Name: cell-free dna integrity analysis in urine samples
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
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The authors thank Gr&#225;inne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.

プロトコルは、IRSTヒューマン研究倫理委員会のガイドラインに従います。 注：この手順では、UCF DNAの完全性の分析を実行するために尿試料からDNAを単離しました。 LNCaPおよびMRC細胞株は、標準を構築するために使用しました。このような特定の癌遺伝子のためのDNAの抽出、DNAの定量（コントロール遺伝子について分光光度計、リアルタイムPCR、STOX1）、及びリアルタイムPCRのような技術は、（ 図1）を行いました。 1.尿収集および処理<ol><li>清潔で乾燥し、プラスチックカップでクリーンキャッチ最初の朝の尿サンプルを入手します。尿サンプルの少なくとも50ミリリットルを収集します。 </li><li> 3時間の最大4℃で尿を維持し、同じ温度で実験室に送信します。 </li><li> 2つの50 mLコニカル底ポリプロピレンチューブに研究室や転送に到着するとすぐにそれを2回反転させることにより、各サンプルを混ぜます。 </li><li>チューブを遠心4℃または室温で10分間、850×gで。 </li><li>慎重に細胞ペレットの上の上清のうちの少なくとも2ミリリットルを残して、2つの5 mLのチューブに、尿上清の上部10ミリリットルを転送します。 注：上清の上部を転送するには、細胞または細胞破片による汚染のリスクを低減します。上部と下部との間には明確な描写はありません。 </li><li>ペレットを捨て、すぐに使用するまで-80℃上清を凍結します。 </li></ol>尿上清および細胞株から2 DNA単離注：市販のキットを用い、製造業者の指示に従って細胞系（膀胱癌のための前立腺癌またはMRCために、例えば、LNCAP）からDNAを単離します。尿上清からのDNAの単離は、以下のように修正された、商業的プロトコルを使用して行われるべきです。 <ol><li>室温で尿上清の1つのアリコートを解凍します。&lt;/李&gt; <li>明確な5-mLのチューブに尿サンプルと転送尿上清1mLのを渦と混ぜます。 -80℃で残尿をフリーズします。 </li><li>サンプルに直接プロテイナーゼkの100μLを加えます。 </li><li>サンプルにAL緩衝液の1 mLを加え、ピペッティングによりよく混ぜます。 </li><li>チューブを閉じ、15分間56℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li>インキュベーションの間、各サンプルごとに1カラムを作製し、製造業者の説明書（100％エタノールの指示された量を加える）に従って、洗浄バッファー、AW1およびAW2を準備します。 </li><li>室温に戻し、サンプルを持参し、無水エタノール1mLを追加。ピペッティングにより完全に混和します。 </li><li>列にステップ2.7で得られた混合物の650μLを加え、1分間6000×gでそれを遠心します。 </li><li>フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブにカラムを配置します。サンプル混合物のすべてが（5回）に使用されるまで繰り返し、2.8と2.9の手順。 </li><li> 500＆を追加＃181;カラムの縁を濡らさないようにバッファAW1のL。 1分間6000×gでそれを遠心。 </li><li>フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブと交換してください。 </li><li>カラムの縁を濡らさないようにバッファAW2の500μLを追加します。 3分間フルスピード（2万XG）でそれを遠心。 </li><li>フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブと交換してください。 </li><li>任意の残留洗浄バッファーを除去するための手順を繰り返し2.12。 </li><li>きれいな1.5 mLチューブにカラムを置きます。溶出バッファーAEの50μLを加え、カラムを濡らすバッファことを確認するために、7分を待ちます。 </li><li> 1分間8000×gでそれを遠心。 </li><li>ミニカラムにステップ2.15から溶離液をピペットとDNAの最大の回収率を確保するために、1分間最大速度でそれを遠心します。 </li></ol> 3. DNA定量化および希釈<ol><li>分光光度計を使用して、ボットからのDNAの定量化を行いますH細胞株および尿上清試料。製造元の指示に従って、ベンチトップ分析計で試料を2μLを使用してください。 </li><li> 1ng /μLの濃度を取得し、DNAの完全性の分析まで-20℃でDNAを保存するためにUCF DNAサンプルを希釈します。 注：DNA量をリアルタイムPCR（少なくとも100 ngの）を続行するのに十分でない場合、新たなDNAの単離処理を行います。 </li><li> 0.001 0.01、0.1、1、0.5、2 NG /μL、100μL（ST1、ST2、ST3、ST4、ST5の体積でそれぞれ、および：異なる濃度の6水準を得るために、細胞株サンプルからDNAを希釈ST6）。 DNAの完全性の分析まで-20℃で細胞株DNA標準を保管してください。 </li></ol> 4. DNA完全性試験 - PCR <ol><li>プライマー（濃度はアッセイの種類によって異なります）、グリーンスーパーミックス、細胞株のDNA標準、および氷上でUCF DNA希釈した試料を解凍します。 </li><li>プレートFのストリップチューブを準備または72ウェルロータディスク。小分けした各標準および希釈サンプルおよび陰性対照のためのRNaseフリー水10μLの重複で10μL。 </li><li>各サンプルについて、各プライマーの1μL（濃度は表1に示されている）、グリーンスーパーミックスの12.5μL、およびRNaseフリー水6.5μLのミックスを調製します。 2複製のための6の標準、2反復のサンプル数、2複製、および2エキストラサンプルの陰性対照：ミックスを調製する場合、サンプルの次の番号を使用します。 </li><li>各ウェルにミックスのアリコート15μL。ピペット又はチューブをスピンしないでください。 </li><li> 表1に示したPCR条件でプロトコルを起動します。 注：29×2サンプル+ 6×2標準+ネガティブコントロール×2 = 72（UCF DNA値）：UCF DNA値の場合、29のDNAサンプルを72ウェルのロータディスクを使用して、各リアルタイム実験のために処理しました。 注：UCF DNAインテグリティ解析のためのプロトコルもすることができます（他のデバイスを使用する場合、ROX色素を添加する必要があるかもしれない）他のリアルタイムPCR装置を用いて行きました。 </li></ol> 5. DNA完全性試験 - データ分析と解釈注：以前に7-9（ 図2）に記載のように各サンプルのUCF DNA値は、各個々のPCR遺伝子の評価のための標準曲線の構築を用いて、標準曲線の補間を使用してリアルタイム機器検出システムソフトウェアによって得ました。 <ol><li>複製を評価します。サンプルはCtは破棄され、第二の実験で再評価されなければならない≥1違いで複製します。 </li><li>各試料についての中央値のCtを計算し、36≤Ct値とサンプルを検討してください。 </li><li>融解分析を使用して、PCR産物の特異性を評価します。 </li><li>標準曲線との補間によって各アンプリコンの濃度を評価します。各アンプリコンのための濃度値（ngの/μL）を得ました。</li>
</ol>

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	<li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer.">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li><li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer.">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li><li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2/neu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer.">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li><li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma.">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li><li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer.">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

UCF DNAの完全性の分析は、尿中のDNAの完全性を評価するための新しい、非侵襲的方法です。最近、膀胱9および前立腺癌7,8の早期診断のために提案されました。 UCF DNA完全性テストの利点と欠点の数は、一緒に将来の見通しで、ここで説明されています。 アプローチの主な利点は、それが安価で、非侵襲的な方法と分子生物学的手法の基本的な知識を必要?...

無細胞DNAは、アポトーシスまたは壊死の機構によって、血液および細胞死に起因する尿中で検出することができます。血中の無細胞DNAは、広く様々な疾患における診断および予後目的、特に癌1のために研究されています。ただし、以下は、尿、無細胞（UCF）DNAの役割について知られています。 UCF DNAは、糸球体濾過システムを介して、または、この体液2（ 例えば、尿路上皮細胞または前立腺細胞）との接触に直接来て、細胞から通過する血液に由来し得ます。バイオマーカーの供給源としてUCF DNAの使用は、主に尿路細胞3,4から直接UCF DNAの割合が高いと、腎、膀胱、前立腺癌の早期診断のために検討されています。 リトルは、UCF DNA単離とそれを特徴付けるための最良の方法について知られています。腫瘍細胞は正常細胞よりも長いDNA断片を放出するという仮説評価与えられました無細胞DNAの完全性は、血液循環5にDNAの起源を解明する試みにおいて研究されてきました。いくつかの研究は、血液中の無細胞DNAの完全性は、癌6多くの種類のための良好な診断テストを表し、同じ仮説が尿7-9に関連して提案されていることを実証しました。 本稿では、膀胱および前立腺癌の検出への適用の可能性とともに、UCF DNAインテグリティ解析のための新しい方法を説明します。具体的には、UCF DNAの完全性は、より長い250bpのが前立腺癌および膀胱癌を含む固形腫瘍において増大したDNAコピー数を有することが知られている4つの領域において試験したよりフラグメント：C-MYC（8q24.21）、HER2を （17q12.1 ）、BCAS1（20q13.2）、およびAR（Xq12）10-14。特定の癌遺伝子ではなく、ランダムな配列は、癌患者の無細胞画分でそれらを発見する確率を高めるために選択しました。の主な利点の一つこの方法は、柔軟であり、他の領域は、腫瘍の種類や特性に基づいて選択することができるということです。

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&amp;nbsp;Green Supermix, 100 x 50 &amp;micro;L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&amp;nbsp;</td><td>IDT&amp;nbsp;</td><td></td><td>HPLC purification, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Another Real Time PCR instrument could also be used</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>one centrifuge for 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette tips (10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Collection Tubes (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-free dna integrity analysis in urine samples

血漿または血清中の無細胞循環DNAの存在は、広く多くの種類の癌のためのバイオマーカーの適切な供給源であることが示されているが、いくつかの研究は、尿、無細胞（UCF）DNAの潜在的な使用に焦点を当ててきました。正常なアポトーシス細胞が高度に細分化DNAを作製し、その癌細胞はより長いDNAを解放仮説から出発し、UCF DNAの完全性の潜在的な役割は、前立腺や膀胱癌および健康な個体の患者とを区別することが可能な早期診断マーカーとして評価しました。 C-MYC、BCAS1、HER2、およびAR：UCF DNAの完全性の分析は、250塩基対よりも長い4系統の4定量的リアルタイムPCRのもとに提案されています。しばしば、膀胱および前立腺癌において増加したDNAのコピー数を有する配列は、分析のために選択したが、この方法は柔軟性があり、そしてこれらの遺伝子は、INTEの他の遺伝子で置換することができ残り。バイオマーカーの供給源としてUCF DNAの潜在的な有用性は、すでにこのようにUCF DNAの特性化に関するさらなる研究のための道を開く、泌尿器科悪性腫瘍のために実証されています。 UCF DNAの完全性試験は、非侵襲的、迅速、かつ実行が容易で、分析を行うために必要な尿のわずか数ミリリットルであるという利点を有します。

全遊離DNA濃度は、1.51の間および138 ngの/μLの範囲を示す、分析したすべてのサンプルについて、分光光度法により定量可能でした。五対照試料は、データの再現性のために使用した二つの独立したリアルタイムの実験は、C-MYC、HER2、BCAS1、AR、及びSTOX1について実施しました。変動（CV）の係数は、2つの独立した実験間の再現性?...

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.7K ビュー.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

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Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

遺伝学

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

便DNA完全性検出による大腸癌リスクと罹患率の評価

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

がん研究

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of cytosine. Thus, it is crucial for genome integrity maintenance. A highly specific, non-labeled, non-radio-isotopic method was developed to measure UDG activity. A synthetic DNA duplex containing a site-specific uracil was cleaved by UDG and then subjected to Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis. A protocol was established to preserve the apurinic/apyrimidinic site (AP) product in DNA without strand break. The change in the m/z value from the substrate to the product was used to evaluate uracil hydrolysis by UDG. A G:U substrate was used for UDG kinetic analysis yielding the Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s, and Kcat = 9.31 s-1. Application of this method to a uracil glycosylase inhibitor (UGI) assay yielded an IC50 value of 7.6 pM. The UDG specificity using uracil at various positions within single-stranded and double-stranded DNA substrates demonstrated different cleavage efficiencies. Thus, this simple, rapid, and versatile MALDI-TOF MS method could be an excellent reference method for various monofunctional DNA glycosylases. It also has the potential as a tool for DNA glycosylase inhibitor screening.

A non-labeled, non-radio-isotopic method to assay uracil-DNA glycosylase activity was developed using MALDI-TOF mass spectrometry for direct apurinic/apyrimidinic site-containing product analysis. The assay proved to be quite simple, specific, rapid, and easy to use for DNA glycosylase measurement.

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析分析によるウラシル-DNAグリコシラーゼアッセイ

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

生化学

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

免疫・感染学

がん診断のためのCRISPR-Cas合成尿バイオマーカー検査

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

著者スポットライト:疾患検出およびイメージングのための分子ツールのエンジニアリング

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

要約

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ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応

便DNA完全性検出による大腸癌リスクと罹患率の評価

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析分析によるウラシル-DNAグリコシラーゼアッセイ

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

要約

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ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

便DNA完全性検出による大腸癌リスクと罹患率の評価

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析分析によるウラシル-DNAグリコシラーゼアッセイ

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応