マイクロウェルアレイは、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局のナノフェーズ材料科学センターのユーザー施設部門のセンターで製作され、特性評価されました。この研究の資金援助は、オークリッジ国立研究所所長の研究開発基金を通じて提供された。著者らはまた、これらの研究で使用されたP.緑膿菌株の供給についてJ. Mougous Laboratory（Washington、Seattle、WA）に感謝したい 。

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著者は何も開示することはない。

この記事では、マイクロウェルアレイデバイスと、細菌のコミュニティ開発のハイスループットと高含量の生細胞イメージングベースの解析を可能にするための実験プロトコルを紹介しました。ここでのデモの焦点は、接触仲介型VI型分泌が地域社会の発展に及ぼす影響を研究することであったが、広範囲の微生物群集と微生物 - 微生物相互作用の研究に柔軟に対応するように設計された。ここでの研究は、構成員の存在および位置の容易な追跡を可能にする蛍光マーカーを恒常的に発現する細菌の使用にのみ焦点を当てている。しかしながら、化学環境を変化させることによって成長または摂動後に個々のウェルから生物材料をサンプリングする機会は、原則として、コミュニティ組成および遺伝子発現を同定するために使用され得る。 各シリコンデバイスは、さまざまなウェルを備えたマイクロウェルを含む数十のアレイで構成されています2倍、3倍、または4倍の直径のピッチで組織され、3＆3.5μmの深さまでエッチングされる。栄養素と二次代謝産物はアガロース蓋を通して自由に拡散することができるため、マイクロウェル間のシグナル伝達や局所栄養素枯渇がどのように地域社会の発展に影響するかを調べるために、異なるピッチサブアレイが含まれていました。このデモンストレーションでは、成長と地域開発は、アレイ内のマイクロウェルの間隔や位置によって影響を受けていないようです。浅い奥行きは、画像分析を単純化し、すべての微生物の成長と発達を単一の画像平面に制限するように選択された。しかしながら、深い井戸（深さ20μm）は以前から使用されており、シリコンエッチングプロセスの持続時間を変えることによって深さを容易に調節することができる。ウェルのアスペクト比を増加させることは、本質的に、ウェルの内部の細胞が経験する閉じ込めの程度を変え、効果的にウェルの総体積の比を変化させる栄養分が井戸の頂部に拡散する領域に移動する。この多様なアレイ構成は、ウェル - ウェルまたはウェル - ウェル信号の影響を研究するために使用することができる。 マイクロウェルを製造するためにシリコンを使用することの1つの制限は、可視光に対して不透明であることである。したがって、光の透過に依存するルーチン分析（ 例えば、明視野、位相、または微分干渉コントラスト画像）は、成長を監視するために使用することができない。我々のグループで進行中の研究開発は、このシリコンマイクロウェルの構成と、透明アレイを用いた作業のための実験プロトコルを適応させることに焦点を当てている27 。ガラスカバースリップ上にSU-8エポキシなどの透明材料を使用することにより、より短い作動距離で動作する対物レンズで明視野像と蛍光像の両方を得ることができる。これにより、ケイ素アレイの場合のように、寒天層を介して画像化することを困難にすることなく、倍以上の倍率を有する水浸漬または油性対物レンズにより、より最適な解像度を得ることが可能になる。 我々の以前の研究に記載されているように、播種条件およびウェルジオメトリはウェルアレイ内の細胞の播種に影響する。低い播種密度または小さなウェルでは、個々のウェルに負荷する細胞の数およびタイプの高レベルの変動が、実験パラメータ空間の広範囲かつ迅速な探索を可能にする。より高い播種密度および/またはより大きなウェルの画像化は、細胞型および総接種物レベルのより一貫した比率をもたらし、多数の実験的反復の分析を可能にする。成長の初期段階で画像を素早く見てみると、細胞が主にウェルの縁に沿って付着して増殖することが示唆されます（ 図5a ）。これがsに関連するアーティファクトかどうかは不明です播種プロセス中に蒸発乾燥するか、複数の縁に細胞が付着することが好ましいことを示唆している。確定的な方法でウェルのトポグラフィまたは表面化学を意図的に変更することにより、どの因子が細胞付着およびバイオフィルム形成に最も大きな影響を与えるかを明らかにすることができる。 これらのウェル中の細菌の増殖は、R2A培地を注入したアガロースゲル被覆ガラスカバースリップの使用によって支持される。このアガロースコーティングされたカバースリップを作製するために記載された方法は、画像化するための均一な厚みおよびかなり一定のz位置を確実にし、複数のシリコンチップを同時に画像化することを可能にする。ゲル化剤として超純粋アガロースを使用し、完全培地ではなく最小培地を使用すると、より清潔で自己蛍光性のバックグラウンドが得られ、全体的なシグナル - ノイズ比が高まる。微生物群集の定量的な追跡のために蛍光に頼っている場合、それを維持することが不可欠です一貫した条件であり、自家蛍光、光退色、および不均一照射からの寄与を鋭く認識している。さらに、長い時間経過の画像取得を必要とする実験では、ここで使用されるような厚いアガロース層が望まれる。高倍率のイメージングを可能にするために、より薄い層（厚さ約100μm）を作ることができる。しかし、薄い層が乾燥するのを防ぐのに十分なほど湿ったアセンブリを保つことは困難です。 成長パラメータと初期接種レベルの初期分析は、ここに記載されている単純なシステムではまだ有意な相関関係を示していませんが、示されたプロトコルとデータは時間の経過とともにコミュニティ開発のイメージから抽出できる情報の深さを強調しています。ウェル内の空間的構成は、単一種のコロニーが最初の「核形成」サイトから拡大するにつれて進化する。したがって、最初の付着密度に関連する因子（ すなわち、ペーハ井戸のための1つの種が他の種と比べてより高い優先度からのps）、または個々のパッチの成長率はコミュニティ開発に劇的に影響を与える可能性がある。成長プロセスの非常に遅れて確立された種（パッチ）間の接触によって媒介されるようなサブトラ相互作用は、画像データのより詳細な解析を必要とすることがある。 ここに提示されたマイクロウェルアレイプラットフォームおよびプロトコルは、微生物のコミュニティ開発および微生物 - 微生物相互作用の迅速な組立および高含有量分析を促進する。寒天リッド内の培地の組成を変更することにより、または統合されたマイクロフルイディクスを介して直接的に調節およびサンプリングすることによって、局所化学環境の制御を可能にする将来の研究は、自然な閉じ込めおよびニッチサイズを模倣する実験プロトコルを可能にし、自然界に見られるような動的に変化する環境の影響を探る。将来の仕事は増強する局所的な化学的環境を動的に調節し、個々のウェルから流体をサンプリングするために使用することができる集積マイクロ流体によるアレイ設計。コミュニティの成長の高分解能および明視野追跡に使用できる光学的にクリアなマイクロウェルアレイの開発に関する追加作業は、他の場所でも説明されている27 。

微生物群は、環境の構造や細胞死、分裂、タンパク質濃度、オルガネラ数、突然変異1に関連する確率論的プロセスのような決定論的要因の両方によって形成される。自然環境の中で、これらの影響がコミュニティの構成と活動に与える個々の影響を解析することは、ほとんど不可能です。自然の構造によって隠され、化学的および生物学的環境に埋もれて、コミュニティのメンバーを特定し、自然環境内で時空間分布をさらに解決することは非常に困難です。それにもかかわらず、最近の努力は、地域の機能に関する空間的組織の重要性を強調し、進行中の研究2,3,4でメンバーの豊富さと組織の両方を考慮する必要性を指摘している。 それ（ 例えば、土壌構造、植物の根、海洋粒子、または腸の微絨毛）、酸素の存在または不存在、およびその存在が、病原性種はすべて、微生物群集の組成、構造、および機能に影響を及ぼす5,6,7,8,9,10,11。それにもかかわらず、これらの要因を捕らえることを怠った伝統的な文化の技法が引き続き普及している。コミュニティ構成（ 例えば、共依存種の存在）、物理的付着、シグナル伝達分子濃度、および直接的細胞 - 細胞接触は、微生物共同体を形成するためのすべての重要な因子であり、c予防的培養条件。これらの特性は、バルク液体培養または寒天プレート上で複製することは困難である。しかし、自然環境の主要な物理的および化学的特徴の複製を可能にするマイクロ流体、マイクロパターン形成、およびナノ製造技術の可能性は、多くの研究者が相互作用を研究する細菌群集を構築することを可能にした12,13,14。自然条件4,15,16,17,18,19,20を模倣する。 このプロトコールは、マイクロウェルアレイデバイスを作製する方法を記載し、そして、機能的にするために使用され得る詳細な実験手順を提供する単一ウェルのウェル内で細菌を増殖させることができます。この研究はまた、蛍光レポータータンパク質を産生するように改変された細菌が、時間の経過とともにウェル内の細菌増殖をモニターするためにどのように使用され得るかを実証する。同様のアレイを以前に提示し、 マイクロウェル中の緑膿菌（ P.緑膿菌）の単一種コロニーの成長を追跡することが可能であることを示した。ウェルサイズと播種密度を調整することにより、何千もの増殖実験の開始条件を並行して変化させることができ、初期接種条件がバクテリアの増殖能力にどのように影響するかを決定することができる21 。現在の研究では、複数のアレイの同時比較を可能にし、より堅牢な実験プロトコールを使用することにより、前の研究に基づいて構築されたわずかに改変されたマイクロウェルアレイのバージョンを使用する。この作品で使用されているアレイには、複数のサブアレイ、または配列ensem3つの異なるピッチ（ すなわち 、ウェル直径の2倍、3倍、および4倍）で配置された、直径15〜100μmの範囲の異なるサイズのウェルを含む。アレイはシリコン内にエッチングされ、シリコン注入アレイに封入された細菌の増殖は、培地注入アガロースゲルで被覆されたカバースリップでアレイを密封することによって可能になる。タイプ6分泌系を研究するために設計されたP.aeruginosa変異体がこのデモンストレーションで使用される。 ここで提示された結果は、マイクロウェルアレイ内のマルチメンバーコミュニティを分析し、化学環境の制御と探索を行っている間、研究者がバイオウムの豊富さと組織をインサイチュで監視できる究極の目標に向かっています。これは、最終的に、コミュニティの発展と継承を支配する「ルール」についての洞察を提供するはずです。

<table><tbody><tr><td>Parylene N</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>CAS NO.:1633-22-3</td><td></td></tr><tr><td>Parylene coater</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>WRS Materials</td><td>100mm diameter, 500-550&amp;mu;m thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos&amp;lt;100&gt;,</td><td></td></tr><tr><td>adhesion promoter</td><td>Shin-Etsu Microsci</td><td>MicroPrime P20 adhesion promoter</td><td></td></tr><tr><td>postive tone photoresist</td><td>Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow)</td><td>Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)</td><td></td></tr><tr><td>Quintel Contact Aligner</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Mask Aligner</td><td></td></tr><tr><td>Reactive Ion Etching Tool</td><td>Oxford Instruments</td><td>Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher</td><td></td></tr><tr><td>R2A Broth</td><td>TEKnova</td><td>R0005</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Multimode Plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>Enspire, 2300-0000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Automated Stage</td><td>Prior</td><td>ProScan III</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top environmental control chamber</td><td>In Vivo Scientific</td><td>STEV ECU-HOC</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm No. 1.5 coverslip</td><td>Nexterion</td><td>High performance #1.5H coverslips</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Reference Slides</td><td>Ted Pella</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>Physical Stylus Profilometer</td><td>KLA Tencor</td><td>P-6</td><td></td></tr><tr><td>lab wipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155</td><td></td></tr><tr><td>commercial software</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filter cubes</td><td>Nikon</td><td>Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)</td><td></td></tr></tbody></table>

assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform

微生物群集の発達は、コミュニティメンバーの空間分布および活動を劇的に変えることができる複雑な決定論的および確率論的因子の組み合わせに依存する。我々は、数千の細菌群を並行して迅速にアセンブルおよび追跡するために使用できるマイクロウェルアレイプラットフォームを開発しました。このプロトコルは、プラットフォームの有用性を強調し、プラットフォーム内の配列のアンサンブル内の単純な2メンバーのコミュニティの開発を光学的に監視するための使用方法を説明します。このデモでは、 緑膿菌の 2つの突然変異体を使用しています。これは、タイプVIの分泌病原性を研究するために開発された一連の突然変異体の一部です。 mCherryまたはGFP遺伝子のいずれかの染色体挿入物は、各マイクロウェル内のコミュニティメンバーの存在および位置をモニターするために使用され得る異なる発光波長を有する蛍光タンパク質の構成的発現を促進する。このプロトコルは、アレイのウェルに細菌の混合物を組み立て、時間経過に伴う各メンバー集団の相対的成長を測定するための経時的蛍光イメージングおよび定量的イメージ分析を使用する。マイクロウェルプラットフォームの播種およびアセンブリ、アレイ内の微生物群集の定量分析に必要なイメージング手順、およびすべて説明した微生物種間の相互作用を明らかにするために使用できる方法。

ここに提示された実験プラットフォームは、細菌群集のハイスループットおよびハイコンテント研究のために設計されています。このデザインにより、さまざまなサイズのウェルで成長する数千のコミュニティを同時に分析することができます。このマイクロウェルアレイ設計により、初期の播種密度、井戸の大きさ、および化学的環境への最終的なコミュニティ組成の依存性を決定することができる。この作品は、マイクロウェルアレイにおける2人のコミュニティの成長を示し、コミュニティの構成と組織を分析する方法を提示します。 ここで使用されているモデルシステムは、P.aeruginosaのタイプVI分泌を研究するためにMousgousラボで設計されました。このシステムは、GFPまたはmCherry蛍光レポーターのいずれかを含むいくつかの突然変異株から構成されています。この研究では、2つの異なる系統を用いた。第1のものは、GFP標識されたΔretS突然変異体であり、これは構成的yは、VI型分泌に関連する毒性エフェクタータンパク質を発現し、感受性細胞におけるより高いレベルの細胞死をもたらす。 2つ目はRFPで標識されたΔretSΔtse/ i1-6株であり、これは6つの既知のエフェクタータンパク質をすべて欠失しており、タイプVIの病因22,23,24により感受性が高いことが示されている欠失変異体である。各種の成長軌道は、個別に、および2つのメンバーコミュニティ（ すなわち 、アレイプラットフォーム内の共カルチャー）内で追跡された。 ΔretSおよびΔretSΔtse/ i1-6突然変異体をそれぞれ別々に3つのアレイに播種し、1：2の比で一緒に混合し、30時間ごとに20時間画像化した。ウェル中の細菌増殖は、6および12時間後に終了した。蛍光画像データの例を図2および図3に示す。 図2は、直径45μmのウェルにおけるΔretSおよびΔretSΔtse/ i1-6株の経時的な増殖を示し、 図3は、様々なサイズのウェルにおける約6時間のポストシード（hps）におけるこれら2つの同じコミュニティの状態を示す。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig2.jpg" /> 図2：時間経過共培養増殖実験のサンプル画像。 mCherry （ ΔretSΔtse/ i1-6）（赤色）またはGFP（ΔretS）（緑色）のいずれかを発現するP.aeruginosaの 2つの突然変異体を、マイクロウェルアレイ中の2：1mCherry：GFP比で一緒に播種する。ここには、直径45μmのウェル内の3つの異なる時点で撮影した合成画像が示されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55701/55701fig2large.jpg" target="_blank">より大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください</a>この図の<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig3.jpg" /> 図3：マイクロウェルアレイデバイスに含まれるウェル径の範囲。 2メンバーのコミュニティの代表的な画像は、成長の8時間で捕獲された。一般に、mCherry（ΔretSΔtse/ i1-6）（赤色）またはGFP（ΔretS）（緑色）コロニーは、最小限の共局在を示し、マイクロウェルの異なる領域内にとどまる。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55701/55701fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 測定値の取得に先立ち、スライディング・パラバロイド・バックグラウンド減算が行われた。所与の実験で画像化された各マイクロウェルからの信号を定量的に比較することができるように照明補正ステップを使用した。これらの方法はp明らかに25を記述した 。 ImageJのマイクロアレイプラグインを使用して、局所的なバックグラウンドシグナルとともに、補正された画像において赤色および緑色の細菌の平均強度を測定した。局部バックグラウンドシグナルをウェルシグナルから差し引き、緑膿菌共培養物の自己蛍光（mCherryΔretSΔtse/ i1-6-onlyアレイから決定される自己蛍光）を補正するためにGFPシグナルを調整した。これらの補正がすべて行われると、mCherryおよびGFPを発現する細菌の量的成長軌跡をプロットすることができました。 20および50μmの直径のウェルからの例示的な成長軌道を図4に示す 。 <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig4.jpg" /> 図4： 緑膿菌タイプIV分泌突然変異体の単一および共培養の増殖曲線。（ aおよびd ）20μmおよび50μmのウェルにおけるGFP-ΔretS単培養増殖曲線。 （ bおよびe ）mCherry-ΔretSΔtse/ i1-6単培養物の成長曲線をそれぞれ20および50μmウェルで測定した。 （cおよびf）GFP（緑色）およびmCherry（赤色） P.aeruginosa株の1：2比混合物の共培養。成長曲線は、画像取得が始まったときから、約2時間の後（hps）にプロットされている。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55701/55701fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> P.aeruginosa株の単一培養および共培養からの増殖の軌跡は、ウェルからウェルへの成長にいくらかの変動性があり、このばらつきがより小さい寸法のウェルで増加することを示している。しかし、平均強度はウェルsiの影響をあまり受けないze。 ΔretS株が存在する場合、感受性株（ΔretSΔtse/ i1-6）の増殖に劇的または明確な負の効果はないようである。各菌株の全体的な強度は減少したが、これは、ウェル内の各菌株の開始濃度がより低いことによるものであった。しかし、単に成長軌道を見るだけでは、これらの井戸内の細菌の増殖を理解するためにどのような要因が最も重要かを判断することは困難です。したがって、各軌道は、関連するパラメータを抽出して細菌増殖データを分析するために使用することができるように、変更されたロジスティック関数26 （ 図5a ）に適合させた。各軌道は、初期信号によって分けられた信号の自然対数を取ることによって変換された。修正されたロジスティック関数。最大信号（A）に対応する3つのパラメータ、最大値速度（μ）、および遅延時間（τ）を用いて各軌道に適合させた。 GFP-ΔretS株とmCherry-ΔretSΔtse/ i1-6株との間の既知の相互作用が与えられた場合、mCherry株の増殖はGFP-ΔretS株との共培養において阻害されると仮定し得る22,24 。抽出されたパラメータを使用して、GFPおよびmCherry軌道から抽出されたパラメータ間の正または負の相関を探すことが可能である。初期のパラメータ分析は、これらの種の共存培養物がそれらの全体的な成長にほとんど影響しないことを示唆した。成長曲線に見られるばらつきは、初期播種密度などの環境要因に起因する可能性があります。これは、より小さな井戸直径でより可変性になります（ 図5b ）。 mCherry株の存在による重大な悪影響<html> GFP-ΔretSは観察されなかった。例えば、最大mCherryシグナル対初期GFP-RFPシグナルの比をプロットする場合、ウェル中のGFP-ΔretSの比率がより高い場合、mCherry発現の減少は見られなかった。 <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig5.jpg" /> 図5：変更されたロジスティック方程式に適合する蛍光成長軌道。 （ a ）曲線の例を正規化し、最大強度（A）、最大速度（μ）、および遅れ時間（τ）の3つのパラメータを調整することによって修正されたロジスティック方程式に適合させる。 （ b ）種々の直径の個々のウェルにおける最初のmCherryシグナル対初期GFPシグナル。 （ c ）RFP発現細菌に対するGFP発現細菌の初期強度の比に対してプロットされた最大mCherryレポーターシグナル。ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 Mougous研究室でのこれまでの研究では、VI型分泌の影響は、分泌細胞と感受性細胞との直接の細胞間接触が必要であり、接触時間が長くなると細胞溶解が多くなることが示された23 。したがって、我々は、これらのアレイにおいて、2つの突然変異体の指数関数的増殖が、このモデル系における接触媒介性の病原性効果を単純に凌駕していると考えている。しかし、すべてのサイズのウェルにおいて、GFPおよびmCherry発現細菌は異なるパッチで増殖する（ 図2 および 3 ）。したがって、成長速度に焦点を当てるのではなく、接触媒介病原体を含む細菌の集団は、空間分析を用いてよりよく研究され得る。例えば、focusiではなくウェル内の赤色または緑色細胞の総数を表す積分強度に基づいて、このマイクロウェルフォーマットは、赤色および/または緑色ピクセルの数および位置をカウントすることを可能にする。これらのウェル内の個々のコロニーまたはパッチの成長を、赤と緑のシグナルが重なる境界に焦点を当てて分析することが可能です（ 図6a ）。次いで、共局在化イベントおよび最近傍分析を定量化して、パッチサイズ、パッチ成長速度、および個々のウェル内のパッチ重複のような特性をより詳細に見ることができる。空間分析は、高倍率の画像化および共焦点顕微鏡検査によって補助される（ 図6b ）。 <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig6.jpg" /> 図6：異なる種の空間的組織は、エピフルーセントおよび共焦点顕微鏡法を用いて分析することができる。 （ <st100μmの1つのウェルからの一連の画像を、20倍の倍率および0.8のNAを有する共焦点顕微鏡を用いて取得した。白い矢印は赤色と緑色のコロニーが重なっているか混ざっている黄色の領域を指しています。これらの領域でどのようにコロニーが成長するかを分析することは、接触に基づく病因の研究にとって興味深い。 （ bおよびc ）直径15μm、深さ7.5μmのウェルの共焦点画像（倍率20倍、NA = 0.8）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55701/55701fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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マイクロウェル アレイ プラットフォーム内での微生物群集の発達の組み立てと追跡 |バイオエンジニアリング |ビデオ

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

微生物群集の発達は、環境構造、メンバーの豊富さ、形質および相互作用を含む複数の要因の組み合わせに依存する。このプロトコルは、ニッチサイズや閉じ込めなどの重要な要素を近似できるフェムトリットルウェルに含まれる数千のコミュニティを同時に追跡するための合成の微細加工環境を記述しています。

マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

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8.9K ビュー.  Oak Ridge National Laboratory. 微生物群集の発達は、環境構造、メンバーの豊富さ、形質および相互作用を含む複数の要因の組み合わせに依存する。このプロトコルは、ニッチサイズや閉じ込めなどの重要な要素を近似できるフェムトリットルウェルに含まれる数千のコミュニティを同時に追跡するための合成の微細加工環境を記述しています。 

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Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

生物工学

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

工学

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

生物学

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

細菌スクリーニング、選択、および分離のための光分解性ヒドロゲルインターフェース

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...