Name: mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
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アプタマー作業ストックの調製<ol><li>製造元の指示に従って、水にオリゴヌクレオチド（5-Cy5でCCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3、参照18からの配列）を溶解、100μMの最終濃度に達します。 </li><li>結合緩衝液で200 nmまでのオリゴヌクレオチドストックを希釈することにより、アプタマー作業溶液を準備します（20 mMトリス、pHが7.6; 300mMのNaCl; 5mMのMgCl 2、0.01％のTween20）。 </li><li> 90℃で2分間混合物をインキュベート、サンプルはすぐに氷上で冷却し、室温でサンプルを使ってみましょう。 </li></ol>リガンド希釈シリーズの調製<ol><li>各リガンド（アデノシン三リン酸（ATP）、アデノシン二リン酸（ADP）、アデノシン一リン酸（AMP）、アデニン、グアノシン三リン酸（GTP）、シチジン三リン酸（CTP）、デオキシアデノシン三リン酸（dATPを）、及びS-アデノシルメチオニン（SAM）のために; 10 mMストックずつ）、16ステップシリアルdilutiを準備200μlのマイクロ反応チューブ内に。 注：14,000×gで5分間のリガンド株式の遠心分離は、凝集物を除去するのに役立つことがあります。低容量は、低結合反応チューブは、チューブ壁に分子の吸着を避けることをお勧めします。 </li><li>推定親和性より少なくとも50倍の最大濃度で開始し、各希釈段階で50％リガンド濃度を低下させます。 注：制御ソフトウェアに実装濃度ファインダーツールは、結合データをシミュレートし、希釈系列のための右の濃度範囲を見つけるのに役立ちます。 </li><li>マイクロ反応管に16から2をアプタマー結合緩衝液10μlを加え、チューブ1のリガンドストック（10 mM）の20μlのを入力します。 </li><li>転送10管2に管1μlのピペッティングにより、数回上下適切に混ぜます。次のチューブに10μLを移し、残りのチューブのために、この希釈を繰り返します。 </li><li>最後のチューブから10μlの過剰を捨てます。任意のbは避けてくださいufferの希釈効果。チューブ1およびチューブ2月16日のバッファは同一でなければなりません。 </li></ol>最終反応ミックスの調製<ol><li>ピペッティングの誤差を最小化するために個々の結合20μlの容量との反応（アプタマー使用液+それぞれのリガンド希釈液10μlを10μl）を準備します。わずか4μLの容量は、キャピラリーLL FiにSUFのfi cientです。 </li><li>各リガンド希釈液10μlに200 nmのアプタマーワーキング溶液10μlを加え、ピペッティングにより、数回上下適切に混ぜます。 </li><li>試料中に毛細血管を浸漬することにより、標準的なキャピラリーにサンプルLL室温とFiので5分間サンプルをインキュベートします。より長いインキュベーション時間は、いくつかの相互作用を必要とすることができます。しかし、5分が最も適しています。 NOT光学測定が行われる中央部、上、側面のみに毛細血管をタッチします。 </li><li>目の上に毛細血管を配置電子キャピラリートレイとMSTデバイスを起動します。 </li></ol> 4. MSTデバイスの起動注：生成されたデータを解釈するためのソフトウェアデバイスに2つのプリインストールされたソフトウェア・パッケージを提供し、 &#39;&#39; &quot; &#39;分析制御実験条件の技術的なセットアップ用のソフトウェア&#39;&quot;。 <ol><li> MSTデバイスに毛細管トレイを配置する前に、制御ソフトウェアを起動し、ドロップダウンメニュー &#39; &quot;&#39;温度制御で「手動温度制御を可能にする &#39;&#39;を選択することによって、全体的な所望の温度を調整します。このように、25℃に温度を調整します。 注：MST機器は、温度制御された22〜45°Cからすることができます。 </li><li>温度が期待されるレベルに到達した後、MSTデバイスに毛細管トレイを配置するのを待ちます。 </li><li> Cy5の色素のための &quot; &#39;&#39;赤にLEDチャネルを設定し、FL uorescencを得るためにLEDの電力を調整します標準センサーとMSTデバイスで300〜1000蛍光単位の電子信号。 25％のパワーLEDをこの研究で使用されています。 注：6000 18000蛍光単位は、高感度センサーとMSTのために推奨されています。 </li></ol> 5.キャピラリースキャン<ol><li> 「コントロール」のソフトウェア上のキャピラリの位置を選択し、「開始キャップスキャン」をクリックすることで、試料の異なる品質面をチェックするために、毛細管スキャンを行います MSTの測定を開始する前に。 </li><li>ソフトウェアで（U字型またはピークを平坦化）蛍光増強/消光とこだわりの効果のためのキャピラリースキャンを点検します。 注：その他の蛍光の検出および取り扱いに関する詳細やこだわりの影響が議論に記載されています。 </li></ol> 6. MST測定注：MSTの測定を開始する前に、こだわりの影響を除外することを確認し、充実/クエンチング効果、またはピペッティングエラー、毛細管スキャンがフロリダ州uorescence信号がSUFのfi cientであることを示していることを確認してください。詳細については、説明を参照してください。 <ol><li> &#39;&#39;コントロール」ソフトウェアで、それぞれのキャピラリ位置に希釈系列からのリガンドの濃度を割り当てアプタマーとリガンド（1：1）を混合する希釈工程を考えてみましょう。 </li><li>キャピラリ＃1のリガンドの最高濃度（5 mm）を入力し、正しい希釈タイプを選択します（ここでは、1：1）、最大濃度をクリックすると、自動的に毛細血管の＃2位の残りの濃度を割り当てるには、ドラッグ機能を使用16。最低濃度は152.6 nmです。 </li><li>制御ソフトウェアの各セクションで（ここでは、100 nM）を蛍光増アプタマーの濃度を入力します。 </li><li> 、5秒間のFL uorescenceを検出し、デフォルト設定を使用して30秒間MSTを記録し、レーザーtの不活性化後にさらに5秒間蛍光を記録します<html> O分子の逆拡散を監視します。 </li><li>制御ソフトウェアの各セクションの20％のレーザー出力を調整します。 注：最高の信号対雑音比を受信し、非特異的効果を回避するために、20〜40％のレーザー出力が推奨されます。特定の場合において、より高いレーザー出力を結合していない及び結合した分子の良好な分離を得るために必要とされ得ます。 </li><li>コピー先のフォルダを選択した後、実験を保存して、 &#39;&#39;スタートMST測定」ボタンを押すことで、MSTの計測を開始します。 注：.ntpファイルは、保存先のフォルダに生成されます。この設定を使用して、一回の測定は、10〜15分間持続します。 </li><li> EC 50値のより正確な決意のために少なくとも2回の実験手順を繰り返します。 注：技術的再現性を試験するために、同一の毛細管が複数回（技術的反復）を走査することができます。 </li></ol> 7. MSTデータ分析NT &quot;&gt;注：解析ソフトウェアは測定中のFL yの上のデータの分析を可能にする分析ソフトウェアは、リガンド濃度37対MST時間トレースと正規化されたフロリダ州uorescence（F ノルム ）の変化をプロットします。。 <ol><li> MST解析ソフトウェア（MO.Affinity分析）を起動し、保存先のフォルダから.ntpファイルをロードします。データ選択メニューでの解析タイプとして「MST」を選択します。 注：リガンド依存性蛍光効果の場合は、初期蛍光分析のために選択することができます。 </li><li>ドラッグ・アンド・ドロップするか、それぞれの実験下の「+」ボタンを押して、新たな分析にそれぞれの技術的あるいは生物学ラン（複数可）を追加します。 </li><li>実験では、MSTのトレース、キャピラリースキャン、キャピラリー形状、初期蛍光、および漂白速度の特性に関する情報を得るために、それぞれの実験以下の情報ボタンを押してください。 注：これらの生データ缶アルそう分析の後の手順で検査されます。 </li><li>視覚バンプやスパイクなどの目に見える、凝集および沈殿効果のためのMSTトレースを検査します。 注：検出および凝集効果の取り扱いの詳細については、議論をお読みください。 </li><li>視覚的に平坦化またはU字型のピークとして表示毛細管スキャンと吸着効果のためのキャピラリー形状オーバーレイを、点検してください。視覚毛細管スキャンおよび蛍光効果の初期蛍光を検査します。視覚効果を光退色するための漂白率を検査します。 </li><li>用量 - 応答モードに切り替えて、それぞれのボタンを押して、「エキスパート」モードに解析の設定を変更します。 MSTの評価戦略として「T-ジャンプ」を選択します。 </li><li>曲線Fiのための設定については、「ヒル」モデルを選択します。結合パラメータを自動的に計算されます。 「比較結果」メニュー内の正規化のそれぞれのタイプを選択してデータを正規化します。エクスポート.XLSまたはPDFファイルなどのデータのいずれか。 注：バインディンググラフ下の表には、計算された結合パラメータをまとめたもの。 </li></ol>

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品質コントロール： 非特異的表面への試料物質の付着/吸着、ならびに凝集効果、親和性データの質に劇的な影響を与えます。しかし、わずか数最先端の技術は、これらの影響を監視し、回避するために、正確かつ迅速なオプションを提供しています。 MSTは、技術的なセットアップの段階的な最適化を可能にする、検出し、これらの問題を克服するのに役立つ統合された品...

分子間の相互作用は自然の基礎です。したがって、基礎および応用研究の多くの分野の科学者は、異なる種類の分子相互作用の基本的な原理を理解してみてください。マイクロ熱泳動（MST）は、バッファを自由に選択して、高速、正確な、コスト効率の高い、溶液中の分子間相互作用の品質管理特性評価を行うために、科学者を可能にします。 MSTを使用して、1,000以上の出版物は、ライブラリースクリーニング、結合事象の検証、競合アッセイ、および複数の結合パートナー1-8を用いた実験を含めた分析の種類を記述する、単独で2016年から、すでにあります。一般的に、MSTは、このような分子間相互作用の任意の種類の結合親和性（mmまでPM）、化学量論、および熱力学、のような古典的な結合パラメータ、の研究を可能にします。 MSTの大きな利点は、相互作用パートナーの大きさの独立した結合事象を研究する能力です。でもCHALlengingの小核酸アプタマーとの相互作用（15-30塩基）等の小分子、薬物、抗生物質、または代謝産物などの標的を定量することができます。 アプタマー-ターゲット相互作用を特徴づけるために、現在の最先端の技術は、実験室強く、非常に複雑されているか、またはアプタマー-小分子相互作用9,10を定量化することができません。表面プラズモン共鳴（SPR）はゲル状、19をプロービングにライン、アッセイ11,12と、本当にそのような等温滴定熱量測定（ITC）13-15、定組成溶離16、平衡ろ過17,18としてラベルフリー熱量測定アプローチを、ベースシフトアッセイ、stopped-流FL uorescence分光法20,21、蛍光異方性（FA）22,23、単一分子FL uorescenceイメージング24,25、およびバイオ層干渉（BLI）は26も不正確またはアプタマー、小分子と非互換ですか、相互作用。その他principaこれらのメソッドのリットルの問題は、低感度、高サンプル消費、固定化、表面の質量輸送の制限、および/またはバッファの制限です。これらの技術の唯一のいくつかは、凝集、吸着効果のための統合制御を提供します。 MSTは、アプタマーおよび小分子27-29、ならびにそのようなタンパク質30-33のような他の標的との間の相互作用を研究するために、この制限を克服するために、科学者のための強力なツールを表します。技術は、温度勾配を介して分子の動きに依存しています。呼ばれるこの有向運動、「熱泳動は、「サイズ、電荷、および分子34,35の水和殻に依存します。分子へのリガンドの結合を直接変更熱泳動移動度が得られ、これらのパラメータのうちの少なくとも1つを変化させます。小さなサイズを有するリガンドは、結合した状態に結合していないからサイズ変更の面で大きな影響がないかもしれませんが、彼らがdrを持つことができます<html>水和殻および/または電荷にamatic効果。結合パートナーとの相互作用後の分子の熱泳動運動の変化は、基本的な結合パラメータ2,7,34,36,37の定量化を可能にします。 図1Aに示されているように、MSTデバイスは、蛍光検出の場合と同じ光学系を用いて、ガラスキャピラリー内のサンプル上に集束赤外線レーザーで構成されています。レーザは温度勾配（2-6℃のΔT）を確立しながら、トリプトファン6または蛍光標識された相互作用パートナー3,8のの固有のFL uorescenceを介してタンパク質の熱泳動的動きを監視することができます。空間、ΔTで生じる温度差はソーレーによって定量することができる高温の領域での枯渇または分子の蓄積につながるCOEF Fiのcient（S T）。 G &quot;/&gt; C ホット加熱された領域内の濃度を表し、及びcの寒さは、初期の寒冷地での濃度です。 図1B、それぞれの時間スケールによって分離することができる別の相からなるMSTの移動プロファイル（時間トレース）における典型的なMSTの実験結果に示すように初期蛍光を正確出発蛍光を定義し、光退色またはphotoenhancementをチェックするために温度勾配が存在しない場合に最初の5秒で測定されます。温度ジャンプ（T-ジャンプ）において蛍光変化熱泳動移動前の段階を示しています。この蛍光の初期の減少は、量子収率uorophore FLの熱的変化に依存しています。定常状態分布に達するまで、熱泳動相が原因分子の熱泳動的動きのために、蛍光が減少（または増加）に従います。レーザがオフにされた後、図1（b）に示すように、逆TJUMPと蛍光増分子の同時逆拡散を観察することができます。基本的な結合パラメータにアクセスするために、相互作用パートナーの異なるモル比を分析し、比較します。光学可視分子が一定に保たれると非標識リガンドの増加量が供給され、一方、典型的には、16の異なる比率は、一つMST実験で研究されています。 2つの結合パートナーとの相互作用は、熱泳動の変化を誘導し、したがって、正規化されたFL uorescenceで、次のように計算されるF ノルム 、： <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> 冷たい ホット ＆F Fは、MSTトレースのデFiのNEDの時点でFL uorescence強度を平均化表します。結合親和性（K dまたはEC 50値）CURVによって計算することができます。電子フィッティング（ 図1C）。 全体的に、MSTは、いかなる種類の分子相互作用を研究するための強力なツールです。および25-ntの短い一本鎖DNAアプタマーDH25.42（7.9キロダルトン）;この原稿は、小分子アデノシン三リン酸（0.5 kDaのATP）との間で挑戦的な相互作用を特徴づけるためのプロトコルを提供しています。原稿の間に、ATP分子上のアプタマーの結合部位は、ATPのアデニングループにダウンマッピングされます。

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgium</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-&lt;br/&gt;ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&amp;nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel&lt;br/&gt; MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

この研究では、MSTは、ATPのDH25.42 DNAアプタマー18の結合部位を特徴付けるために適用されました。ランダム38-40一つ以上の蛍光体で標識タンパク質と小分子をATPの相互作用を特徴付けるまたはATP模倣他の研究とは対照的に、本研究では、5 &#39;末端上の1つのCy5分子と7.9 kDaの一本鎖DNAアプタマーのラベル付きバージョンが含まれています。異なるATP誘導体...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

マイクロスケールの熱泳動を使用してATPのアプタマーの結合部位のマッピング

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K ビュー.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

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Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

化学

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

生化学

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

がん研究

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

ランダムDNAライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

生物学

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules with signal-generation capability. For the system described herein, target recognition through an aptameric domain, Stem II of a modified hammerhead ribozyme, activates the self-cleaving ribozyme by stabilizing the initially unstructured construct. The cis-cleaving RNA acts at the junction of Stem III and Stem I, creating two cleavage products. The longer cleavage product primes an isothermal exponential amplification reaction (EXPAR) of the two similar catalytically active G-quadruplexes. Those resulting amplification products catalyze peroxidase reduction, which is coupled to the reduction of a colorimetric substrate with an output that the naked eye can detect. The 3-part system described in the present study improves detection modalities such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) by producing a visually detectable signal for indicating the presence of as low as 0.5 &#181;M theophylline in as little as 15 min.

The present protocol demonstrates the use of a fast, 3-stage, aptamer-based exponential amplification assay to detect targets. Sample preparation, signal amplification, and color development are covered to implement this system to recognize the presence of theophylline over that of caffeine.

3段階G四重鎖等温指数増幅反応によるアプタマーベースのターゲット検出(英語)

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

生物工学

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

比色金ナノ粒子アッセイに適用される構造スイッチングアプタマーを選択するための方法

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Source: Mittermaier, A. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55959">Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates differential scanning calorimetry &#8212; a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

DNAアプタマー-熱不安定性リガンド相互作用を研究するための示差走査熱量測定

Source: Mittermaier, A. K., et al. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. ...