この研究は、自然科学とカナダの工学研究会（NSERC、MPに401848から2011）によってサポートされていました。 MPは、 フォンデRECHERCHEデュケベックサンテ（FRQ-S）からキャリア賞を受け取りました。 LEはFRQ-S（FRQ-S 14D 29441）から博士交わりの受信者でした。私たちは、技術支援のためにマリージョゼWallmanに感謝します。

著者は、開示することは何もありません。

この記事では、我々は、ヒト以外の霊長類の経心臓灌流およびEMのサンプル検査に適した事前埋め込み免疫組織化学のための信頼性の高いプロトコルを提示します。例えばCEMOVISような典型的なクライオEMは、脳の微細構造の良好な保存を提供するが、それはまた、免疫組織化学12の使用を制限します。クライオ置換およびTokuyaso技術を含む他の技術は、免疫組織化学を埋め込むポストできるように、これらの技術は、デュー・プロセス中に必要な追加のデバイスに高価であり、時間がかかり、12、14、15のスキルに挑戦することができます。また、効率的に凍結固定法を使用するために、試料は（大気圧29で28と10μmの凍結高圧を使用する場合、厚さ200ミクロンまで）は比較的小さくなければなりません。理想的には、良い取得します霊長類の脳組織の低温定着を用いた結果は、試料は、関心領域の正確な位置を見つけることに問題を引き起こし、生検から採取しなければなりません。この問題は、定位座標を使用することによって回避されなければなりません。アクロレイン及び上記提案されたプレ埋め込み技術による化学固定が容易、低コスト、時間効率、および霊長類の脳組織の試料調製のための信頼できる方法およびEMのための免疫標識を提供します。これらの手順に従うことで、一つはほとんどのタンパク質の免疫標識を可能にするために、抗原と一緒によく保存された超微細構造を得ることができます。しかし、EMのための化学的固定はまた、その欠点を持っています。例えばアクロレイン等の固定溶液は、脳組織の形態学的な細部を保持しながら、まず、いくつかの形態学的変化は、化学固定プロセス中に発生しCEMOVISまたはクライオ置換技術を用いて得られるものに比べて結果を変えることが可能です。第二に、固定工程と大幅にサイズを変更し、凍結固定した細胞21、30と比較して形状の組織の収縮を引き起こし、細胞外液のほとんどを除去し、一緒に細胞成分を圧搾埋め込み樹脂に必要なその後の脱水。それにもかかわらず、アルデヒド固定は、世界中の多くの研究室で正常に使用されており、広く前述の懸念21、30、31、32にもかかわらず、神経細胞とグリア細胞の超微細構造の特徴を研究するための信頼性の高い方法として文献に受け入れられています。 上述の方法と比較して、メタクリル樹脂中に包埋凍結固定したサンプルのために必要とされるpostembedding免疫組織化学は、あまり敏感であり、中枢神経系の抗原の検出が制限されている14 </sup&gt; 33。しかし、アルデヒド固定はまた、抗原性の点で限界があります。したがって、EMの準備を開始する前に、LMレベルで所与の化学固定プロトコルの抗体の特異性を試験することが重要です。アクロレイン固定脳組織の免疫組織化学の品質も以前に化学固定により作成された強力なアルデヒド結合を切断によって異なります。このステップは、（ - 3.5手順3.3を参照）、水素化ホウ素ナトリウムを用いて免疫組織化学の前のセクションをインキュベートすることによって達成することができます。このステップを省略すると、間違いなく次善の免疫染色34につながります。 4％PFA中で希釈 - （2％0.1）使用される抗体は、アクロレインで固定した脳切片上の最適な染色を与えていない場合、代わりにグルタルアルデヒドを使用することが可能です。これは、十分に多くの抗体のための抗原性を維持しながら、脳の超微細構造をよく保存して、脳組織を提供することが証明されました最小限の変更20、21、35、36、37との長期保存に適し。大幅に溶液のpHを上昇させることによってのみPFAとEMに適した比較的良好な固定及び抗原性を達成することも可能であるが、灌流の間に、複数の固定の組み合わせは、より良い結果34を提供している、との研究では、一般的にだけではそのPFA固定をサポートEM検査38、39にはあまり保存された組織を作ります。しかし、いくつかのまれなケースでは、抗原性を維持することは非常に困難であり、単独でPFA固定は、EM検査のための唯一の実行可能な選択肢のまま。 このプロトコルには多くのステップは、最適な結果を得るために慎重に従ってください。例えば、4％PFA溶液の調製PFA粉末を溶解させるために45℃以上の温度で行われ、温度が60℃未満のままであることが必須であるしなければなりません。そうでなければ、PFA溶液は、ホルムアルデヒドと異なる組織を固定し、著しく組織品質40、41を変更することができ、酸性溶液を形成ギ酸、に解重合します。低酸素症および高炭酸ガスが組織31の品質と完全性を変えることができ、脳への不可逆的な生理的変化を生成しますので、また、振動板が切断された後、灌流段階を迅速に行うことが重要です。欠陥の固定は、脳組織の保存に有害であると恒久的な形質膜、ミトコンドリアやシナプスのような組織の超微細構造を変えることができます。このように、溶液調製及び灌流のステップは、注意して実施する必要があります。成功したEMのサンプルpreparationはまた、高度に四酸化オスミウムで良いポスト固定に依存します。実際に、四酸化オスミウムとの直接灌流EM観察21、39のために合理的に無傷の組織を産生するように記載されています。しかし、細胞外スペースの量およびオスミウム灌流およびアルデヒド灌流動物間の形質膜の外観の面で多くの違いが注目されています。さらに、オスミウム灌流後の組織の黒化や硬化は、より良い組織保存および容易な操作のための21のアルデヒド灌流を好む、頭蓋骨から脳の除去、その後の解剖、および白と灰白質の区別がより困難になります。単独のアルデヒド固定は、このように表示するために失敗し、組織の整合性を変え、細胞外空間に見られるべきであるタイトジャンクションの印象を与える細胞外空間を、減らすために表示されますでもクエン酸鉛染色42後の許容可能な電子顕微鏡写真。慎重に-しかし、四酸化オスミウムでpostfixationは、このように明確osmification工程を行うことの重要性を正当化する、それらの同定42のために必要である組織要素との間の最も明確な分離を可能にすることによって、この状況を逆転させ（4.2 4.1ステップ）。 これらのステップが実施される条件および濃度は、特に霊長類の脳切片上の沈殿物としてDABを用いたプレ埋め込み免疫組織化学のために、我々の研究室で試験されています。スキル挑戦が、二重免疫組織化学は、金粒子43と埋め込み後、免疫組織化学によって可能です。それが出て原形質膜とを概説するので電子密度DABは、ここで提案されている免疫ペルオキシダーゼジアミノベンジジン技術はEMレベルで識別することは非常に容易になった後に得られた沈殿物ER細胞小器官の表面、依然としてそのようなミトコンドリアやシナプスの連絡先などのサブ細胞成分の同定を可能にします。本技術は、単一の免疫組織化学のために習得された後、さらに、DABがより容易に、異なるサイズの金粒子よりも互いから識別された金粒子に析出組み合わせて二重免疫組織化学を行うことが可能です。私たちは、EMのための脳切片を処理する前に、抗体特異性、オスミウム濃度、およびインキュベーション時間および温度の厳格なテストを行うことをお勧めします。前の埋め込みやEMのための二重免疫組織化学のためのプロトコルは、以前に公開されていると霊長類の脳組織16に適合させることができます。 結論として、上記の非ヒト霊長類のための経心臓灌流プロトコールは、その後、EMプレ埋め込み免疫組織化学のために使用することができる脳切片の長期保存を可能にします。 Sectio得られNSはまた、LMレベルでの神経解剖学の研究に適しています。したがって、EM及びLMの両方に適しているプロトコルを使用して、使用された動物の数、コスト効率および倫理的な考慮を低減することができます。それはまた、同じ動物にLMで得られた結果とEMレベル間の直接比較を可能にし、相関的光学および電子顕微鏡（CLEM）試験の使用を可能にします。クレム研究はほとんど後EMレベル44での電子密度の沈殿物で標識し、観察することができ、このようなEGFPなどの蛍光タンパク質を発現する遺伝子操作マウスの使用に焦点を当ててきました。あるいは、免疫組織化学の問題を回避するために、低温定着前EMレベル46での可視化を可能にする、凍結するために、量子ドット45のような電子密度マーカーのニューロン内注射と組み合わせることができます。しかし、量子ドットは、生体適合性ではない、と彼らの使用は、その後の組織の準備のために必要な追加の冷凍装置に費用と時間がかかります。これらの技術はまだ凍結固定し、凍結置換法を好むが、EM分析47と相関させることができる合成フルオロフォアと異なる細胞タンパク質を標識する半薄（300 nm）のセクション、上の化学タグを使用するためのいくつかの進展があります。可能な技術は、例えば、蛍光およびEMを使用して、指定された標的構造のニューロンとのシナプスの関係を使用してある特定の軸索のローカリゼーションとの間の相関は、具体的には、霊長類における神経系の組織の理解のためにかなり有望です。後者はLMレベルで脳構造の適切な視覚化を変更する可能性が自家蛍光を生成するように、この場合には、アクロレインの固定は、グルタルアルデヒドよりも好まれるべきです。しかし、このタイプの非常に少数の研究は、霊長類において行われてきた、メートルostly技術的な課題と、そのような実験を課す高コストのために。したがって、新たな開発は、このような固定方法を改善または両方LMとEMレベルで可視の化学タグを使用するなどの霊長類に成功したと低コストCLEM研究のために必要とされます。

共焦点及び二光子顕微鏡を含む光学顕微鏡は、他のものの1、2のうち、 インビボ神経プロセスで研究するための効率的なツールであることが証明されました。光学顕微鏡（LM）レベルでの典型的な空間分解能は約200nmであるが、このような極紫外線および軟X線顕微鏡などの異なる光源を用いた最近の技術の進歩は、特に、約10 nmの空間分解能3にこの解像度を増加しています、4、5。イメージングにおける他の技術的進歩は、組織学と組み合わせた磁気共鳴画像を含み、 インビボでミエリン鞘の厚さを測定するための新規な方法、唯一の電子顕微鏡（EM）レベル6,7に伝統的に測定可能であったパラメータを提供します。 AlthouGH LMレベルでのこれらの進歩は、シナプス接触の生体プロセス、構造の詳細図および特性を研究するための優れたツールを提供し、わずか0.5ナノメートルに達することができ、解像度を提供EM、を用いて達成することができます。しかし、EMレベルでの観察は、細胞構築を維持するために、化学固定剤と脱水プロセスと、いくつかの方法で死んで、変更する標本が必要です。従って、高解像度で生体試料を検査することは、放射電子ビームによる損傷、低コントラスト、膜の構造偏差、又は8、9、10を埋め込む以下脱水及びエポキシ起こり得るアーチファクトのも存在に挑戦することができます。 構造解析のために彼らの本来の形で標本を保存する「クライオビトリファイドセクションのEM」またはCEMOVIS、切片化アプローチを用いることによって達成することができます急速凍結及び硝子体氷で試料を埋め込み、極低温11、12にEM下のセクションを調べることを含みます。彼らはまだ固体と完全に水和している間、この手順は、このように脱水工程13に起因するアーチファクトを除去する、試料の検査を可能にします。しかし、この方法では、重要な追加コストを発生させる非常に低い温度でこの観察を可能にするために、凍結超薄切片のための追加の装置と同様に、標準のEMに関する追加のデバイスを必要とします。また、CEMOVISアプローチは、抗体は、通常、室温でインキュベートしなければならないため、技術を免疫標識の使用を妨げます。また、凍結固定した標本をゆっくりと凍結防止化学薬品に浸しながら解凍し、目されている、その間、凍結置換法を使用して免疫組織化学的方法で超微細構造解析を組み合わせることが可能ですエンなどLowicrylsなどの特殊な樹脂に包埋しました。ポスト埋め込み免疫標識は、その後、材料12上で実行することができます。しかし、凍結置換とクライオ固定技術は時間がかかります。彼らは、追加の装置の設置を必要とし、依然として低温14,15の使用にもかかわらず、有機溶媒および細胞構築を変更することができる化学固定液に露出されるようにサンプルを必要とします。したがって、特にアクロレインとLMとEMレベル、脳組織の化学的固定、の両方ですべての技術的進歩にもかかわらず、EM 16で免疫組織化学を結合する低コストおよび時間効率的な方法のままです。 過去数十年間で、多くの試みが最高の組織保存を提供アルデヒドの混合物を見つけるために行われました。 1960年代の前に、EMのために許容可能な結果を​​与えただけで化学固定液は、四酸化オスミウムました。しかし、四酸化オスミウムは、脳のような臓器を修正するために血管系を通してその使用を排除し、毒性の高い、高価です。アクロレインは、細胞構造17のEM観察に適した動物組織の保存のための信頼性の高い方法として、1950年代後半に導入されました。これは、より深く組織を貫通し、浸漬によって固定のために使用され、組織17の最小の収縮と細胞質成分の良好な保存を可能にする他のアルデヒドよりも速く反応します。そのような酵素および他のタンパク質18の生体分子化合物のより正確な局在化を可能にすることにより、新鮮な組織で使用される場合、このような特徴は、アクロレイン固定を他のアルデヒドを超える明確な利点を与えます。確かに、それは効率的stabiliとして、両生類及びげっ歯類を含む多くの種でEMレベルで可視化のための固定の、簡単で効率的かつ低コストの方法として、年間を通じて検証されていますZESペプチドおよびタンパク質は、抗原性を保持し、他のアルデヒド固定剤16、18、19、20、21と組み合わせて使用される場合、比較的無傷の超微細構造を提供します。げっ歯類におけるアクロレイン固定用プロトコルは、それ以来EM 16、22二重免疫標識を実施するために、特にPickel基によって、広範囲に標準化に使用されてきました。いくつかのグループは、ヒト以外の霊長類の脳組織23にアクロレイン固定を使用していました。しかし、我々の知る限り、効率的にEMが24を免疫標識と互換性のある非ヒト霊長類におけるアクロレインとの化学的固定を記述する一つだけ発表されたプロトコルがあります。 この記事では、我々は、効率的、化学的に非ハムを修正するための簡単で信頼性の高い方法を提供します免疫標識および送信EM検査を事前に埋め込むとともに、潜在的に長期保存を可能にアクロレインと霊長類の脳、。

<table><tbody><tr><td>Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>EM Science</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxymethyl aminomethane (THAM)</td><td>Fisher scientific</td><td>T370-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590-1</td><td>5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.</td></tr><tr><td>Acrolein (90%)</td><td>Sigma</td><td>110221</td><td>3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.</td></tr><tr><td>Autopsy venting table</td><td>Mopec</td><td>CE400</td><td></td></tr><tr><td>Electronic perfusion pump</td><td>cole parmer</td><td>masterflex L/S 7523-90</td><td></td></tr><tr><td>Needle (perfusion)</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>NN-1838R</td><td>18 G 11/2</td></tr><tr><td>Needle</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>NN-2713R</td><td>21 G 1/2</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td></td><td></td><td>20 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>4 mg/kg</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td></td><td></td><td>0.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Feather&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; lance</td><td>201011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; J9913</td><td>No.22 for surgery and No. 11 for EM</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td>Calibrate blade before each use, when the device allows it</td></tr><tr><td>Vibratome razor blade</td><td>Gillette</td><td>GIN 642107</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td>30% dilution</td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>Fisher scientific</td><td>E178-4</td><td>30% dilution</td></tr><tr><td>Sodium borohydride (NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S-9125</td><td></td></tr><tr><td>Normal horse serum (NHS)</td><td>Jackson immunoResearch Laboratories</td><td>008-000-121</td><td>2% dilution</td></tr><tr><td>Cold-fish gelatin</td><td>Aurion</td><td>900.033</td><td>0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%</td></tr><tr><td>Primary antibody, SERT</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>SC-1458</td><td>1/500 dilution</td></tr><tr><td>Primary antibody, ChAT</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB144P</td><td>1/25 dilution</td></tr><tr><td>Primary antibody, TH</td><td>ImmunoStar</td><td>22941</td><td>1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Biotinylated secondary antibody, goat</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-9500</td><td>1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Biotinylated secondary antibody, mouse</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-2000</td><td>1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Vectastain elite ABC kit</td><td>Vector laboratories</td><td>PK6100</td><td>8.8 &amp;micro;L/mL of A and B each</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td>0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.</td></tr><tr><td>Peroxide (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;) 30%</td><td>Fisher scientific</td><td>H-323</td><td>0.005% dilution</td></tr><tr><td>Osmium tetroxide (OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Electron microscopic science</td><td>2% 19152&lt;br /&gt;4% 19150&lt;br /&gt;</td><td>Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.</td></tr><tr><td>Durcupan water-repellent epoxy resin</td><td>Sigma</td><td>A: M epoxy resin (44611)&lt;br /&gt;B: hardener 964 (44612)&lt;br /&gt;C: accelerator 960 (DY 060) (44613)&lt;br /&gt;D: plasticizer (44614)&amp;nbsp;</td><td>Polymerize 48 h at 58 &amp;deg;C before throwing in waste.</td></tr><tr><td>Alumium cups</td><td>Electron microscopic science</td><td>70048-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>commercial alcohols</td><td>1019C</td><td>Dilute in distilled water with appropriate concentration</td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Electron microscopic science</td><td>20401</td><td>Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.</td></tr><tr><td>Non-coated medium glass slides</td><td>brain research laboratories</td><td>3875-FR</td><td>Grease surface with mineral oil</td></tr><tr><td>Plastic film (Aclar embedding film)</td><td>Electron microscopic science</td><td>50425-25</td><td>Grease surface with mineral oil</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica UC7</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Diamond trimming tool (ultratrim)</td><td>Diatome&amp;nbsp;</td><td>UT 1081</td><td>Can use glass knife alternatively</td></tr><tr><td>Ultra 45&amp;deg; Diatome Diamond knife</td><td>Diatome&amp;nbsp;</td><td>MC13437</td><td>equipped with a boat</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher scientific</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>150-mesh copper grids</td><td>Electron microscopic science</td><td>G150-cu</td><td></td></tr><tr><td>grid-box</td><td>Electron microscopic science</td><td>71138</td><td>Can store up to 100 grids</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Anachemia</td><td>81983</td><td></td></tr><tr><td>Lead nitrate</td><td>Sigma</td><td>L-6258</td><td>Make a stock solution of lead citrate made of 1.33&amp;nbsp;g of lead nitrate and 1.76&amp;nbsp;g of sodium citrate diluted in 42&amp;nbsp;mL of preboiled and cooled distilled water to which 8&amp;nbsp;mL of 1&amp;nbsp;N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>SS-05L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Corning</td><td>431222</td><td>0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Absorbing paper (bibulous paper)</td><td>Electron microscopic science</td><td>70086-1</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Laboratory film</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of non-human primate brain tissue for pre-embedding immunohistochemistry and electron microscopy

光学顕微鏡レベルでのすべての技術の進歩にもかかわらず、電子顕微鏡は、シナプスの連絡先などの神経細胞の超微細構造および形態学的な詳細を検討し、特徴づけるための神経科学における唯一のツールのまま。電子顕微鏡のための脳組織の良好な保存が厳しい低温定着方法によって得ることができるが、これらの技術は、かなり高価であると同定された神経系の接続性を理解することが重要である免疫標識の使用を制限します。凍結置換法は、免疫標識とクライオ固定の組み合わせを可能にするために開発されています。しかし、これらの方法論的アプローチの再現性は、通常は高価な凍結デバイスに依存しています。また、この技術の信頼性の高い結果を達成することは非常に時間がかかり、スキル困難です。したがって、特にアクロレイン固定伝統的な化学的に固定された脳は、電子を結合する時間効率および低コストの方法のままで免疫組織化学と顕微鏡。ここでは、霊長類の脳組織の維持につながり、プレ埋め込み免疫組織化学および透過型電子顕微鏡検査と互換性のある化学アクロレイン固定を使用して信頼性の高い実験プロトコルを提供します。

このセクションでは、我々は、化学的に3％のアクロレインの混合物、4％PFAで固定し免疫染色霊長類の脳組織の、送信EMレベルで、観察後に得られた代表的な結果を提示します。比較的無傷のミエリン鞘と二重膜（ 図2A）のニート可視化によって示されるように、我々は、超微細構造の良好な保存を達成しました。シナプス接点は、微小環境からニューロンの要素と共に、容易に（ 図2B）を同定することができます。ジアミノベンジジン（DAB）免疫沈降物で標識されたニューロンの要素は、それらの充填された細胞質または軸索原形質によってEMレベルで認識されます。原形質膜および細胞小器官の外側表面はまた、典型的には、電子密度の沈殿物（ 図3）で裏打ちされています。 この特定の実験では、抗体のAGAを使用しましたリスザルの淡蒼球の（GPE）、外部または内部（GPI）セグメント（ 図3）で免疫標識ニューロン要素を視覚化するために、セロトニントランスポーター（SERT）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（チャット）、またはチロシンヒドロキシラーゼ（TH）をINST。そのために、我々は詳細な形態学的調査を許可する、超微細構造と同様の抗原性を保持する固定化学物質の組み合わせを使用していました。多くの抗体は、上記の経心臓灌流プロトコルで使用することができるが、我々はいくつかの一次抗体は、アクロレイン固定して最適な免疫標識を提供しないことが知られているので、ユーザーは、予め最適化濃度のテストを実行することをお勧めします。抗体はアクロレイン固定して最適な免疫標識を提供しない場合あるいは、0.1の希釈 - 4％PFA中の2％グルタルアルデヒドを経心臓灌流のために使用することができます。それは多くのために保存された抗原性とアクロレイン固定脳組織に比較的同等の組織の品質を提供します抗体（ 図4）。 最後に、私たちは、不適切な操作後に得られたEM顕微鏡写真の典型的な例を提供します。標識及び非標識神経素子の信頼性が同定および分析を防止する改変されたミエリン鞘（ 図5A、B）および神経突起の二重膜の可視化の困難（ 図5C、D）に乏しい固定をもたらします。 DAB溶液中での過度なインキュベーション時間は、過剰なバックグラウンドと潜在的に偽陽性の結果を生成することができ、非特異的な染色を作成します。背景又は非特異的染色は、時々 、神経要素（ 図6A、B）のような不完全な染色が現れるが、より多くの場合、多数の密接に染色された神経要素（ 図6C、D）に位置します。ブロッキング溶液中の界面活性剤の使用が大幅に組織の品質を変更します。それは行方不明につながる可能性困難な微小環境のいずれかの急性解釈をレンダリングする標識された素子（ 図7A）またはミエリン鞘（ 図7B）および細胞膜（ 図7C）の分解のオルガネラ、。最後に、塩化ナトリウムを含有するリンス液を用いたとしてosmificationプロセスにおける失策は、細胞構造は、（ 図7D）を区別することは困難であり、信頼できない結果を生成します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55397/55397fig1.jpg" /> 図1：プロトコルの重要なステップの概略図。サル脳（A）は、冷却ビブラトーム（B）で連続切片に切断されます。次いで、それを関心領域が樹脂ブロック（C）の先端に配置された後、プリ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡用に処理し、80nmの厚さsectiに切断されますウルトラミクロトーム（D）とのアドオン。超薄切片は、次いでクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡（F）で観察される準備ができて、裸の150のメッシュ銅グリッドまたはホルムバール被覆ニッケルグリッド（E）に収集されます。スケールバー：1ミリメートル。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55397/55397fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55397/55397fig2.jpg" /> 図2：アクロレイン-PFA経心臓灌流後によく保存さ霊長類の脳組織。 GPiの（A）及びGPE（B）アクロレインPFAの経心臓灌流および免疫ジアミノベンジジン法を行った後の代表的なよく保存材料を示すのリスザル（ サイミリシウレウス ）脳組織の電子顕微鏡写真。メートル軸索のyelinシース（A）（Aにおける矢印を参照）が比較的無傷であり、一般的な超微細構造が十分小さい無髄軸索（A）、及び軸索静脈瘤（AV）は、容易に、AとB樹状プロファイル（d）にすることができる保存され識別されます。樹状プロファイル（D）と（矢印の間）対称シナプス接触を確立軸索静脈瘤の一例は、Bに示されています。スケールバー：1μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55397/55397fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55397/55397fig3.jpg" /> 図3：免疫ペルオキシダーゼジアミノベンジジン法を用いて、コリンアセチルトランスフェラーゼ（チャット）、セロトニントランスポーター（SERT）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（TH）のためのリスザルGPEおよびGPiの免疫標識からの切片。免疫標識された要素は、容易に細胞質または電子密度DAB沈殿物が充填された軸索原形質によって同定することができます。 GPiの中のChAT免疫染色樹状突起は、非標識軸索静脈瘤（AV）から（矢印の間）のシナプス接触を受けるAに見られるように、標識された樹状プロファイルは、充填されたマイクロフィラメントによって認識されます。 Bにおける電子顕微鏡写真は、軸索原形質THのために免疫標識された比較的無傷のミエリン鞘とGPEにおける有髄軸索を示します。 Cの例では、GPiので軸索静脈瘤は、SERTのための免疫標識示し、デンドライト（D）と（矢印の間）対称シナプス接触を確立するように見られます。この例では、DABは、ラインに原形質膜および細胞小器官（ミトコンドリアやシナプス小胞）の外表面を沈殿します。 Dに示す軸索静脈瘤は、GPEで観察されTHのための免疫標識および完全axopを充填沈殿DABの一例を示しましたシナプス小胞が見えるが、線引きすることがより困難であると、lasm。標識された軸索静脈瘤を取り囲む有髄および無髄軸索（a）および時折樹状突起（d）に例示されるような微小環境の要素を容易に同定することができます。電子顕微鏡写真は、25、26、27から変更されています。スケールバー：1μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55397/55397fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55397/55397fig4.jpg" /> 図4：グルタルアルデヒド-PFA経心臓灌流後の霊長類の脳組織の例。 performi後マカクザル（ カニクイザル ）GPE（A）とGPiの（BD）の脳組織の代表的な電子顕微鏡写真セロトニントランスポーター（SERT）に対する抗体を用いて4％PFAおよび免疫ジアミノベンジジン法と混合し、0.2％グルタルアルデヒドで経心臓灌流をngの。 図2のように、免疫標識要素は、その細胞質および電子密度DAB沈殿物が充填された軸索原形質によって同定することができます。 図2で説明したように、静脈瘤軸索標識周囲の一般的な超微細構造は、比較的無傷であると微小環境の要素は、容易に識別することができ、有髄および無髄軸索によって示されるように（a）および時折樹状突起（d）および軸索静脈瘤（AV）。しかし、明確に定義された原形質膜（矢印）で示される超微細構造の質の矛盾、が、比較的損傷を受けた髄鞘（矢印）に注意してください。スケールバー：1μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55397/55397fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図5：失敗経心臓灌流後に得られた霊長類の脳組織の例。そしてGPE（C - D）経0.9％NaClでリンス溶液、氷冷4％PFAの混合物と希釈15％ピクリン酸で灌流-失敗化学固定の結果は、ここではリスザルGPiの（B A）に示されています0.1 M PBにおける液（pH 7.4）。脳を4％PFAおよび30％スクロース中で4℃で1時間、後固定し、冷却ビブラトームを用いて厚さ60μmの矢状切片に切断しました。不適切に固定された脳組織を損傷ミエリン鞘（AとB、矢印）によって、ならびにぼやけまたは未定義の原形質膜によって認識することができる（C及びD、例のために矢印を参照）。異なる神経要素がDIFされています信頼できない超微細構造の任意の解釈をレンダリングする、識別するためにficult。スケールバー：1μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55397/55397fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55397/55397fig6.jpg" /> 図6：リスザルGPEにおける非特定のチャット免疫標識の例。 B（矢印） -に示すように、バックグラウンド染色または非特異的免疫標識は、時には、大細胞要素の部分的染色としてEM下に表示されます。このような非特異的染色は免疫染色セクションの表面でより頻繁に表示されます。非特異的免疫標識の他の例は、部分的にまたは完全にDABを充填し、1つのAに非常に近い位置する小さな、無髄軸索を引き起こす非常に小さな要素の頻繁な観察を含みますNotherの、C及びDにおける矢印によって示されるように。スケールバー：1μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55397/55397fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/55397/55397fig7.jpg" /> 図7：電子顕微鏡用試料調製における失策後損傷リスザルGPE組織。 0.02％の低濃度でブロッキング溶液中のこのようなトリトンX-100などの界面活性剤の使用は、実質的に樹状突起の細胞質（A）または軸索のミエリン鞘（Bを損傷することによって超微細構造の完全性を変化させます）。原形質膜が損傷し、線引きすることは困難であるので、異なる神経要素が、互いに（C）と区別することが困難です。 osmificationプロセスはALSでありますサンプル調製の重要なステップO。溶液（D）をすすぎ中の塩化ナトリウムの使用が難しいその後の分析をレンダリングする、組織の固定を変化させます。スケールバー：800 nmの。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55397/55397fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

ここでは、我々は簡単に、低コストを提供し、時間効率のよいプロトコルは、化学的に透過型電子顕微鏡のための免疫組織化学を事前に埋め込むと互換性のある長期保存を可能に、アクロレイン固定液と霊長類の脳組織を修正します。

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K ビュー.  Université Laval. ここでは、我々は簡単に、低コストを提供し、時間効率のよいプロトコルは、化学的に透過型電子顕微鏡のための免疫組織化学を事前に埋め込むと互換性のある長期保存を可能に、アクロレイン固定液と霊長類の脳組織を修正します。 

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

神経科学

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

生物工学

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

脳バンキング：あなたの研究の標本のほとんどを作る

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

生物学

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

発生生物学

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

成人人間の脳からの短期自由浮遊スライス培養

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.