This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1.シリコンウェーハの金型製作注：フォトマスクは、AutoCADのソフトウェアで設計し、商業の会社によって製造されています。このデザインは異なるパターン（の三つの層が含ま<a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">補足ファイル1</a> ）。第一、第二、及び第三の層の高さは、それぞれ、約4ミクロン、10ミクロン、および50ミクロンです。シリコンウェハモールドは、ソフトリソグラフィー9、10を用いてフォトマスクから作成されました。 <ol><li>水蒸気を蒸発させ、10分間200℃でシリコンウエハを焼きます。シリコンウェハ上にコートネガフォトレジストSU-8をスピン。 注：30秒間2000rpmで第二の層を生成するために30秒間3000rpmで第一の層、SU-8 2010を生成するために30秒間5000rpmでスピンコートSU-8 3005及びSU-8 3025を生成します第三層。 </li><li>ソフトベークトンの前に塗布されたウェハ彼は、パターン転写。合わせ、マスクアライナを使用して「直接接触」モードでウエハを露光します。 注：ソフトベーク第一層のために95℃で2分、第二層のために95℃で3分間、第3層のために95°Cで15分間ウェハ。第二層、第3層のために200ミリジュール/ cm 2のための第一の層、130ミリジュール/ cm 2で100ミリジュール/ cm 2の露光量を使用します。 </li><li>露光後、ウェハをポストベークし、SU-8現像液を使用してそれを開発。 N 2ガン及びハードベーク30分間200℃でウエハを用いてウェハを乾燥させます。 注：シリコンウェーハモールドは、パターン側を上に向けて、スコッチテープを用いて直径15cmのプラスチック製ペトリ皿に固定されています。通常、我々は、複数のマイクロ流体チップを同時に製造することを可能にする同じ金型、上のいくつかの同一のチップ構造を置きます。各金型は、マイクロ流体チップを製造するために何回も再使用することができます。 </li></ol> 2.マイクロ流体チップ製造<ol><li>バランスの上にきれいな計量ボートを置き、風袋引き。重ボートにPDMSベースの50グラムを注ぎます。 </li><li> （PDMSベースから1:10の重量/重量比）計量ボートにPDMS硬化剤を5g加えます。 注：このボリュームは、金型と直径15cmのペトリ皿に基づいています。異なるサイズのペトリ皿を使用する場合、試薬の量を調整します。 </li><li>使い捨てピペットを用いてPDMSベースと硬化剤を攪拌します。計量ボートの端からスタートし、徐々に内側に移動します。小さな気泡が混合物全体に形成されるまで、数分間十分に攪拌。完全な混合は、PDMSの重合のために不可欠です。 </li><li>ペトリ皿にゆっくりと混合物を注ぎます。混合物を完全にシリコンウェハ型をカバーしなければなりません。 </li><li> PDMSの混合物からすべての気泡を除去するために10分間真空中でペトリ皿を置き。気泡が混合物の表面に残っている場合は、それらを吹き飛ばすためにピペットを使用しています。 </li><li>シリコンをインキュベート約2時間75℃のオーブンでPDMSを有するウエハー型。 </li><li>穏やかウエハ型の構造への損傷を回避すること、シリコンウェハモールドオフ重合PDMSの層を剥がします。あるいは、単一のエッジ工業用カミソリの刃を使用して、パターンの周囲に最小5 mmのマージンを有するシリコンウェハ型から直接PDMSを切断;穏やかウエハモールドオフPDMS層を剥離。 </li><li>パターン面を上にしてベンチにPDMS層を配置してください。注意深く建設損傷を避けるために、各単一チップのエッジから十分なマージンを保持し、単一エッジ工業用カミソリの刃で個々のチップを切り出しました。 </li><li>パターン面を上に向けて、チャネルの両側に入口と出口の円を通ってまっすぐに穴をパンチするパンチペン（0.75 mmのID）を使用します。 注：これらの穴は、媒体の流れのための経路を作成します。したがって、円を通過し、PDMS層を介してすべての方法をパンチすることが重要です。に確認してください穴からPDMS列を削除します。 </li><li>穴に再びパンチペンニードルを挿入することにより、すべてのパンチ穴を確認してください。針が何の詰まりがないことを示し、他の側から出てくることができていることを確認します。その後、優しくダスト粒子をきれいにテープをはがし、パターン面にテープを適用します。このステップを少なくとも3回繰り返します。滅菌を維持するために、PDMS上のスコッチテープのきれいな作品を残します。 </li><li> PDMSの反対側に、この手順を繰り返し、同様にテープの最後の部分を残します。 </li><li> 0.13〜0.17ミリメートルの厚さ24ミリメートル×30ミリメートルのカバーガラスを準備します。表面を殺菌する除塵装置でガラス上に70％エタノールを噴霧し、乾燥しました。さらに、ガラスは、オートクレーブ水で洗浄し、除塵機で乾燥させることができます。 </li><li>プラスチック板にカバーガラスとPDMSを転送します。 PDMSからスコッチテープを外し、上向きパターン側に配置します。転送時のパターン面との接触を避けてください。 </li><li&gt;プラズマ機でプラスチック板を置き。 PDMSと次のような動作パラメータを使用して親水性表面レンダリングするカバーガラスに酸素プラズマ処理を適用する：曝露を、75秒;ガスの安定化、20 CC /分;圧力、200;そして、電力、100 W. </li><li>注意深く両方の親水性表面（プラズマ処理中上向き面）接続、カバーガラス上にPDMSを置きます。 PDMSとカバーガラスの間に気泡がないことを確認します。 </li><li>少なくとも2時間75℃のオーブン中にPDMSチップをインキュベートします。 注：欠損マイクロフルイディクスは、実験中に顕微鏡上に液漏れの原因となります。したがって、わずかにピンセットで縁からPDMSを持ち上げてPDMSとカバーガラスとの間の結合を確認することが重要です。穏やかに成功した結合を示し、カバーガラスからそれを分離してはならないPDMSを持ち上げます。 </li></ol> 3.テストの準備<ol><lI&gt;チューブの準備。 <ol><li>別々に1日PDMSチップの製造前に70％エタノール溶液中で入力と出力管を水没。 </li><li>チューブを洗浄するためにオートクレーブ水で5 mLの注射器を埋めます。注射器にチューブを接続し、水でチューブを洗い流すことにより、各チューブを洗浄します。 </li><li>エタノール残留物をきれいに洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。 </li></ol></li><li>構造は一貫して無傷であることを確認するために10倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡下でPDMSチャネルを調べます。スコッチテープを使用して、顕微鏡プラットフォームにPDMSチップを安定化させます。 注：最初にデバイスを作製する場合は特に、バックアップのチップが存在することを確認するために、ステップ2で、一度に複数のチップを作ります。 </li><li>オートクレーブ処理水で5 mLシリンジを埋めます。シリンジポンプにシリンジを固定し、対応する入力及び出力管を挿入します。約10分間、チップを洗浄するために750μL/ hに洗浄速度を設定します。分岐流路に空気の泡この期間中に洗い流されるべきです。残留気泡がある場合、手動で気泡を除去するために速度を調整。 </li><li>酵母サンプル調製。 <ol><li> 3,000×gで5分間のための2つの1.5 mlのマイクロ遠心チューブへmLで調製した酵母試料（OD 600 0.6〜0.8）の転送1及び遠心分離機。 </li><li>各チューブからの上清の大部分を除去し、0.5 mLのサンプルを形成するために、残りを組み合わせます。 </li></ol></li><li>シリンジポンプを一時停止し、PDMSチップからの入力管を取り除きます。 </li><li>手動で各入力チューブに（長さ1~2センチメートル）、小さな気泡を吸引するシリンジポンプを逆転。酵母サンプルを吸引するために移動します。気泡は、サンプルの境界を示し、描かれているどのくらいのサンプルを示します。 注：注射器内に試料を吸引しないでください。 </li><li>バックPDMSチップに入力されたチューブを挿入し、750μL/ hの速度で細胞をロードするためにポンプを再始動。 </li><li> 10分間にシリンジポンプを残しますnおよび顕微鏡下での細胞のローディングの進行を調べます。成功したロード柱を一時停止の60％以上下になるトラップ細胞。 </li><li>栄養液に切り替えて、細胞培養のための400μL/ hまでの速度を調整します。 </li><li>顕微鏡のための観察位置を選択します。 注：寿命測定のために、画像は、40X対物レンズを備えた光学顕微鏡で一回15分毎に採取しました。蛍光レポーター分析のために、画像は60倍のオイル対物レンズを備えた蛍光顕微鏡で一度15分毎に採取しました。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

PDMSデバイスは、作りたてする必要があります。そうでない場合、デバイスにチューブを挿入することによって引き起こされる気泡は除去するのが困難であろう。ステップ3.4は、細胞を濃縮することによって、細胞の積載効率を向上させることが重要です。実験のスループットを増大させるために、同じPDMSチップ接続独立して動作するポンプに4〜6のモジュールは、典型的には同時に4〜6の異なる実験（異なる株又は培地組成）を実行するために使用されます。 （顕微解剖を使用）は、従来の酵母複製老化アッセイと比較して、ここに提示マイクロ流体の方法は、より少ない労力と時間がかかります。また、マイクロ流体デバイスは、細胞のサイズ、細胞周期動態、細胞形態、および様々な分子マーカーを含む、種々の細胞または分子パラメータの詳細な定量を可能にします。このマイクロ流体方法は、保持することにより、高解像度の顕微鏡との長期的な細胞追跡を実現します娘細胞としてPDMSマイクロパッドの下で母細胞が自動的にフラッシュされます。 このデバイスはHuberts らとして、同様の基本構造を有する、トラップ母細胞4にソフトPDMSマイクロパッドを使用します。彼の作品7で説明しました。装置設計・実験プロトコルの違いがいくつかあります。この装置で広いPDMSパッドは、（ 図2及び図3に示すように 、 動画1）いくつかの新生娘細胞が捕捉され、分析されることを可能にします。このような細胞を同定するために、我々は出芽せずに洗い流す娘細胞を無視して、すでに捕獲された母細胞から出芽した娘細胞を注釈付き。平均して、我々は、PDMSパッドあたり約2新鮮母細胞を得ました。 2、約三分の一が、全体の寿命のために装置内に保持された間：未知の歴史の細胞にこれら新鮮母細胞の比は約1でした。これらの細胞は、より正確な寿命測定ANを許可します母と娘細胞との間の相関関係を分析することを可能にするdは。この装置では、より深いメインチャンネルが観察がなされている2つの浅い側のチャネルに接続されています。この設計は、大きな気泡によってブロックされているサイドチャネルの可能性を減らすのに役立ちます。マイクロ流体チップ製造のために、このプロトコルは、成功率を増加させるだけでプラズマ暴露やオーブンベークを使用して、PDMSおよびカバーガラスを接着するための簡単な方法を使用します。 このプロトコルを用いて、マイクロ流体デバイスは、野生型の半数体酵母株（ すなわち、BY4741またはBY4742）のために、実験の開始時にロバストトラップPDMSパッドごとに少なくとも1個の細胞（平均3-5細胞）することが可能です。細胞の約30％は、彼らの全体の寿命全体で保持することができます。 PDMSデバイスの性能は、鉛筆列とガラスと酵母細胞のサイズとの間のギャップの大きさに依存することは注目に値します。野生型の半数体酵母株については、ギャップに適した大きさが3.5~4.5ミクロンです。この範囲外では、積載効率とセル保持率が急激に低下。したがって、はるかに大きい又は小さいセルサイズ7を有する酵母株のための新しいデバイスは、ステップ1で作られた第一の層の高さを変更することによって作製されなければなりません。 要約すると、この資料に記載されているデバイスとプロトコルだけでなく、酵母の老化の研究に適しているだけでなく、母細胞の追跡と、多くの世代のためか、寿命全体の分子マーカーのモニタリングを必要とする他の実験にも適用可能です。

出芽酵母は、研究の高齢化で強力なモデル生物です。しかしながら、酵母における従来の寿命アッセイは労働集約的でなく、低スループット1、2だけでなく顕微解剖、に依存しています。彼らの年齢としてまた、従来の顕微解剖のアプローチは、単一の母細胞の様々な細胞および分子機能の詳細図を提供していません。マイクロ流体デバイスの開発は、酵母寿命を測定するだけでなく、母細胞3、4、5、6、7、8の寿命全体の分子マーカー及び様々な細胞の表現型に従うように自動化された手順を可能にしました。酵母細胞は、マイクロ流体デバイス内にロードされた後、それらは、自動時間ラップを用いて顕微鏡下で追跡することができます電子イメージング。寿命、サイズ、蛍光レポーター、細胞形態、細胞周期動態、 等を含む、撮像処理ツールの助けを借りて、様々な細胞及び分子表現型は3を抽出することができ、6、8、その多くは、使用して得ることが困難または不可能です従来の顕微解剖方法。マイクロ流体デバイスは、数年前に3、4、6、7彼らの開発に成功以来、酵母の老化の研究で注目を集めています。いくつかのグループが、その後、以前のデザイン5のバリエーションに公開している、と多くの酵母ラボは、彼らの研究のためのマイクロ流体デバイスを採用しています。 指数関数的な成長を受けて、細胞培養では、観察のために利用可能な老人母細胞の数はminiscuですル。したがって、寿命測定のためのマイクロ流体デバイスの一般的な設計原理は、母細胞を保持し、娘細胞を除去することです。そのようなデザインは、酵母が非対称細胞分裂を受けるという事実を利用します。デバイス意志トラップ大きな母細胞内の構造と小さな娘細胞を洗い流すことを可能にします。この資料に記載のマイクロ流体チップは、トラップ母細胞へのソフトポリジメチルシロキサン（PDMS）パッド（垂直鉛筆列）（ 図1）を使用します。同様の設計のデバイスは、以前に3、4、6、7報告されています。このプロトコルは、マイクロ流体デバイスとタイムラプスイメージング実験のために最適化された単純セルローディング方式を製造するために簡単な手順を使用します。マイクロ流体デバイスの重要なパラメータの一つは、トラップ母細胞に使用さPDMSパッドの幅です。当社のDeviceは、その寿命全体で追跡することができ、新鮮な母細胞のかなりの部分を含め、各パッドの下に、より母細胞を維持することができ、より広いパッドを使用しています。細胞は、多くの世代場合や全体寿命を通して観察が必要であるために追跡する必要がある場合に寿命の測定に加えて、このプロトコルは、単一細胞タイムラプスイメージング実験のために有用です。

<table><tbody><tr><td>3&#039;&#039; &amp;lt;111&gt; silicon wafer</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 and 3000 Series</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;reg; 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Include Sylgard&amp;reg; silicone elastomer base and curing agent</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&amp;trade; punch (I.D. 0.75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002513</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&amp;reg; cover glass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch Tape</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&amp;trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD Syringe (Luer-Lock&amp;trade; Tip)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)</td><td>Component Supply Company</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Needle Assortment</td><td>Component Supply Company</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Lab Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

実験後、細胞および多くの細胞及び分子表現型の寿命が記録タイムラプス画像から抽出することができます。各細胞から抽出することができる異なる機能の数があるので、解析の最初のステップは、位置とセルの境界と追跡されている様々なイベントのタイミングを含む細胞およびイベントを、注釈を付けるようになっています出芽イベントとして。これらのアノテーションは、それが簡単に細胞の同じセットに戻ることにし、将来的に異なる特徴を分析します。そのようなImageJの11および関連のプラグインとして、画像解析ソフトを用いて、表現型のリストは、その後、細胞の記録された注釈を用いて画像データから抽出することができます。 マイクロ流体デバイスを用いて測定した表現型のいくつかの例を以下に示します。酵母の寿命表現型各捕捉された母細胞によって産生さ芽の数をカウントし、カプラン - マイヤー推定と推定することによって得ることができます。当初、マイクロ流体デバイス内に捕捉された細胞は、未知の年齢です。これらの未知の年齢由来寿命測定の偏りを最小限にするために、従来の方法は、寿命4、7を較正するために捕捉された細胞上芽瘢痕の平均数を用います。しかし、出芽痕の測定は、細胞の追加の染色を必要とし、バイアスの唯一の間接的な推定値を提供します。このプロトコルを使用して、デバイスが頻繁に既に捕獲された細胞からオフ出芽新鮮な娘細胞をトラップします。次いで、これらの細胞は母細胞に変わります。このような細胞は、私たちの下流の画像解析ソフト（ 動画1）を用いて同定することができます。これらの新鮮な母細胞は、より正確な寿命測定を提供します。 図2に示すように、新鮮母細胞の寿命曲線はコンパました年齢不詳の細胞のものと赤。この実験では、新鮮な母細胞の平均寿命は、（中央値寿命の差を約2世代）やや長かったです。 芽の数、そのような二つの連続出芽イベント間の時間間隔のような他の興味深い表現型に加えて、 図3に示すように、撮像データ3、7、8から抽出することができます。細胞は、いくつかの低速の初期buddings次速く発芽の時期に入りました。出芽は、これらの熟成細胞の不健康な状態を示し、その寿命の終わりに向かって劇的に遅く。細胞周期ダイナミクス若いと古い細胞の細胞状態に関する非常に有益な情報が含まれており、テロメラーゼ変異体12を特徴づけるために、例えば、使用されてきました。重要なことは、このデバイスは、することができ老化過程のドライバとすることができる分子マーカーの追跡を可能にする、寿命（ 図4）を通して蛍光シグナルを測定するために使用されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig1.jpg" /> 図1： マイクロ流体デバイスの設計の概略図。デバイスは、並列に動作することができる6つの独立した機能モジュールから構成されています。各モジュールは、二つのサイドチャネルに接続された1つのメインチャンネルで構成されています。各サイドチャネルは113の鉛筆の列があります。追加のブリッジは、二つのサイドチャネルを有する主要チャネルを接続する途中に添加されます。小さな娘細胞が流れによって洗い流されながら母細胞は、鉛筆の列の下に捕捉されます。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2： 新鮮な母細胞は、未知の歴史を持つ細胞よりも長く住んでいます。 SDメディア、30度で未知の歴史（実験開始から捕獲された細胞）の細胞に対して新鮮な母細胞の複製寿命。平均して、新鮮な母細胞は、約2世代に長く住んでいます。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig3.jpg" /> 図3： 高齢細胞として出芽間隔の長さが変化します。 buddingsの間の時間枠として測定新進の間隔が色分けされ、細胞は、その複製寿命によって命じられたし、新鮮な母細胞は9月でした未知の歴史の細胞からarated。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig4.jpg" /> 図4： マイクロ流体デバイスを用いた熱ショック因子1（HSF1）の活性を測定します。 HSF1活性レポーター13上流のHSEと不自由CYC1プロモーターに融合した緑色蛍光タンパク質（GFP）で構成されています。蛍光画像は30分ごとに採取しました。 GFP強度は次に、カスタマイズMATLABコード14を用いて定量しました。各単セルのデータポイントが接続され、着色された線で示されています。この実験では、株を一晩30℃で2％グルコース（重量/容量）でSD培地中で増殖させました。それは、その後の回復のために同じ培地で希釈しました。その後、0.05％グルコース（重量/容量）でSD培地は、蛍光測定中にマイクロ流体チップで細胞を成長させるために使用されました。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55412/55412mov1.jpg" /> 映画1： 新鮮な母細胞の例は、全体の寿命のための装置内に捕捉されています。映画は、トラップされた細胞から生まれた新鮮な母細胞を示しています。映画の冒頭に赤い矢印が新鮮母細胞とその最初の出芽の位置をマークします。この母細胞は、その全体の寿命のためのマイクロ流体デバイスの中に閉じ込められました。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412movie1.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには、右クリックします。）</a>

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Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

この記事では、マイクロ流体チップの生産と寿命と、単一の酵母細胞の細胞表現型を測定するためのマイクロ流体実験のセットアップのために最適化されたプロトコルを提示します。

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.6K ビュー.  Peking University. この記事では、マイクロ流体チップの生産と寿命と、単一の酵母細胞の細胞表現型を測定するためのマイクロ流体実験のセットアップのために最適化されたプロトコルを提示します。 

ビデオ: Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

生物工学

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

生物学

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

遺伝学

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.