This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. Silizium-Wafer-Form Fabrication HINWEIS: Die Photomaske mit AutoCAD-Software und hergestellt von einem kommerziellen Unternehmen entwickelt wird. Dieser Entwurf enthält drei Schichten von verschiedenen Mustern ( <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Zusatzdatei 1</a> ). Die Höhen der ersten, zweiten und dritten Schichten sind etwa 4 um, 10 um und 50 um betragen. Die Siliziumwafer Form wurde von der Photomaske unter Verwendung von Softlithographie 9, 10 geschaffen. <ol><li> Bake einen Siliziumwafer bei 200 ° C für 10 min des Wasserdampf zu verdampfen. Schleuderbeschichtungs negativer Photoresist SU-8 auf den Siliziumwafer. HINWEIS: Schleuderbeschichtung SU-8 3005 bei 5000 rpm für 30 s, die erste Schicht zu erzeugen, SU-8 2010, um 3.000 Umdrehungen pro Minute für 30 s, die zweite Schicht und SU-8 3025 bei 2000 Umdrehungen pro Minute zu erzeugen, für 30 s die erzeugen dritte Schicht. </li><li> Soft-Backen des beschichteten Wafers vor ter Musterübertragung. Richten und den Wafer in „direkten Kontakt“ -Modus mit einer Mask Aligner aus. HINWEIS: Soft-bake des Wafer für 2 min bei 95 ° C für die erste Schicht, 3 min bei 95 ° C für die zweite Schicht, und 15 min bei 95 ° C für die dritte Schicht. Verwenden , um die Belichtungsdosis bei 100 mJ / cm 2 für die erste Schicht, 130 mJ / cm 2 für die zweite Schicht, und 200 mJ / cm 2 für die dritte Schicht. </li><li> Nach der Belichtung Nacherwärmung des Wafers und entwickelt es SU-8-Entwickler verwendet. Trocknen der Wafer ein N 2 -Pistole und hart bake der Wafer bei 200 ° C für 30 min verwendet wird . HINWEIS: Der Siliziumwafer Form ist an einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale aus Kunststoff Scotch Klebeband, mit dem Muster Seite nach oben weist. Normalerweise stellen wir mehrere identische Chipstrukturen auf der gleichen Form, die mehrere Mikrofluidik-Chips ermöglicht, zur gleichen Zeit hergestellt werden. Jede Form kann wiederverwendet werden viele Male Mikrofluidik-Chips herzustellen. </li></ol> 2. MikrofluidikChip-Herstellung <ol><li> Ein sauberes Wiegeschiffchen auf einer Waage und tariert. Gießen Sie 50 g PDMS Base in das Boot wiegen. </li><li> 5 g des PDMS Härtungsmittels zu dem Wiege Boot (w / w-Verhältnis von 1:10 bis das PDMS Base). Hinweis: Dieses Volumen wird basierend auf einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale mit der Form. Justieren der Menge an Reagenz, wenn eine Petrischale mit einer anderen Größe verwendet wird. </li><li> Rühre das PDMS Base und des Härtungsmittels mit einer Einwegpipette. Beginnen vom Rand des Wägeschiffchen und langsam nach innen bewegen. Rühren Sie gründlich mehrere Minuten, bis kleine Blasen in der Mischung zu bilden; Durchmischung ist für PDMS Polymerisation von wesentlicher Bedeutung. </li><li> Die Mischung langsam in die Petrischale; Die Mischung muss die Siliziumwafer Form vollständig bedecken. </li><li> Platzieren Sie die Petrischale in einem Vakuum für 10 min alle Luftblasen aus der PDMS-Gemisch zu entfernen. Wenn Blasen auf der Oberfläche des Gemisches bleiben, verwenden Sie eine Pipette sie auszublasen. </li><li> Inkubieren des SiliziumsWafer-Form mit PDMS in einem Ofen bei 75 ° C für ca. 2 h. </li><li> abschälen sanft die Schicht aus polymerisiertem PDMS aus der Siliziumwafer Form, eine Beschädigung der Konstruktion der Waferform zu vermeiden. Alternativ dazu schneiden die PDMS direkt aus dem Siliziumwafer Form mit einer mindestens 5 mm-Rand um das Muster einer einzigen Kante industriellen Rasierklinge; leicht schälen die PDMS-Schicht von der Waferform. </li><li> Platzieren Sie die PDMS-Schicht auf der Bank mit der Musterseite nach oben weist. Sorgfältig schnitt den einzelnen Chip mit einer einzigen Kante industrieller Rasierklinge aus, eine ausreichende Marge von der Kante eines jeden einzelnen Chips Haltekonstruktion Schäden zu vermeiden. </li><li> Mit dem Muster Seite nach oben, mit einem Stanzstift (0,75 mm ID) Löcher stanzen gerade nach unten durch die Einlass- und Auslass-Kreise auf jeder Seite der Kanäle. HINWEIS: Diese Löcher den Weg für den Fluss des Mediums erstellen. Daher ist es entscheidend, durch die Kreise zu gehen und den ganzen Weg durch die PDMS-Schicht stanzen. Stellen Sie sicher, dassdie PDMS Spalten aus dem Loch entfernen. </li><li> Prüfen jedes gestanzte Loch durch den Stempel Pen-Nadel wieder Einsetzen in das Loch. Achten Sie darauf, die Nadel von der anderen Seite herauskommen kann, was darauf hinweist, dass es keine Blockade. Klebeband am Musteroberfläche, dann vorsichtig abzuschälen das Band Staubpartikel zu reinigen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal. Lassen Sie ein sauberes Stück Klebeband auf dem PDMS Sterilisation zu pflegen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des PDMS und lassen auf als auch das letzte Stück Klebeband. </li><li> Vorbereiten einer 24 mm x 30 mm Deckglas mit einer Dicke von 0,13-0,17 mm. Spray 70% igem Ethanol auf dem Glas und trocken mit Staubentferner die Oberfläche zu sterilisieren; Zusätzlich kann das Glas mit autoklaviertem Wasser gewaschen und mit Staubentferner gewaschen werden. </li><li> Überträgt das Abdeckglas und PDMS auf eine Kunststoffplatte. Entfernen Sie das Klebeband von dem PDMS und legen Sie das Muster nach oben. Vermeiden Sie jeden Kontakt mit der Musteroberfläche während der Übertragung. </li><li&gt; Platzieren Sie die Kunststoffplatte in der Plasmamaschine. Anwenden Sauerstoffplasmabehandlung zu dem PDMS, und das Deckglases, die Oberflächen hydrophil mit den folgenden Betriebsparametern zu machen: Belichtung, 75 s; Gasstabilisierung, 20 cc / min; Druck, 200; und Leistung, 100 W. </li><li> Legen Sie das PDMS auf das Deckglas, sowohl hydrophile Oberflächen (die Oberflächen, die während der Plasmabehandlung konfrontiert up) verbindet. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen zwischen dem PDMS und dem Deckglas. </li><li> Inkubieren des PDMS-Chip in einem Ofen bei 75 ° C für mindestens 2 h. HINWEIS: Mangelhafte Mikrofluidik während des Experiments Flüssigkeitsleckage auf das Mikroskop führen kann. Daher ist es wichtig, durch leichte die Bindung zwischen dem PDMS und dem Deckglas zu überprüfen, die PDMS von den Kanten mit einer Pinzette angehoben wird. Anheben sanft die PDMS sollte es aus dem Deckglas nicht trennen, eine erfolgreiche Bindung anzeigt. </li></ol> 3. Vorbereitung für das Experiment <ol><li&gt; Rohrvorbereitung. <ol><li> Unterzutauchen die Eingangs- und Ausgangsrohre in 70% Ethanollösung separat 1 Tag vor dem PDMS-Chip Zubereitung. </li><li> Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser, um die Rohre zu waschen. Wäscht jedes Rohr durch an der Spritze das Rohr verstopfen und das Rohr mit Wasser zu spülen. </li><li> Wiederholen des Waschschritt mindestens 3 mal Ethanol Rückstand zu reinigen. </li></ol></li><li> Untersuchen Sie die PDMS-Kanäle unter einem optischen Mikroskop mit einem 10X-Objektiv, um sicherzustellen, ist die Struktur konsistent und intakt. Stabilisierung des PDMS-Chips auf dem Mikroskopplattform unter Verwendung eines Scotch-Band. HINWEIS: Stellen Sie mehrere Chips auf einmal in Schritt 2, um sicherzustellen, dass es Backup-Chips, vor allem, wenn das Gerät zum ersten Mal machen. </li><li> Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser. Sichern der Spritze an eine Spritzenpumpe und legen die entsprechenden Eingangs- und Ausgangsröhren. Stellen Sie die Waschgeschwindigkeit auf 750 &amp; mgr; l / h, den Chip für etwa 10 Minuten zu spülen. Die Luftblasen in den Zweigkanälensollte in dieser Zeit weggespült werden; wenn verbleibenden Blasen sind, stellen Sie manuell die Geschwindigkeit der Blasen zu beseitigen. </li><li> Hefe-Probenvorbereitung. <ol><li> 1 ml der vorbereiteten Hefeprobe (OD 600 0,6-0,8) in zwei 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 3.000 x g. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit des Überstandes aus jedem Röhrchen und den Rest kombinieren, um eine 0,5 ml Probe zu bilden. </li></ol></li><li> Pause, um die Spritzenpumpe und entfernen die Eingangsrohre von dem PDMS-Chip. </li><li> Manuell Umkehren der Spritzenpumpe eine kleine Luftblase (1 bis 2 cm in der Länge) in jedes Eingangsrohr zu saugen. Bewegen auf in der Hefe Probe zu saugen; die Luftblase wird die Probe Grenze zeigen, und zeigt, wie viel Probe gezogen wurde. HINWEIS: Vermeiden Sie die Probe in die Spritze zu saugen. </li><li> Setzen Sie das Eingangsrohr zurück in den PDMS-Chip und starten die Pumpe die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 750 &amp; mgr; l / h zu laden. </li><li> Lassen Sie die Spritzenpumpe über 10 min dern und untersucht die Zellenbelastung Progression unter dem Mikroskop; ein erfolgreicher Laden wird Trap-Zellen, die unter mehr als 60% der Säule suspendieren. </li><li> Wechseln Sie zu Ernährung Lösung und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 400 &amp; mgr; l / h für die Zellkultur. </li><li> Wählen Beobachtungspositionen für das Mikroskop. HINWEIS: Für Lebensdauer Messungen wurden Bilder einmal mit einem 40x-Objektiv alle 15 min durch ein optisches Mikroskop aufgenommen. Für die fluoreszierende Reporter Analyse wurden Bilder, die einmal mit einem 60X Öl Ziel alle 15 min durch ein Fluoreszenzmikroskop entnommen. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Das PDMS-Gerät muss frisch hergestellt werden. Andernfalls werden die Luftblasen, die durch Rohre in die Vorrichtung eingefügt schwer zu entfernen. Schritt 3.4 ist wichtig, um die Zellbeladungseffizienz zu verbessern, indem die Zellen konzentriert. Um den Durchsatz des Experimentes zu erhöhen, 4 bis 6-Module auf dem gleichen Chip verbunden PDMS unabhängig arbeitende Pumpen typischerweise verwendet werden, durchzuführen 4 bis 6 verschiedene Experimente (verschiedene Stämme oder Medienzusammensetzungen) gleichzeitig. Im Vergleich zu der herkömmlichen Hefe replikativen Alterungstest (die Mikrodissektion verwendet), die mikrofluidische hier vorgestellte Verfahren ist weniger arbeitsintensiv und zeitraubend. Darüber hinaus ermöglicht die Mikrofluidik-Vorrichtung für die detaillierte Quantifizierung der verschiedenen zellulären oder molekularer Parameter, einschließlich der Zellgröße, Zellzyklus-Dynamik, die Zellmorphologie und verschiedenen molekularen Marker. Dieses Mikrofluidik-Verfahren erreicht Langzeit Zelle mit dem hochauflösenden Mikroskopie Nachführung durch HaltMutterzellen unter PDMS Mikro-Pads als Tochterzellen werden automatisch gespült. Dieses Gerät verwendet weiche PDMS Mikro-Pads zu stoppen Mutterzellen 4 mit der Grundstruktur ähnlich, wie Huberts et al. in seinem Werk 7 beschrieben. Es gibt eine Reihe von Unterschieden in dem Gerätedesign und experimentelle Protokollen. Der breitere PDMS - Pad in diesem Gerät kann einige newborn Tochterzellen aufgefangen und analysiert (Figuren 2 und 3, Film 1) werden. Um solche Zellen zu identifizieren, wir kommentierten geknospt die Tochterzellen aus bereits gefangen Mutterzellen, die Tochterzellen zu ignorieren, die ohne Knospung weggespült. Im Durchschnitt, wir haben etwa 2 frische Mutterzellen pro PDMS-Pad. Das Verhältnis dieser frischen Mutterzellen zu den Zellen unbekannter Geschichte war etwa 1: 2, von denen etwa ein Drittel wurden in der Einrichtung für die gesamte Lebensdauer gehalten. Diese Zellen ermöglichen eine genauere Lebensdauer Messung eind macht es möglich, Korrelationen zwischen Mutter und Tochterzellen zu analysieren. In dieser Vorrichtung wird ein tieferer Hauptkanal an zwei flacheren Seitenkanälen verbunden, in dem die Beobachtungen gemacht werden; dieser Entwurf hilft, die Möglichkeit der Seitenkanäle zu reduzieren, indem große Luftblasen blockiert. Für mikrofluidischen Chip-Produktion verwendet dieses Protokoll auch ein einfaches Verfahren die PDMS und Deckglas zu binden, nur Plasma-Exposition mit und Backen im Ofen, die die Erfolgsquote erhöht. Bei diesem Protokoll ist die mikrofluidische Vorrichtung zu robust Falle mindestens eine Zelle (3-5 Zellen im Mittel) pro Lage PDMS - Pad zu Beginn des Experiments für den Wildtyp - haploide Hefestämme (dh BY4741 oder BY4742). Etwa 30% der Zellen in ihrer ganzen Lebensdauer beibehalten werden. Es ist erwähnenswert, dass die Leistung des PDMS Geräts auf dem Spaltmaß hängt zwischen den pensile Säulen und dem Glas und der Größe der Hefezellen. Für haploide Hefestämme Wildtyp, diegeeignete Größe für den Spalt ist 3,5-4,5 um auf. Außerhalb dieses Bereichs stark die Ladeeffizienz und Zellrückhalterate Rückgang. So wird neue Vorrichtungen für Hefestämme mit vielen größeren oder kleineren Zellgrößen 7 muss in Schritt 1 hergestellt durch Modifizierung der Höhe der ersten Schicht hergestellt werden. Zusammengefasst ist das Gerät und das Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird, nicht nur für Hefe-Aging-Studien geeignet ist aber auch für andere Experimente, die die Verfolgung von Mutterzellen und die Überwachung von molekularen Markern für viele Generationen oder die ganze Lebensdauer erfordern.

Bäckerhefe ist ein leistungsfähiger Modellorganismus in der Altersforschung. Jedoch beruht eine herkömmliche Assay Lebensdauer in Hefe auf Mikrodissektion, was nicht nur arbeitsintensiv , sondern auch geringen Durchsatz gleich 1, 2. Darüber hinaus ist die traditionelle microdissection Ansatz bieten nicht eine detaillierte Ansicht der verschiedenen zellulären und molekularen Merkmalen in den einzelnen Mutterzellen, während sie altern. Die Entwicklung von Mikrofluidik - Vorrichtungen ist ein automatisiertes Verfahren zur Messung der Lebensdauer Hefe sowie zu folgen molekularen Marker und verschiedene zelluläre Phänotypen in der gesamten Lebensdauer der Mutterzellen 3, 4, 5, 6, 7, 8 freigegeben. Nach Hefezellen in eine Mikrofluidik-Vorrichtung geladen werden, können sie unter einem Mikroskop automatische zeit Runden unter Verwendung nachgeführte Bildgebung. Mit Hilfe von Bildverarbeitungswerkzeugen können verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen 3 extrahiert werden, 6, 8, einschließlich der Lebensdauer, Größe, Fluoreszenz - Reporter, Zellmorphologie, Zellzyklus - Dynamik usw., von denen viele schwer oder unmöglich zu erhalten ist unter Verwendung von die traditionellen Mikrodissektionsverfahren. Mikrofluidik - Vorrichtungen haben Prominenz in Hefe - Aging Forschung seit ihrer erfolgreichen Entwicklung gewonnen vor einigen Jahren 3, 4, 6, 7. Mehrere Gruppen haben auf Variationen der früheren Entwürfen 5 und viele Hefe - Labors haben mikrofluidischen Vorrichtungen anschließend veröffentlicht für ihre Studie beschäftigt. In einer Zellkultur exponentielles Wachstum erfährt, die Zahl der im Alter von Mutterzellen, die für die Beobachtung verfügbar sind, ist miniscule. Daher ist das allgemeine Konstruktionsprinzip der Mikrofluidik-Vorrichtung für Lebensdauer-Messungen Mutterzellen zu binden und Tochterzellen zu entfernen. Eine solche Konstruktionen machen Gebrauch von der Tatsache, dass Hefe Teilung asymmetrische Zelle unterzogen wird. Die Strukturen in dem Gerät Fall größere Mutterzellen und ermöglichen kleinere Tochterzellen weggespült werden. Der Mikrofluidik - Chip in diesem Artikel beschrieben ist, verwendet ein weiches Polydimethylsiloxan (PDMS) pad (vertikale pensile Spalten) abzufangen Mutterzellen (Abbildung 1). Geräte ähnlicher Bauart wurden bereits 3, 4, berichtet 6, 7. Dieses Protokoll verwendet ein einfacheres Verfahren mikrofluidischen Vorrichtungen herzustellen und eine einfache zellLadeVerfahren, die für die Zeitraffer-Imaging Experimente optimiert ist. Einer der wichtigsten Parameter in der Mikrofluidik-Vorrichtung ist die Breite der zu stoppen Mutterzellen verwendet PDMS-Pads. unsere device verwendet breitere Pads, die mehr Mutterzellen unter jedem Pad halten können, darunter ein großer Anteil der frischen Mutterzellen, die während ihrer gesamten Lebensdauer verfolgt werden können. Neben Lebensdauer Messungen ist dieses Protokoll für einzelne Zelle Zeitraffer-Imaging Experimente nützlich, wenn die Zellen während der gesamten Lebensdauer für viele Generationen oder wenn eine Beobachtung verfolgt werden müssen, ist notwendig.

<table><tbody><tr><td>3&#039;&#039; &amp;lt;111&gt; silicon wafer</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 and 3000 Series</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;reg; 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Include Sylgard&amp;reg; silicone elastomer base and curing agent</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&amp;trade; punch (I.D. 0.75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002513</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&amp;reg; cover glass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch Tape</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&amp;trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD Syringe (Luer-Lock&amp;trade; Tip)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)</td><td>Component Supply Company</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Needle Assortment</td><td>Component Supply Company</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Lab Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Nach den Experimenten können die Lebensdauer der Zellen und viele zelluläre und molekulare Phänotypen aus den aufgezeichneten Zeitraffer-Bilder extrahiert werden. Da es eine Reihe von verschiedenen Funktionen, die von jeder Zelle entnommen werden kann, ist der erste Schritt der Analyse der Zellen und Ereignisse mit Anmerkungen zu versehen, einschließlich der Positionen und Grenzen der Zellen und dem Timing der verschiedenen Ereignisse, die verfolgt werden, wie beispiels wie die angehenden Ereignisse. Diese Annotationen werden es einfacher, auf den gleichen Satz von Zellen zurückzukehren und verschiedene Funktionen in der Zukunft zu analysieren. Unter Verwendung der aufgezeichneten Annotationen der Zellen unter Verwendung von Bildanalysesoftware, wie ImageJ 11 und dem zugehörigen Plugins kann eine Liste von Phänotypen dann aus den Bilddaten extrahiert werden. Im Folgenden sind einige Beispiele für mit der Mikrofluidik-Vorrichtung gemessen Phänotypen. Die Lebensdauer Phänotyp der Hefekann durch Zählen die Anzahl von Knospen von jeder eingeschlossenen Mutterzelle und die Schätzung mit der Kaplan-Meier-Schätzer erzeugt, erhalten werden. Die Zellen zunächst in den mikrofluidischen Vorrichtungen gefangen sind von unbekanntem Alter. Um die Vorspannung der Lebensdauer Messungen stammen von diesem unbekannten Alter, frühere Verfahren verwendet , um die durchschnittliche Anzahl von bud Narben auf den eingeschlossenen Zellen zu minimieren , die Lebensdauer 4, 7 zu kalibrieren. Jedoch erfordern bud scar Messungen die zusätzliche Färbung von Zellen und liefern nur eine indirekte Abschätzung der Vorspannung. Unter Verwendung dieses Protokolls einfängt das Gerät häufig frische Tochterzellen, die aus bereits gefangen Zellen geknospt ab. Diese Zellen werden dann wiederum in Mutterzellen. Solche Zellen können unter Verwendung unserer Downstream - Bildanalyse - Software (Movie 1) identifiziert werden. Diese frischen Mutterzellen eine genauere Lebensdauer Messung. Wie in Abbildung 2 gezeigt, waren die Lebensdauer Kurven von frischen Mutterzellen compadiejenigen der Zellen unbekannten Alters rot mit. In diesem Experiment war die durchschnittliche Lebensdauer der frischen Mutterzellen etwas länger (etwa 2 Generationen Unterschied in der medianen Lebensdauer). Zusätzlich zu der Anzahl von Knospen, anderen interessanten Phänotypen, wie beispielsweise das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ereignissen Knospung, wie in Figur 3 dargestellt ist , kann aus den Bilddaten 3, 7, 8 , extrahiert werden. Die Zellen in eine Phase von schnellen Austrieb folgenden ein paar langsameren Anfängen buddings. Die angehende verlangsamte dramatisch gegen Ende ihrer Lebensdauer, den ungesunden Zustand dieser im Alter von Zellen anzeigt. Die Zellzyklusdynamik enthält sehr nützliche Informationen über den zellulären Zustand der jungen und alten Zellen und verwendet worden, beispielsweise Telomerase - Mutanten 12 zu charakterisieren. Wichtig ist, dass dieses Gerät seinverwendete zum Messen von Fluoreszenzsignalen während der gesamten Lebensspanne (Abbildung 4), so dass für die Verfolgung von molekularen Markern , die der Fahrer des Alterungsprozesses sein können. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig1.jpg" /> Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der Konstruktion der Mikrofluidik - Vorrichtung. Das Gerät besteht aus 6 unabhängigen Funktionsmodulen, die parallel arbeiten können. Jedes Modul besteht aus einem Hauptkanal verbunden ist, um zwei Seitenkanäle vorgenommen. Jeder Seitenkanal hat pensile 113 Spalten. Eine weitere Brücke ist in der Mitte hinzugefügt, um den Hauptkanal mit den beiden Seitenkanälen zu verbinden. Mutter-Zellen werden unter den pensile Säulen, während die kleineren Tochterzellen durch die Strömung weggespült werden gefangen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2: Frische Mutterzellen länger leben als Zellen mit unbekannter Geschichte. Die replikative Lebensdauer von frischen Mutterzellen im Vergleich zu Zellen unbekannter Geschichte in SD-Medien, 30 Grade (Zellen vom Beginn des Experiments gefangen). Im Durchschnitt leben frische Mutterzellen etwa 2 Generationen länger. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Länge der gealterten Intervallen ändert als Zell Knospung. Angehende Abständen gemessen als Zeitrahmen zwischen buddings wurden farbcodiert, wurden die Zellen durch ihre Replikation Lebensdauer bestellt und frische Mutterzellen waren Septemberarated aus Zellen unbekannten Geschichte. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55412/55412fig4.jpg" /> Abbildung 4: Messung der Aktivität von Hitzeschockfaktor 1 (HSF1) einer Mikrofluidik - Vorrichtung verwendet. Die HSF1-Aktivität Reporter werden durch ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) fusionierte mit einem verkrüppelten CYC1 Promotor mit HSE Upstream 13 aufgebaut. Fluoreszenzbilder wurden alle 30 Minuten genommen. GFP Intensität wurde dann quantifiziert eine angepasste MATLAB - Code 14 verwendet wird . Die Datenpunkte für jede einzelne Zelle verbunden sind, und mit einer farbigen Linie angedeutet. In diesem Experiment wurde der Stamm in SD-Medium mit 2% Glucose (wt / vol) bei 30 ° C über Nacht wachsen gelassen; es wurde dann mit dem gleichen Medium für die Wiederherstellung verdünnt. Nachher,SD-Medium mit 0,05% Glucose (G / V) wurde verwendet, um Zellen in dem mikrofluidischen Chip während der Fluoreszenzmessung zu wachsen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55412/55412mov1.jpg" /> Film 1: Ein Beispiel für frische Mutterzellen innerhalb der Einrichtung für die gesamte Lebensdauer gefangen zu sein. Der Film zeigt eine frische Mutterzelle von einer gefangenen Zelle geboren. Der rote Pfeil am Anfang des Films markiert die Position der frischen Mutterzelle und ihren ersten Austrieb. Diese Mutterzelle wurde in der Mikrofluidik-Vorrichtung für seine gesamte Lebensdauer gefangen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412movie1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412movie1.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/55412movie1.mov" target="_blank">.)</a>

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Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Biology

7.6K Aufrufe.  Peking University.  Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen. 

Serie: Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Forschung

Biotechnik

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Biologie

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

Ein Suppressor-Bildschirm zur Charakterisierung genetischer Links, die die chronologische Lebensdauer in Saccharomyces cerevisiae regulieren

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

Genetik

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...