私はイワノフとアンダーソンのラボのメンバーに、この原稿に関する有益な議論とフィードバックを感謝します。この研究は、ポーランド国立科学センター（UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054からWSへの付与）の国立衛生研究所[PA、NS094918からPIへのGM111700およびCA168872]によって支持された。 WSはまた、ポーランドの科学と高等教育省（モビリティプラスプログラム）とポーランド・アメリカのフルブライト委員会が米国での彼の研究の財政的支援を認めていることも認めています。

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著者は何も開示することはない。

複数の疾患における免疫組織学的研究によって証明されるように、慢性ストレスは、異なる細胞内病巣の形成をもたらす。例えば、ほとんどの神経変性疾患は、不溶性タンパク質の細胞内凝集物を特徴とする。このような凝集体中のSG結合タンパク質の存在は、しばしば、そのような病巣がSGであると結論付けるための基礎である。新しいストレス刺激で処理した細胞でSGマーカー陽性細胞質病巣が観察された場合も同様の結論が導かれる。このプロトコルは、 真の SGを識別するための簡単なワークフローを提供します。 組成とダイナミクスの両方の特徴付けを含む、推定SGsがそのように確認されるためのいくつかの基準が満たされなければならない。第1に、SGは翻訳停止したmRNPを含む細胞質の病巣である。したがって、第1のアプローチは、2つの顕微鏡ベースの技術、すなわちポリA-FISHおよびIFを使用してそれらの組成を特徴付けることである。 FISHは視覚的に信頼できる方法ですSGと共局在するmRNAを生成する。オリゴ（dT） 40プローブを用いて、ストレス条件下でSGにパックするポリアデニル化mRNAを検出する。オリゴ（dT）はプロセシングボディ（PB）のコア成分であるデテニル化されたmRNAを検出しないので、細胞質病巣における強力なオリゴ（dT）シグナルの存在が、これらの病巣がSGs。第2の試験は、他のSGマーカー（ 例えば、 G3BP1）（ 図2A ）とポリ（A）シグナルの共局在を実証することである。これは、SGマーカータンパク質に対してIFを行うことによって行われる。 eIF3bおよびeIF4Gは48S *複合体の成分であることが知られている翻訳開始因子であり、G3BP1はSG形成に必要である（ 図2B ）ため、SGマーカーeIF3b、eIF4G、およびG3BP1が日常的に使用される。異なるストレスが異なるSG関連因子をSGに動員するので、複数のSGマーカーが必要であることを強調することが重要であり、いくつかのストレスはcSG形成と間違える可能性のあるタンパク質凝集を利用する。 第2に、SGは翻訳阻害のために形成される。翻訳の阻害は異なるアプローチ（ 例えば伝統的な[ 35 S] Metチェイスラベリング）によって検出することができるが、処理された細胞における進行中のタンパク質翻訳を検出するので、リボプロマイシン酸化が好ましい。この技術はまた、SGマーカーに対する標準的な免疫蛍光と適合し、したがって、SGおよび個々の細胞における翻訳阻害の程度の同時監視を可能にする。 図3に見られるように、SAおよびVRBの両方は、SG形成を異なる程度に促進する。 SAは細胞の100％近くのSGを引き起こすが、VRBは約75％の細胞でSGの形成を促進する。 SGを促進する能力は、翻訳阻害の程度と相関する：未処理細胞は高い基底レベルの翻訳を有するが、SAは翻訳を完全に阻害するが、VRBのみはpa翻訳を阻害する（ 図3 ）。 第3に、SGは動的であり、ポリソームを翻訳することと平衡している。ストレスの前またはストレスと同時にシクロヘキシミドで細胞を処理することは、ポリソームの分解およびSG形成を防止する。 SGを提示するストレス細胞は、生産的に開始されるときはいつでも、ポリソームまたはモノソーム中のmRNAをトラッピングすることによってSG分解を実施するためにシクロヘキシミドで処理することができるので、SG-ポリソーム平衡は双方向性である。重要なコントロールは、早期終了を促進することによって伸長を阻害するピューロマイシンを使用することであり、SG形成に利用可能な非ポリソームmRNPの量を増加させる。 SGの劇的な変化は、SAまたはVRB処置がCHXまたはpuro処置と組み合わせられた場合に観察される（ 図4 ）。したがって、推定SGがシクロヘキシミド処置に分解されるかどうかを評価するが、ピューロマイシンによって増強されるか、または影響を受けないかは、SG同定に使用するための重要な実験パラメータであるカチオン。非常に小さく付着していない一次ヒト骨髄CD34 +細胞におけるエメチン誘発SG分解は、細胞内染色前に懸濁細胞を処理することによって首尾よく実証された32 。 亜ヒ酸ナトリウムは、eIF2-αリン酸化33を誘導することによってSGを誘発するために広く使用されているが、多くのタンパク質を標的とし、多くのシグナル伝達経路34,35を活性化するので、 注意深く滴定すべきである。異なる細胞株は亜ヒ酸ナトリウムに対する様々な程度の感受性を示す。 U2OSは比較的感受性が高く（100μM）、COS7、MEFおよびHeLaは200μMを必要とする。 DU-145 6 、初代正常ヒト骨髄CD34 +細胞32 、ヒトリンパ芽球36 、マウス皮質ニューロン37 、およびHuh7細胞31は、500〜1,000μMを必要とする。 <p clSGの分類は主に顕微鏡に基づく方法論であるため、偏っていない高品質の画像を取得することが重要です。偏りのない方法で画像を撮ることが重要です.SGの数が多いまたは少ない領域を選択すると、結果が歪んでしまう可能性があります。他の考慮事項は、同じ露出を使用して各チャンネルの画像を撮影すること、これはカバースリップ全体の強度の変化がそのマーカーの変化を示すことを確実にする。さらに、すべての画像を非飽和レベルの強度で撮影して、実験全体にわたって強度を評価できるようにします。同じ顕微鏡/カメラを使用して、同じ日にすべての画像を取得します。電球強度の変化は、日々、顕微鏡の間で変化する可能性があります。最後に、スライドの画像に使用される顕微鏡のフィルターと設定を確認することが重要です。このプロトコールは、UV、グリーン、レッド、およびファーレッドチャンネルの可視化を可能にするフィルターセットを備えた顕微鏡用にセットアップされています。調整は異なる顕微鏡に必要です。 ここに記載された実験的なワークフローは、異なる細胞および異なるストレス下でのSGの検出を可能にする。このワークフローの主な利点は、簡単であり、 真正な SGの明確な検出だけでなく、ストレス処理細胞における細胞翻訳の同時プロービングも可能であることです。このプロトコールはU2OS細胞を使用するが、異なる細胞株または一次細胞についても改変することができる。ストレス顆粒研究に使用される細胞の最近の包括的リストはレビュー11である。細胞数は、薬物治療の当日に80％コンフルエントに達するように調整しなければならない。細胞の反応が異なるため、薬物治療の濃度と期間も調整する必要があります。さらに、このプロトコルは24ウェルフォーマットに設定されていますが、カバーグラス（任意のサイズ）がプレーティングおよび薬物処理中に平らになることができる任意のサイズプレートまたはディッシュに調整することができますnt。 SG / PBマーカーを安定して発現する細胞株は、ハイスループットのsiRNAベースのスクリーン33および生細胞イメージング38で使用されている 。内在性SGマーカーPABPについて染色されたHeLa細胞を使用して、SGアセンブリ39をブロックする化合物を検出する画像ベースのスクリーニングを用いた。このワークフローは将来の研究やアプリケーションに役立つことが期待されています。

細胞はストレスに応答するために多くのメカニズムを使用します。いくつかの応答は、転写後レベルで起こり、mRNA翻訳および/または安定性を調節することを含む1,2 。ストレス調節されたmRNAの翻訳停止および分解は、特異的な非膜性細胞巣の形成に関連しており、最もよく特徴づけられているのはストレス顆粒（SGs​​） 3である。 SGは、ストレス（ 例えば、酸化、熱ショック、栄養飢餓、ウイルス感染）に応答して、翻訳拘束細胞に非翻訳mRNPを集中させる細胞質病巣である4 。非翻訳mRNAに加えて、SGは翻訳開始因子、RNA結合タンパク質、および様々なシグナル伝達タンパク質を含む5 。 SGは阻害されたタンパク質翻訳および改変されたRNA代謝のバイオマーカーであり、細胞生存およびアポトーシス、シグナル伝達経路に関連しているs、核プロセス5 。 SGは動的エンティティであり、それらの形成は細胞翻訳6の状態に密接に関連している。一見しっかりした外見にもかかわらず、ほとんどのSGタンパク質成分は、滞留時間が秒で急速に出入りする。 SGは数分から数時間持続しますが、その構成要素のほとんどは急速に変化しています。翻訳開始の阻害およびそれに伴う翻訳ポリソームの解体は、SGの形成を促進する。したがって、SGは翻訳ポリソームと平衡状態にある。このポリソーム/ SG平衡は、 真の SGを他のストレス誘導病巣から区別するための鍵である6,7。 停止開始停止は、mRNA、翻訳開始因子（eIF）、および40Sリボソームサブユニットを含む翻訳コンピテントな開始前複合体の変換を伴う<html> （いわゆる48S *複合体）に翻訳し、SGs 4,6に融合することができる。 SGSは、48S複合体形成の上流の2つの異なる段階で翻訳停止が促進される：キャップ結合eIF4F複合体（ 例えば、そのeIF4Aサブユニットを標的とする）の機能への干渉または翻訳開始因子eIF2のαサブユニットのリン酸化4つのeIF2キナーゼのうちの1つ以上を阻害する。停止した48S複合体（ すなわち、 40Sリボソームサブユニットおよび選択された翻訳開始因子）の存在は、SGs8,9の特徴である。 SGは、ウイルス感染、神経変性、自己免疫、および癌3,10,11,12などの様々な病的状態に関連している。ss = &quot;xref&quot;&gt; 12,13。いくつかのSG成分の変異型は、ニューロンがニューロン死に積極的な役割を果たす細胞内病理学的封入体を示す神経変性疾患（ 例えば、筋萎縮性側索硬化症）と関連している13 。いくつかのウイルスはSG成分をハイジャックしてSGの形成を阻害し、ウイルス複製を増強する14 。最近の研究はまた、化学療法および放射線療法の治療10,16,17,18,19,20の下で、SGを癌15および癌細胞の生存と関連付ける。このような発見はSG生物学に大きな関心を刺激したが、公開された報告の多くは、 真の SGの形成を他のストレス誘発病巣と区別するための重要なコントロールがない。 SGは、T細胞細胞内抗原1（TIA-1）およびポリA結合タンパク質（PABP）を含む、選択されたmRNA結合タンパク質（RBP）からなる非膜性細胞質病巣として最初に記載された。翻訳開始因子;ポリアデニル化mRNA;小型リボソームサブユニット4,6,21,22。伝統的に、それらの組成は、免疫染色および蛍光標識されたタンパク質の異所性発現のような技術によって決定されている23,24。それらの非常に動的な性質のため、SGタンパク質および/またはmRNAの免疫局在化は、SG23,24を検出するための決定的な方法論のままである。今日まで、多くのRBPおよび他のタンパク質（120以上の異なるタンパク質）がSG構成要素11として記載されている。多くのSG-局在タンパク質は、ストレス依存性および独立性の両方でそれらの局在を変化させ、他の細胞内区画および病巣に蓄積することができるので、SGマーカーを選択し、SGを他のタイプのストレス誘発フォーカス。 真正の SGは、mRNA、翻訳開始因子、および小リボソームサブユニットを含み、翻訳と動的平衡にある。 この単純なワークフローは、ストレス誘発病巣が真正 SGであるかどうかを判断するために設計されています。このワークフローには、SGsを研究するために一般的に使用される細胞であるU2OS細胞を使用したいくつかの実験的アプローチが含まれています。これらの細胞は、大きな細胞質を有し、比較的平坦でガラスカバースリップに強く付着するので、理想的である。 SGを研究するために他の細胞タイプを使用することができますが、SG核生成タンパク質のタイミング、薬物濃度、および存在量の違いが動態および成分を変化させることがあることに注意することが重要ですsition。さらに、いくつかの細胞は、細胞表面のブレブを形成することによってパラホルムアルデヒド固定に応答し、次いで、いくつかのSGマーカーの点状局在を引き起こすぎざぎざのような外観を与える。注意深く分析することなく、これらはSGとして誤って分類される可能性があります。これは、ストレス誘発病巣を真正 SGとして同定するために必要なすべての基準を評価する必要性を強調する。 SG22を促進する癌治療薬であるVinorelbine（VRB）と、強固で特徴の良いSG誘導物質であるSodium Arsenite（SA）は、このプロトコルの実験のストレスとして使用されます。 標準的なSGは、細胞質フォーカスにおいて共局在する複数のSGマーカー（タンパク質およびmRNAの両方）を含む。このプロトコルは、タンパク質マーカーおよびポリアデニル化mRNA 22のそれぞれの局在を検出するために、免疫蛍光および蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の両方を使用する。簡単に説明すると、間接免疫蛍光法は、抗体（すなわち、e。一次抗体）を細胞内で検出することができる。次いで、蛍光色素に結合した二次抗体（通常は種特異的）が一次抗体を認識し、標的タンパク質の局在を明らかにする。蛍光顕微鏡法を用いて、細胞内の局在化シグナルを検出する。異なる種で産生された抗体を使用し、異なった色の二次抗体を用いてそれらを検出することにより、複数の抗体の共局在の検出が可能になり、それらのタンパク質標的が同じ場所にあることが示される。 真正 SGで共局在することが確認されているマーカーを選択することが重要です。 FISHは、特定のRNAまたはDNA配列に塩基対合する標識プローブを使用します25 。 mRNAを検出するために、このプロトコールは、mRNAのポリA尾部にハイブリダイズする（または塩基対を形成する）ビオチン化オリゴ（dT） 40プローブ（ すなわち、ポリA FISH）。次いで、ストレプトアビジンはビオチンに対して高い親和性を有するので、ビオチン化プローブは蛍光共役ストレプトアビジンを用いて検出される。 SGを評価する場合、真正SGと同様に、ポリAアフィニティを免疫蛍光法と結合させることが重要であり、両シグナルは共局在すべきである。 このプロトコルを用いて、共局在化は複数の方法で評価される。マルチチャンネル（RGB：赤、緑、青）の画像では、共局在化によって重なった信号の色が変わります（ 例えば、共局在化された赤色と緑色は黄色に見えます）。さらに、各色の強度が所定のライン8,20にわたって測定されるラインスキャン分析を用いて、共局在化を図式的に定量化する。このプロトコルは、ImageJ26を使用する2つのラインスキャン分析手順を記述する。 1つの手順は手動であり、プロセス全体を処理します他のマクロは、マクロを使用するか、手動ステップを自動化する単純なプログラムを使用します。マクロプロシージャを理解するには、手動プログラムを実行することが重要です。 翻訳が抑制されている細胞ではSGが形成される。したがって、SGを有する細胞は、未処理細胞と比較して、全体的翻訳のレベルが低下しているはずである。実験的に、リボプロファイリングが用いられる。ピューロマイシンおよびエメチンは、固定前に短時間細胞に添加され、ピューロマイシンが積極的にポリペプチドを形成するように組み込み、終結を引き起こす27,28。再開始を防ぐには、エメチンによる治療が必要です29 。ピューロマイシンは、抗ピューロマイシン抗体を用いて検出することができ、能動的翻訳のスナップショットを与える。この方法は速く、特定のアミノ酸が欠けている培地でプレ飢餓させる必要がなく（潜在的に細胞にプレストレスをかける）ために使用され、タンパク質翻訳の細胞内局在化。特に、メチオニン類似体L-アジドホモマレイン（AHA）のような修飾アミノ酸類似体を「クリック - イット（click-it）」化学反応30と組み合わせて使用​​する他の方法を用いて、SGを含有する細胞が隣接細胞31よりもはるかに低い翻訳を示すことが示されている31 。しかし、この技術では、メチオニンの飢餓とそれに続く15〜30分間のパルス標識が必要です。メチオニン飢餓はさらなるストレスを構成する一方、長い標識時間（ すなわち 15〜30分）は進行中ではなく累積翻訳の測定をもたらし、また新しく合成されたタンパク質が合成部位から合成部位を最終部位に移動させる細胞。対照的に、リボプロマイシン酸化は非常に速く、グルコース飢餓によってSGを誘導するために使用されるグルコース不含培地などの任意の培地と適合する。 正規のSGは動的平衡状態にある積極的にポリソームを翻訳しています。これは、ポリソームを安定化または不安定化する薬剤でサンプルを処理することにより、SGとポリソーム23との間のバランスを変えることによって、実験的に評価することができる23 。シクロヘキシミド（または同様に作用するエメチン）は、リボソームをmRNA上に「凍結」することによって伸長をブロックし、SGを形成することができる利用可能な非ポリソームのmRNPのプールを減少させる。実験的には、これは2つの方法で使用することができます：ストレスの前にシクロヘキシミド（またはエメチン）を添加してSGの形成を防止するか、またはSGが形成された後にシクロヘキシミド（またはエメチン）予備初期化複合体はポリソーム画分にゆっくり取り込まれる。対照的に、ピューロマイシンは早期終了を引き起こし、ポリソーム分解を促進し、SGに組み立てることができる開始mRNAのプールを増加させる。実験的に、ピューロマイシン治療はSGの数を増加させるか、または閾値を低下させるこれらは、段階的なストレスまたは薬物投与量に応じて形成される。ピューロマイシンの効果を評価する際には、ピューロマイシンが薬剤の効果を増大させ、SGを提示する細胞の割合を増加させることが予想されるので、最大のレベル以下の薬剤を使用することが重要である。 /ストレスは、最初に細胞の100％においてSGを引き起こす。これは、シクロヘキシミド処置と対照的であり、SGを分解し、〜95％の細胞が最初にSGを表示して最大の可能な減少が観察され、正確に定量化されるときに最も効果的である。 このプロトコルは、哺乳動物細胞のSGを研究するための枠組みを提供する。方法は、（1）推定上のSGにおいて古典的なSG関連マーカーeIF4G、eIF3b、およびRas GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質1（G3BP1）の共局在化を評価するための免疫蛍光染色およびImageJ分析; （2）ポリアデニル化mRNAを検出するためのオリゴ（dT）蛍光in situハイブリダイゼーション（polyA FISH）; （3）ストレス誘発病巣がポリソームと動的平衡状態にあるかどうかを決定するためのシクロヘキシミドおよびピューロマイシン処置; （4）推定上のSGを含有する細胞の翻訳状態を評価するためのリボプロマイシン酸化。一緒に、これらのアッセイは、ストレス誘発病巣が真正 SGとして分類され得るか否かを決定することができる。

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;HTB-96&amp;trade;</td><td>Commonly written &quot;U2OS&quot;&lt;br/&gt; Culture at 37 &amp;deg;C under 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in 10% FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red&lt;br/&gt; Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin&lt;br/&gt; Prewarm prior drug(s) dilution</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>penicilline streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>lab tissues (kimwipes)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Autoclaved before use&lt;br/&gt; Keep sterile in the tissue culture hood</td></tr><tr><td>Sodium (meta)arsenite &amp;ge;90% (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 &amp;micro;M as a working stock</td></tr><tr><td>Vinorelbine (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>Dissolve in water to 10 mM</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Used to assess translation level (ribopuromycylation)&lt;br/&gt; -Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Emetine dihydrochloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Used in combination with puromycin to assess general translation level&lt;br/&gt; Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; -Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Wash buffer for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved&lt;br/&gt; Aliquots can be stored at -20 &amp;deg;C for several months&lt;br/&gt; Hazardous, use ventilation&lt;br/&gt; Discard in special waste</td></tr><tr><td>Methanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Prechill to -20 &amp;deg;C before use&lt;br/&gt; Discard in special waste</td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>Dilute to 5% in PBS&lt;br/&gt; Add sodium azide for storage at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Blocking solution for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Dilute to 70% with water</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/100 dilution</td></tr><tr><td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>goat anti eIF3&amp;eta; (N-20) antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&amp;eta; is also known as eIF3b&lt;br/&gt; Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconstitute in water per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Reconstitute in water as per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4&amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/2,500 dilution</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Reconstitute in water as per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4&amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 solution</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Incubate with secondary antibodies&lt;br/&gt; Stock solution 0.5 mg/mL in dH&lt;sub&gt;2&lt;sub&gt;0, protect from light&lt;br/&gt; -Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Reconstitute in water per manufacturer&amp;rsquo;s instructions, then store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>oligo-(dT)&lt;sub&gt;40x&lt;/sub&gt; probe biotinilated</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>/</td><td>Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use&lt;br/&gt; Custom order</td></tr><tr><td>hybridation box</td><td>/</td><td>/</td><td>Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom&lt;br/&gt; - prewarm the box prior use</td></tr><tr><td>20x SSC buffer</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)&lt;br/&gt; Store at RT&lt;br/&gt; Wash buffer for FISH</td></tr><tr><td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td><td>Block and probe incubation buffer for FISH</td></tr><tr><td>slide mounting media</td><td>home made</td><td>/</td><td>Mix 5 g of &amp;ldquo;cold-soluble&amp;rdquo; poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS&lt;br/&gt; Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT&lt;br/&gt; Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT&lt;br/&gt; Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet&lt;br/&gt; Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 &amp;deg;C, 1 week at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol)</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Reagent to make vinol</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>Reagent to make vinol</td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Preservative agent for blocking solution and vinol&lt;br/&gt; Make a 20% dilution in water</td></tr></tbody></table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

細胞はしばしば突然の環境変化によって挑戦される。ストレス条件に曝露された細胞内で形成される細胞質リボ核タンパク質複合体であるストレス顆粒（SG）は、細胞代謝および生存の様々な局面に関与している。 SGは、細胞シグナル伝達経路、転写後遺伝子発現およびストレス応答プログラムを調節する。これらのmRNA含有顆粒の形成は細胞翻訳に直接関連する。 SGアセンブリは阻害された翻訳開始によって誘発され、SG分解は翻訳活性化または阻害された翻訳伸長によって促進される。この関係は、SGの構成によってさらに強調される。コアSG成分は、失われた翻訳開始前複合体、mRNA、および選択されたRNA結合タンパク質（RBP）である。 SGアセンブリーの目的は、ストレス応答タンパク質の翻訳の促進を可能にし、翻訳停止したハウスキーピングmRNAを隔離することによって細胞エネルギーを保存することである。アドイティ失われた翻訳予備開始複合体のような核構成要素には、SGは他のタンパク質およびシグナル伝達分子の過剰を含む。 SG形成における欠陥は、ストレスに対する細胞の適応を損ない、細胞死を促進する可能性がある。 SGおよび類似のRNA含有顆粒は、神経変性障害および癌を含む多くのヒト疾患に関連しており、最近RNA顆粒亜型の分類および定義に関心が高まっている。このプロトコールは、哺乳動物SGを特徴づけ、定量するためのアッセイを記載する。

ストレス誘発病巣は必ずしもSGではない。 SGは、mRNA、翻訳開始因子、およびRNA結合タンパク質を含み、活性翻訳と平衡状態にある細胞質病巣として分類される。上記のプロトコルは、与えられたストレスが真正 SGを誘導するかどうかを特徴付けるためのテンプレートとして用いることができる。 SGは、タンパク質およびmRNAの両方を含む他の既知のSGマーカーと共存する。 SAおよびVRBは、G3BP1、eIF4GおよびeIF3bを含む細胞質病巣を誘導する（ 図2A ）。これらのマーカーの共局在化は、ラインスキャン分析および増大した倍率を有する単一チャネル画像を用いて確認される（ 図2A ）。さらに、これらの病巣は、ポリA FISHによって示されるようにMrnaを含み、オリゴ（dT）シグナルはG3BP1免疫蛍光シグナルと共局在する（ 図2B ）。ポリA-FISHストレスが複数のタイプの病巣を促進する可能性があるため、既知のSGマーカーと重複する。 SGは、翻訳が禁止された状態で発生します。 VRBとSAの両方は、リボプロファイリングによって実験的に評価されるように、翻訳的に抑制された状態を促進する（ 図3 ）。 真正な SGは活発に翻訳するポリソームと動的な平衡関係にあります。 SAおよびVRB誘発SGは、mRNA上のポリソームを捕捉するCHXによって溶解され、したがってポリソーム分解を停止させ、SGを予防する（ 図4A、4B ）。逆に、puroはポリソーム分解を促進し、SG形成に有利である（ 図4A、4C ）ので、より多くのSAおよびVRB SGがpuroで処理後に誘導される。 要約すると、陽性対照SAと同様に、VRBは、（1）既知のSGマーカーと共局在し、（2）タンパク質およびmRNAの両方を含む真正 SGを誘導する（ Figu<html>翻訳が抑制された細胞（ 図3 ）および（4）は能動的翻訳と動的平衡状態にある（ 図4A〜4C ）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig1.jpg" /> 図1：実験図 （ A ）示されているように、以前に24ウェルプレートに置かれたカバースリップ上に細胞をシードする。示されているように、μM単位の濃度を使用して、SAまたはVRBで60分間、行AおよびBを処理する。 60分後、薬物含有培地にCHX（最終濃度：カラム2に20μg/ mL）またはpuro（カラム4に20μg/ mLピューロマイシン）を添加する。固定および染色の前にさらに30分間インキュベーションを続ける。 （ B ）カウントするために画像化されるべき領域を示すカバースリップの図。カバースリップは5つのほぼ等しい領域に分割されています。各領域で1つの画像が撮影されます。&quot;https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig2.jpg" /> 図2：SAおよびVRBは、SGマーカーおよびポリ（A）mRNAを含む細胞質焦点を誘導する。 （ A ）G3BP1（緑色）、eIF3b（赤色）、およびeIF4G（青色）について免疫染色されたU2OS細胞。細胞を100μMSAまたは150μMVRBで60分間処理したか、または処理しなかった（対照）。拡大された領域は拡大（2倍）され、黒と白の別々のチャネルとして表示されます（下）。グラフは、領域（白線）顆粒のラインスキャン分析を示し、重複または共局在の程度を示す。スケールバーは10μmを表します。 （ B ）免疫染色と組み合わせたPolyA-FISHは、polyA mRNAをオリゴ（dT） 40プローブ（赤色）で検出し、G3BP1（緑色）は抗GHoechst色素（青色）を用いて核DNAを検出する。拡大された領域（2X）、単一チャンネル画像、およびラインスキャン分析は、共局在化を示す。スケールバー=10μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55656/55656fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig3.jpg" /> 図3：SAおよびVRB処置原因翻訳抑制。指示された処置に続いて5分間ピューロマイシンでパルス標識されたU2OS細胞の免疫蛍光。 Puromycin（緑色）、eIF3b（赤色）、およびHoechst（青色）で染色された核DNA。細胞を100μMのSAまたは150μMのVRBで60分間処理したか、または処理しなかった（対照）。スケールバー=10μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55656/55656fig3large.jpg" target="_blank">もっと大きなものを見るにはここをクリックしてください</a>この図のイオン。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig4.jpg" /> 図4：SAおよびVRBは、ポリソームと動的平衡にある細胞質叢を誘導する。 （ A ）ポリソーム/ SG関係を説明する一般的なスキーム。 （ BC ）U2OS細胞はG3BP1（緑色）、eIF3b（赤色）、および核DNAはHoechst（青色）を用いて染色した。細胞を100μMのSAまたは150μMのVRBで60分間処理したか、または（ B ）CHX（シクロヘキシミド、20μg/ mL）、（ C ）puro（Puromycin、10μg/ mL）を添加する前に処理しなかった）、または追加の30分間のインキュベーションのための添加物を含まない。数値は、代表的な実験においてSGを有する細胞のパーセンテージに対応する。スケールバー=25μm、in（BC）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55656/55656fig4large.jpg" target="_blank">もっと見るにはここをクリックしてください</a>この図のバージョン。

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Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

ストレス顆粒（SG）は、様々なストレスにさらされた細胞内で形成される非膜性の細胞質構造である。 SGは、mRNA、RNA結合タンパク質、小リボソームサブユニット、翻訳関連因子、および様々な細胞シグナル伝達タンパク質を含む。このプロトコルは、 真の SGを検出し、特徴づけ、定量化するためのいくつかの実験的アプローチを使用するワークフローを記述しています。

哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K ビュー.  Brigham and Women's Hospital. ストレス顆粒（SG）は、様々なストレスにさらされた細胞内で形成される非膜性の細胞質構造である。 SGは、mRNA、RNA結合タンパク質、小リボソームサブユニット、翻訳関連因子、および様々な細胞シグナル伝達タンパク質を含む。このプロトコルは、 真の SGを検出し、特徴づけ、定量化するためのいくつかの実験的アプローチを使用するワークフ?...

ビデオ: Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

生物学

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

免疫・感染学

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

生物工学

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

An Immunofluorescence Assay to Characterize and Quantify Mammalian Stress Granules

Source: Aulas, A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55656">Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates an assay for characterizing and quantifying mammalian stress granules, which consist of mRNAs, RNA-binding proteins (RBPs), and various other proteins.

哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量のための免疫蛍光アッセイ

1. Cell Preparation

	Add autoclaved coverslips to 12 wells of a 24-well plate, as indicated in&#160;Figure 1A; this can be done using a sterile Pasteur ...

哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

要約

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電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化

哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量のための免疫蛍光アッセイ