるだけゆっくりとブレードを前進させる。 </li><li>細かいブラシを使用して、残りのアガロースをスライスから慎重に除去します。 </li><li>優しくトランスファー0.9mMのCa 2+を含むTyrode溶液にパスツールピペットでスライスし、100％O 2を通気し、スライス手順から回復するために氷上で少なくとも30分間貯蔵する。 </li><li>その後、37℃でDMEM中で30分間スライスし、カルボジェンを通気し、その後の使用の前にBDMを洗い流す。 </li></ol> 6.シャープな電極セットアップの準備<ol><li>予熱のために、録音が始まる30分前にすべての電気装置をオンにします。 </li><li> 3cmの細胞培養皿を、倒立顕微鏡上に置かれた加熱プレート上に置く。 </li><li>ディッシュにカスタムメイドのリング電極（ 図2 ）を置き、プリアンプと刺激電極のアース線を接続します。 </li><li>灌流システムのフレキシブルチューブを皿に接続します。 </li><li> carbogenを通気したDMEMで灌流システムのリザーバを満たしてください。 </li><li>灌流ポンプのスイッチを入れ、潅流を設定する2~3mL /分である。 </li><li>フローヒーターと加熱プレートを調節して、ディッシュ内のDMEMの温度を37°Cに調整します。 </li></ol> 7.アクション潜在的なレコーディング<ol><li> DMEMで満たされた皿に心室スライスを置く。 </li><li>倒立顕微鏡を用いて組織の構造的完全性および生存能力（収縮機能に基づく）をチェックする。 </li><li>記録用ガラス電極に3M KCLを充填する。 </li><li>刺激電極をDMEMで満たす。 </li><li>記録電極と刺激電極を電極ホルダーの上に置く。 </li><li>スライス上に刺激電極を注意深く置き、電気刺激装置をオンにします。 1〜2Hzの刺激周波数で開始する。 </li><li>マイクロマニピュレータを使用して記録電極を目的の記録位置に移動します。 </li><li>先端が組織に触れるまで、記録電極をゆっくりと下げる。 </li><li>短い長方形の電気パルスを記録電極が細胞膜を貫通する。 </li><li>安定した信号が得られるまで記録電極の位置を慎重に変えてください。 </li><li>活動電位の記録を開始する。 </li></ol>

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	<li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro.">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+(Fabaceae)+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing.">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li><li>Burnashev, N. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development.">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li><li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage:+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li></ol>

著者は宣言することは何もない。

心室スライスは、組織構造のような保存されたインビボでの電気生理学的、薬理学的および機械的研究ならびに心臓のすべての領域への測定技術の直接アクセスを可能にする。生理学的作用潜在的特性は、胚、新生児および成人のスライス9,10,11において示されている。スライシング手順によって直接損傷された表面層を除いて、スライスの活性は、活力染色によって確認された9 。鋭利なガラス電極を用いたスライス内の活動電位記録を用いて、本明細書に記載の移植心筋細胞の統合および成熟、または心臓活性化合物を添加した後の薬理学的研究を調査することができる。個々の細胞で1時間以上の長期間の記録が可能です。この記録時間は、逐次灌流およびウォッシュアウトによる1つの細胞に対する異なる薬理学的化合物の影響。 重要な準備ステップ切片の品質を最適化するために、虚血組織損傷を避けるべきである。したがって、Tyrodeの溶液による心臓の心臓の灌流、急速な心臓切除および氷冷酸素添加Tyrode溶液における即時保存が重要であると考えられている。 2,3-ブタンジオンモノオキシムを用いた鼓動する心臓の固定化は、虚血に対する感受性をさらに低下させる可能性があり、低融点アガロースにおける固体埋め込みに必要とされる。低融点アガロースに包埋することは、拡散を制限することによって組織の供給を妨げる可能性があるが、スライスする前に柔らかい心臓組織を安定させるために不可欠である。標本ブロック内の小さな空洞、 例えばアガロースまたは残存気泡で完全に満たされていない心室が組織の安定化を妨げる可能性がある。不安定化した心筋組織は十分なresisを提供しない重度の組織破壊および損傷を引き起こす振動刃にぶつかる。明確な切断を確実にし、組織の損傷を最小限に抑えるためには、ブレードを鋭利にしなければならない（ すなわち 、3回以上再使用しない）。また、ブレードの往復運動は、鈍いブレードまたは過速度により心室を埋め込み、または組織を裂く。 信頼性と再現性のある結果を確実にするために、スライスの品質は、顕微鏡検査で確認できる組織の構造的完全性、および10 Hzまでの生理学的な鼓動頻度での電気刺激に対する応答を含む特定の基準を満たす必要があります。 スライスは、さらなる用途に応じて、150〜400μmの厚さで切断することができる。より薄い薄片は、組織コアにおける低酸素状態を防止することができ、蛍光顕微鏡による移植細胞の検出を容易にするとともに、記録電極15は、より厚いスライスにより組織構造のより完全な一体性と組織のより高い安定性を提供することができ、これは、力測定10および記録後のさらなる組織学的処理に有利であろう。 イオンチャネルおよびCa 2+処理タンパク質16,17に対する高BDM濃度の潜在的影響を防ぐために、さらなる使用前に少なくとも30分間BDM遊離DMEM中のスライスをインキュベートすることによるBDMウォッシュアウトが推奨される。驚くべきことに、BDMウォッシュアウト後の組織の収縮およびその後の動きは、鋭い電極記録を妨げない。 制限事項一般的な細胞培養モデルとは対照的に、スライスは、保存された電気的および機械的細胞間結合、細胞外マトリックスおよび心筋の分布を含む無傷の組織構造を提供するネズミ組織内の非 - 筋細胞および非 -しかし、心臓組織スライスは、人工媒質によって供給される厚さがわずか150〜400μmであり、調製プロセス中に損傷を受ける可能性があるため、インビボ状況に正確に一致しない。トリパンブルー染色および活性カスパーゼ-3およびPARP p85断片の免疫組織学的評価により、表層のものを除いて、胚切片内の細胞はスライスした後に生存可能であることが明らかになった。 伝導系は心室スライスに保存されず、励起拡散はフラットスライスでは3次元ではなく2次元である。胚の心臓からのスライスは、培養で最大2週間自発的な鼓動を示す 。大人のスライスの自発収縮もまた起こり得るが、それらが伝導系の細胞によって誘導されるのか、または細胞損傷およびCa 2+を示す可能性があるかは不明であるオアド18 。 将来のアプリケーション活動電位特性および興奮伝播に対する薬剤の影響を分析するための薬理学的実験に用いることができる鋭利な電極および微小電極アレイによる電気生理学的研究の他に、発育研究19または上記の移植心筋細胞15の特徴付け、新生児の心室スライス大人のスライスにも適用できる力収縮測定のために心臓が使用されている10 。 （II）細胞間結合を調べるためのギャップジャンクション透過性色素の注入、または（III）内皮の研究（I）、（II）細胞間結合を調べるためのギャップジャンクション透過性色素の注入、コロナの血管機能スライス内の船。 結論として、心室スライスは、一般的な細胞培養モデルの限界を克服するのに役立つ可能性があり、広範囲の薬理学的、生理学的、発生的および細胞治療研究に適用可能な、インビボ様構造のような保存された貴重な多細胞組織モデルである。

YamamotとMcllwainは1966年に脳切片の電気的活動がin vitroで維持されていることを示して以来、薄い組織切片が基礎科学で頻繁に使用されています1 。それ以来、脳2 、肝臓3 、肺4および心筋組織5,6,7の切片について電気生理学および薬理学的研究が行われてきた。新生児ラット心臓からの心室スライスにおける最初のパッチクランプ記録は1990年8月に記載されていたが、この技術はしばらくの間忘れ去られた。 10年以上後、我々のグループは、マウス胚9 、新生児10および大人11の心臓スライスを調製するための新しい方法を確立した。これらの生存可能な組織切片は、急性実験（成人スライス数時間栽培することもできる）または短期間の培養実験（胚および新生児スライスを数日間培養することができる）。スライスは、電気生理学的特徴および鋭い電極活動電位およびマイクロ電極アレイ記録11によって評価される均一な励起広がりのようなインビボで示す 。 「2次元」形態のため、脳室内のすべての領域に記録電極を直接アクセスすることができ、電気生理学的調査のための興味深いツールとなり、Langendorff灌流心臓全体と比較して新しい実験的選択肢をもたらす。ベラパミル（L型Ca 2+チャンネルブロッカー）、リドカイン（Na +チャンネルブロッカー）、4-アミノピリジン（非選択的電圧依存性K +チャンネルブロッカー）およびリノパルジン（KCNQ K）のようなイオンチャネルブロッカーに対するスライスの薬物応答は、 +チャンネルブロッカー） 9,11 </sup&gt;は、解離した心筋細胞に対する既知の効果に対応した。等尺性力測定は正の力周波数関係を示し、無傷の収縮機能を強く示唆した10 。これらの発見は、マウス心室スライスが、生理学的および薬理学的研究のためのインビトロ組織モデルとして適切であることを実証した。さらに、鋭い電極記録と組み合わせたレシピエント心臓の心室スライスは、移植された胎児12,13,14および幹細胞由来の15の心筋細胞の電気的および機械的な統合ならびに成熟を特徴付ける非常に有用なツールであることが判明している。 要約すると、心室スライスは、価値ある、十分に確立した多細胞組織モデルであり、解離した心筋細胞およびランゲンドルフ灌流心臓に対して相補的であると考えられるべきである（解離した細胞とは対照的に） インビボのような組織構造を提供すること、および（心臓全体の準備とは対照的に）鋭い電極記録のような測定技術の直接的なアクセスを心臓の全ての領域に提供することの大きな利点がある。

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>Microtome with vibrating blade.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blades</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Fine brush, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; size 6 (4/32&quot;)</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Preparation table</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>Molt for embedding ventricles in agarose</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4`` Needles</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2`` Needles</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small scissor</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen gas (medical grade O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbogen gas (95 % O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt Agarose</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifier</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low magnification Micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>High magnification, three-axis micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic perfusion pump</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2-channel temperature controller</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Square pulse stimulator</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies

マウス心筋細胞は、心臓生理学および新しい治療戦略のインビトロ研究に広く使用されている。しかし、解離した心筋細胞の多細胞調製物は、心臓の機械的および電気生理学的特性の両方に影響を与える、心筋細胞、非心筋細胞および細胞外マトリックスの生体内構造の複合体を代表するものではない。ここでは、保存されたインビボのような組織構造を有する成体マウス心臓の実行可能な心室スライスを調製する技術を説明し、電気生理学的記録のためのそれらの適合性を実証する。心臓の切除後、脳室を心房から分離し、2,3-ブタンジオンモノオキシムを含有するCa 2+不含溶液で灌流し、4％ 低融点アガロースブロックに包埋する。このブロックを振動刃付きミクロトーム上に置き、厚さ150〜400μmの組織切片を作製し、振動をfreブレードを60-70Hzで回転させ、ブレードを可能な限りゆっくりと前進させる。スライスの厚さは、さらなる用途に依存する。スライスを、0.9mMのCa 2+および2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）を含む氷冷Tyrode溶液に30分間保存する。その後、スライスを37℃のDMEMに30分間移してBDMを洗い流す。スライスは、収縮機能を分析するための力測定、または移植された幹細胞由来の心筋細胞と宿主組織との相互作用を調べるために、鋭利な電極または微小電極アレイを用いた電気生理学的研究に使用することができる。鋭い電極記録のために、スライスを倒立顕微鏡の加熱プレート上の3cm細胞培養皿に入れる。スライスを単極電極で刺激し、スライス内の心筋細胞の細胞内作用電位を鋭利なガラス電極で記録する。

心筋梗塞は、実質的に不可逆的な心筋細胞の喪失をもたらす。外因性心臓再生のための幹細胞由来心筋細胞を用いる細胞補充療法は有望な治療アプローチである。移植された細胞の電気的統合および成熟は、細胞置換療法の安全性および効率のために重要である。 組込みおよび成熟を評価するために、本発明者らは、成熟マウスの健康な心臓に、増強された緑色蛍光タンパク質（eGFP）を発現する、誘発された多能性幹細胞（iPSCM; 0.5×10 6 iPSCM /10μLの2回の注入）に由来する心筋細胞を移植した（Peinkofer et al。方法の詳細な説明については15 ）。移植の6日後、レシピエント心臓の心室スライスを記載のプロトコールを用いて調製した。代表的な録音は図3移植されたiPSCMを含むスライスを37℃でDMEMに入れ、宿主組織中に配置された単極性電極によって局所的に刺激した（ 図3A 、左）。 eGFP陽性移植iPSCMおよびスライス内の隣接する宿主組織において、3M KClで満たされた鋭利なガラス微小電極で細胞内作用電位を記録した（ 図3A 、右）。 受容者の心臓への移植されたiPSCMの持続性および電気的統合を実証することができた。 iPSCMは、移植された心筋細胞において細胞内に記録された刺激アーチファクトおよび活動電位の時間的相互依存性が存在する場合、電気的に統合されたと考えられた（ 図3B ）。電気的統合の品質は、電気的活性化の遅延、 すなわち刺激と開始の間の遅延によって定量化することができた活動電位の上昇、および伝導ブロックのない最大刺激周波数、 すなわち 、各刺激後に1：1世代の活動電位に至る最大刺激周波数である。 この代表的な実験における移植されたiPSCMは、約5Hzの伝導ブロックのない最大の刺激頻度（ 図3B 、右）によって示されるように、電気的に統合されたが、カップリングの質は、刺激アーチファクトと活動電位アップストローク（宿主組織：8ms; iPSCM：20ms）との間の遅延。宿主心筋細胞の活動電位は、84mVの振幅、-74mVの最大拡張期電位、50％再分極時の11ms持続時間、90％再分極時の108ms持続時間および114V / sのアップストローク速度を有した。刺激周波数を1Hzから5Hzに増加させると、活動電位の低下が生じる90％再分極時のイオン（86ms）。移植されたiPSCMは、活動電位特性に有意差を示した。宿主細胞と比較して、振幅はより小さく（53mV）、最大拡張期ポテンシャルはマイナス（-54mV）、再分極50％における持続時間（14ms）、再分極90％での持続時間がより短く（90ms）、アップストローク速度より遅い（57V / s）。刺激周波数が1Hzから5Hzに増加すると、90％再分極（67ms）で活動電位持続時間が減少した。結論として、この代表的な例では、移植後6日で、分析したiPSCMは、未熟な心筋細胞の典型的な特徴を示した。この事例の知見は、統計的に十分な数の細胞および調製物の測定値と一致しており、 15日前に報告されている。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig1.jpg" /> 図1： </心臓をアガロースに埋め込むためのカスタムメイドの金型。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55725/55725fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig2.jpg" /> 図2： 鋭利な電極記録のためのカスタムメイドのリング電極（グランド）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55725/55725fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig3.jpg" /> 図3： 移植されたiPSCMの電気的統合 。 （ A ）eGFP陽性iPSCMを含む心室心臓スライス（左）（右）。 SE：刺激電極。赤い点が録音の位置を示します。 （ B ）健康な宿主組織（上のトレース）および移植されたiPSCM（下のトレース）における活動電位記録。スライスは、約2Hz（左のトレース）および5Hz（右のトレース）で宿主組織に配置された刺激電極で、顔面刺激された。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55725/55725fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

ここでは、成体マウスからの生存心室スライスの調製および鋭い電極活動電位記録のためのそれらの使用を記載する。これらの多細胞調製物は、 インビボでの電気生理学的および薬理学的研究のための貴重なモデルとなる組織構造のような保存されたインビボを提供する。

電気生理学的研究のためのマウス短軸心室スライス

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

7.3K ビュー.  University of Cologne. ここでは、成体マウスからの生存心室スライスの調製および鋭い電極活動電位記録のためのそれらの使用を記載する。これらの多細胞調製物は、 インビボでの電気生理学的および薬理学的研究のための貴重なモデルとなる組織構造のような保存されたインビボを提供する。 

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

生物工学

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

医学

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

生物学

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

元ヴィヴォ・ランゲンドルフ・パーフュード・ハーツの眼電図と電気生理学研究

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

マウスにおける心内ペース作りの欠損を同定するための、中房ノードの発火率のマイクロ電極アレイ記録

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Generation of Porcine Ventricular Slices: A Vibratome-based Technique to Prepare Ultra-thin Slices of Pig Heart Tissue

Source: Ou, Q. et. al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60913">Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based procedure to generate viable, ultra-thin sections of pig heart. The prepared tissue slices can be cultured and used as model systems for pharmacological testing.

ブタ心室スライスの生成:ブタ心臓組織の超薄スライスを調製するためのビブラトームベースの技術

Source: Ou, Q. et. al., Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based ...