This work was supported in part by a Davis Heart and Lung Research Institute Trifit Award, as well as by the Intramural Research Program of the NIH National Institute on Aging.

このプロトコルは、によって承認され、人体実験のためのオハイオ州立大学施設内倫理委員会のガイドラインに準拠しています。 MR装置に関連するすべての手順は、MRの安全性59の最高水準に付着十分に訓練を受けた要員によって実行されることが非常に重要です。 1.材料と準備<ol><li>すべての必要な材料は、実験前（ 図2）に利用可能であることを確認してください。 </li><li>ボアに最も近い試験テーブルの最後にでテーブルコイルコネクタに31 Pコイルを接続します。 MR試験のテーブルの先頭付近に大きな三角形のフォームクッションを置き、直接ではなく31 Pコイルに。対象の快適さのために、MR検査表、穴から最も遠いのもう一方の端にヘッド枕を置きます。 </li></ol> 2.件名のポジショニング（図3a） <ol><li>仰臥位、足を横にするために、被験者に指示MRテーブルの最初の。部分的に屈曲位で足をサポートするために、膝の下にフォームクッションを置きます。 </li><li>このように、検査中の大腿筋に最適なB0の均一性を確保し、可能な限りマグネットアイソセンタに同様に密接に左太ももをセンタリングするために、位置表の右側に近い対象（対象者の権利を）。耳栓および/またはヘッドフォンを対象に提供します。 </li><li>膝蓋骨と大腿骨頭間の約中間点に左大腿四頭筋に31 PのRFコイルを置き、ストラップを使用して、脚に固定します。外側広筋の上に、脚部の横部分の上にコイルを配置します。 </li><li>脚部にコイルを固定するために使用されるのと同じストラップで太ももの内側面にベビーオイルを固定します。これは、スキャン局在化を促進します。 </li><li>コイルの下に膝の上に配置されたストラップと一緒に被験者の足をバインドします。追加ストラとMRテーブルに対象者の足を確保psの、膝と膝と足首の間に1つの中間に上記1。 </li><li>コイルの中心を描くと、このセンタリングランドマークを使用して、磁石のアイソセンタにテーブルを移動するためにレーザー光ガイドを使用してください。 </li></ol> 3.運動プロトコル<ol><li>運動プロトコルは、3つのフェーズで構成され、対象に説明：初期、ベースライン相;短い、激しい運動段階;そして、回復期。 </li><li>まだ嘘とモーションアーチファクトを最小限にするために、分光取得のベースラインと回復の段階で自分の足の筋肉をリラックスする対象を指示します。 </li><li>運動の開始を示す対象にカウントダウンを提供します。この時点で、対象は、ストラップの抵抗に抗して、可能な限り迅速にとして強制的に膝伸展/屈曲を開始しています。 注：大腿四頭筋が停止するように指示されるまで、上下左下肢を移動するために使用されています。 </li><li> 30％低下した後に運動を終了PCRピーク高さです。 <ol><li>取得ビューアウィンドウ内のPCRピーク高さを観察し、また運動シーケンスの完了時に、それを表示します。 注：一般的なガイドラインをPCRピークの高さの約30％の低下をPCRピークの高さの50％であるのPiピークに対応することです。 PCR枯渇は試験の運動相中に30％の低下を達成するのに十分迅速に発生していない場合は、硬いまたはより高速運動中にキックする対象を奨励します。 注：運動の停止をPCRピーク高さと運動の継続時間を監視することによって決定されます。これは、異なる患者における運動のわずかに異なる持続時間をもたらすことができると分析で説明することができます。 </li></ol></li></ol> 4.スキャンプロトコル<ol><li>適切な対象の位置を確認し、31 Pコイルの位置を特定するために3平面ローカライザを取得します。 注：ローカライザーシーケンスが自動的に開始され、インド系で中心レーザー光ガイド（ステップ2.9）を使用してated位置</li><li>第3平面ローカライザーを取得します。 <ol><li>第3平面ローカライザ画像上のスライスビューを開きます。 注：このプロセスは、異なるソフトウェアおよびハードウェアシステムについて異なっていてもよいです。 </li><li>センターとは、左クリックし、スライスグループに保持することにより、スライスの向きを回転させます。スライスグループを回転させます。スライスの最終的な向きは、ベビーオイルの位置と一致することを確認します。 </li><li>シーケンスルーチンウィンドウで、軸方向及びサジタル画像（ 図3b）で脚全体をカバーするためにスライス数を増やします。 </li></ol></li><li> 31 P分光シーケンス： <ol><li>以下の非局在化しパルス取得シーケンスパラメータを使用してください：TR：1,000ミリ秒。 TE：0.34ミリ秒;スペクトル幅：2,000ヘルツ。フリップ角：90度。取得したデータポイント：1024; 1スペクトルごとに6秒の時間分解能が得られる4平均値。 </li></ol></li><li> 31 Pシム洪明甫Xの配置： <ol><li>マウスを使用して、画面の上部に表示ウィンドウに二TRIPLANEのローカライザ画像をドラッグします。プロトコルウィンドウに分光シーケンスをドラッグし、ダブルクリックして開きます。 </li><li> （水平線と黒い四角形を選択）シムボクセルを可視化するために位置ツールバーを使用します。このオプションを選択した後、ローカライザ画像上の緑色のボックスを観察します。 注：これはシムボクセルです。 </li><li>左クリックでボクセルを移動し、中央にボクセルを保持しています。サイズを変更し、左クリックし、ボックスのコーナーでボクセルを保持することによってボクセルの向きを回転させます。直接コイルの下のB0磁場の均一性を確保し、大腿四頭筋の平面に平行するようにシムボックスを配置します。 注：これは直接コイルの中心の下に組織の容積であるコイル、下に敏感な領域内の適切なシミングを確保することです。 </li><li> sensitivを識別するために3平面ローカライザ画像を使用しますEコイルの領域と大腿四頭筋の中に、この領域を包含するようにシムボックスを調整します。 注：シム・ボックスは、データ取得ボクセル（ 図3c）内のB0の均一性を確保するために、表面コイルの真の適用範囲よりも大きくすることができます。 </li><li> 31 P・テスト・買収： <ol><li>取得ビューアウィンドウを開き、取得ツールバーのヘッドアイコンを選択します。これは、リアルタイムで分光獲得の閲覧が可能になります。 </li><li> 31Pシムボクセルを配置した後、プロトコルウィンドウの上部にある「実行」ボタンをクリックすることで、単一のスペクトルを得るためにシーケンスを実行します。 </li><li> B0シミングの品質を調べます。取得窓が得られたスペクトルを観察します。 0 ppmの中心に顕著なのPCRピークと有意なノイズ（ 図4a、左）を確認します。 注：トラブルシューティング：スペクトルは騒々しい表示された場合は、シムボックスは筋肉内に配置されていることを確認してください。広告ちょうどサイズ及びシムボックスの位置は、信号対雑音比を改善します。必要に応じてテスト買収を繰り返します。 </li><li> PCRピーク高さを確認するためには、分光ツール（「アプリケーション」→「分光法」）にスペクトルを開きます。患者のフォルダ（フォルダツリーのアイコン）を開き、適切なスキャンを選択して、スペクトルをロードするためにダブルクリックします。 </li></ol></li></ol></li><li>運動前のT1の画像： <ol><li>コイルの中心にシングルスライス軸T1強調画像を得ます。 </li></ol></li><li> 31 P運動前の取得： <ol><li>左クリックとプロトコル・ウィンドウにシーケンスをドラッグして（最高のスペクトル品質を生産）ステップ4.4からの配列をコピーします。すべての後続の測定のために、このシーケンスを使用してください。 </li><li>被写体が静止している一方でシーケンスルーチンウィンドウで、10の測定値を取得するために1〜10を選択し、実行からの測定値の数を増やします。 </li></ol></li><li> 31 &lt;/ SUP&gt; Pの運動取得： 注：これは、分析のために重要であるように、開始と終了の運動時間を慎重にメモしておいてください。 <ol><li>残り：以前のスキャンからのシムの設定を適用し、20回の測定を取得する順序を設定します。カウントダウン後に蹴りを開始するために、対象を指示します。 2測定のために停止したままであるために、被験者に指示します。 </li><li>運動：〜30秒（またはPCRピーク振幅の30％の低下を達成するのに必要な時間）が膝伸展運動を行うために被写体を確認して下さい。被験者は十分なのPCR枯渇を達成した後、休息してもらいます。 </li></ol></li><li> 31 P、運動後の買収： <ol><li>安静時に追加の20の測定値を取得します。運動後の買収は（右、 図4a）の一時停止またはシム調整せずに、運動シーケンスの直後に開始していることを確認してください。 注：二つの別々の買収にこの回復期間の細分化は、私の分析が可能運動は繰り返す必要がある場合、オペレータは、完全な回復期間の取得を回避することを可能にする第20のダイナミックスペクトルの取得時nitial 20ダイナミックスペクトル。 </li></ol></li><li>運動の質の確保： <ol><li>運動の開始時と終了時のPCRピーク高さの比較。高品質運動セッションは、PCR濃度の約30％の減少をもたらします。 </li><li> PCRピーク高さは残りの開始時および回復の終わりに同じであることを確認します（通常は、&lt;10％の差が望まれています）。これは、取得時の磁場均一性の無視できる程度の損失があったことを保証します。 注：のPCr破壊が不十分である場合、または磁場均一性の損失があった場合には、（疲労を避けるように注意しながら）試験の行使/回復部分を繰り返し、コイルとストラップが確実に取り付けられていることを確認し、拡張運動および/または持続時間は、より激しい運動を奨励する（ 図4b）。 NOTEは：ステップ6と11を許可追加の品質管理工程で得られた画像の比較は、このように、最小限の動きが顕著に取得したデータに影響を与える可能性があるプロトコル、中に発生したことを確実にすること、により行使に大腿部とコイルのいずれかの変位を可視化します。 </li></ol></li><li>運動後のT1イメージング後、同一の取得パラメータを用いて予備運動軸T1撮像（ステップ4.5）を繰り返します。 <ol><li> PCRを十分枯渇に加えて、運動は筋肉のアシドーシスを誘導しなかったことを確実にするために、エンド運動のpHを測定します。 </li><li> PiとPCR（δPI）との間の化学シフトを測定し、次式60を使用してこれを実行します。 pH値= 6.77 +ログ[（δPI -3.29）/（5.68-δPI）] 注：pHが6.8 61より大きいままであるべきです。 PCR破壊が十分であるが、pHが低すぎると、略し運動試合を繰り返します持続時間および/または減少した強度でえー。 </li></ol></li><li>データを保存します： <ol><li> DICOMファイルとして取得したすべてのスペクトルを保存し、JMRUIを使用して処理するためにそれらをエクスポートします。 </li><li>スキャナーを使用している場合は、「ナビゲータ」ウィンドウ内のすべての分光買収を選択します。 </li><li>以下の下で「アプリケーション」、「ダイコムツール」→「エクスポートMRスペクトロスコピー」を選び、CにDICOM（* .dcm）ファイルを保存：/ユーザー/ MedCom /温度/ CDROFFLINE （このツールは、自動的にこの場所を選択します）。 </li><li>下に「転送」、「オフラインにエクスポート」を選択します。目的の場所に保存します。 </li></ol></li></ol> 5.データ処理と分析62 <ol><li>自由に利用できるJMRUIソフトウェア（; http://www.jmrui.eu/バージョン5.2）でMRスペクトルを分析します。 </li><li>アポダイズ位相はすべての取得時点（ 図5）上の均一性を確保するためにスペクトルをシフトします。 PCRピークが中央に表示されますスペクトル中のT 0 ppmです。 </li><li>それぞれ得られたスペクトルでのPCRピークの振幅を定量化するために、組み込みのアマレスアルゴリズムを使用してください。ピーク振幅は、その特定の時点における表面コイルの感度領域内に、PCRの濃度を表します。 </li><li>計算ソフトウェアでは、収集時間の関数としてのPCR濃度をプロットします。内蔵の計算ソフトウェアカーブフィットツールを使用して、以下の式52、63へのPCr回復期間のデータをフィット： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq1.jpg" /></li><li> （ベースラインのPCR値を記録<img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq2.jpg" /> ）、最も低いPCR（ <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq3.jpg" /> ）、および回復時間（ <img alt="式4" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq4.jpg" /> 。 </li><li>適切な条件がEXER中に満たされていることを確認PCR枯渇、ベースラインPCRおよび最低のPCr間のパーセント差を計算することによりciseセッション。 50％の枯渇 - 理想的な運動セッションが20になります。 注：カーブフィッティングの品質は、R 2値が0.75以上であることを検証することによって確保することができます。 R 2の値が自動的にフィッティングソフトウェアによって計算されます。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

本稿では、骨格筋ミトコンドリア機能のシリアルおよび非侵襲的in vivoでの測定を提供する31 PMRSの検査のための標準プロトコルを記述しています。メタボリックシンドロームとその結果の罹患率および死亡率の増加負担を標的捜査の幅を考慮した場合、プロトコルは、かなりの魅力を保持しています。この31 PMRSプロトコルは、スキャナ最小限の時間を必要とし、市販のMRS設備を備えた任意の中央に被験者における総合的な代謝の研究に組み込むことができます。 プロトコル内の重要なステップ Contraindications- MR検査の前に、潜在的な禁忌の対象を選別することが重要です。典型的なMRの除外基準に加えて、以下は、このプロトコルを実装する前に考慮すべきである：1）同側の膝や股関節インプラント（関係なくOアーチファクトを回避するためにMRとの互換性）、下肢（ 例えば、末梢動脈疾患）への血流や酸素供給を制限2）の条件、抵抗大腿四頭筋の伸展運動を実行するための3）できないこと、およびのために仰臥位に位置する4）できないF約30分。 モーションアーチファクトは、被験者の大腿四頭筋に対して31 Pコイルの動きをreduction-と、テーブルの対象者の大腿部の相対的な動きは最小限にすべきです。コイルが確実に対象者の脚部に固定し、抵抗ストラップがしっかり診察台に固定されていることをことをされていることを確認してください。対象者のかかとは、もはやで5以上に上昇しないことを確実にすることによって、これをテストします。試験のテーブルから蹴り中や運動中のコイルのローテーションがないこと。 取得 対象Quality-運動はに行使すべきPCRにおいて、少なくとも30％の枯渇を勝ち取ります。このプロトコルのために、私たちは非歩行する被験者のために歩行する被験者のための運動の30秒と60秒がこの目標を達成することを決定しました。我々は、非歩行する被験者はキックあたりの小さな力を発揮するため、十分な枯渇のためのより長い間隔を必要とすることを観察しました。 解析-ここで説明する方法は主観性を最小化し、自動化を最大化するためのフレームワークを提供します。スペクトル分析のためのユーザ入力パラメータの選択は、再現性を確保するために慎重に行われるべきです。 修正およびトラブルシューティング スペクトルが騒々しい表示された場合Spectrum-の品質は 、シムボックスは筋肉内に配置されていることを確認してください。信号対雑音比を改善するために、シムボックスのサイズと位置を調整します。必要に応じてテスト買収を繰り返します。 資格でエクササイズのリティが不十分のPCR枯渇の最初の運動の結果は、トラブルシューティングに使用することができますいくつかの変更がある場合：1）ストラップを締めることができ、抵抗を増加させるためには、 2）対象は、運動を増加させる、より速くキックするように指示することができます。または3）持続性運動の持続時間を増加させることができます。しかし、過剰な運動、変化したpH値をもたらすことができるとOXPHOS回復速度61を阻害することができるアシドーシス、につながる可能性があることに注意してください。これは、3分の最大運動時間を制限することによって回避することができます。 テクニックの制限事項 筋生検の分析は、ミトコンドリア含量およびサイズ、ならびにミトコンドリアの最大ATP合成速度などの特定のミトコンドリアの特性の測定を可能にします。しかし、31 PMRSを用いたin vivo測定は、これらの二の集合を表していることに注意することが重要です例えば筋肉に酸素を豊富に含んだ血液の微小血管供給などの余分なミトコンドリアの要因に加えて、矩形の対策、。このように、微小血管系の状態は問題の減少酸素供給やその他の要因に起因している状況では、ミトコンドリアの状態の明確な指標を提供しないであろう。むしろ、OXPHOS及び微小血管の問題のいくつかの組み合わせを反映することができる筋肉の最大酸化ATP合成のin vivoでの状態を示すことになります。 この作業で詳述運動31 PMRSプロトコルの制限は、仕事出力の標準化の欠如です。標準化の欠如は、このように必要な装置、およびこのプロトコルの実装を簡素化します。しかし、このような強度や疲労性、および代謝措置との関係などの他のパラメータの定量的評価を可能にしない犠牲にして。その結果、運動の様々なレベルは、PCRに影響を与える可能性があります根底にあるミトコンドリアの欠陥の重症度を超えて回復時間。一つは十分なのPCR枯渇を確実にすることにより、これらの影響を最小限に抑えることができ、さらに調節可能な抵抗と、測定作業の出力を持つMR-互換エルゴメーターを用いて、作業出力を標準化することができます。 既存または代替方法に関して技術の意義 標準的な代謝運動負荷試験と比較した場合、直接骨格筋におけるミトコンドリア機能を定量化する能力は、31 PMRS技術の主な利点です。侵襲性の筋生検は、シリアルの評価を必要とする調査のため、それはあまり魅力的に付随するリスクにかかわらず、単繊維66での測定値が得られます。近赤外分光法67に基づくアプローチは、特に脂肪のわずか5 mmはNIRS Sを減衰肥満患者において、侵入深さによって制限され得ます20％68によってignal。さらに、この技術は、MRベースの技術によってもたらさ筋肉や他のシステムの多次元的評価には向いていません。また、筋肉のエネルギー特性を定量化するための侵襲的な生検法とは異なり、これは、非侵襲的で非破壊的指標対象集団および治療的介入を評価するために、それは有利な製造、無傷の筋肉に代謝状態の反復測定を可能にします。 将来の応用 この31 PMRS技術を習得した後の潜在的な用途は、特定のミトコンドリアの欠陥や代謝障害の広い範囲のいずれかを伴う疾患の評価が含まれます。貧しい心拍出量の患者では、現在の技術は損なわ機能的能力を識別することができますが、機能障害が発生するレベル（ 例えば、骨格筋、心臓、または肺）を確立することはできません。これは、特にだろうパーソナライズされた治療法を容易にするために、被験者固有の能力が減少の根本原因を特定するために、代謝対策や心肺アッセイと31 PMRSを組み合わせた統合型のプロトコルを開発することは興味深いです。 我々は、ミトコンドリア機能のin vivoでのマーカーの使用から利益を得るであろう重要な標的療法と介入の詳細な例を持っています。標準化された31 PMRSの運動プロトコルは、1は、上記に詳述のような、両方の基本と介入研究における骨格筋ミトコンドリア容量の生体内のマーカーで 、この重要なのより広範な使用のための重要なステップです。

この作業の目的は、非侵襲的な能力の広い範囲を有する個体においてin vivo骨格筋ミトコンドリア機能に測定するための再現性のある方法を概説することです。異常なミトコンドリアの機能障害は、そのようなフリードライヒ失調症などの稀な疾患への老化や糖尿病などの一般的な条件から、メタボリックシンドロームや遺伝性疾患の広い範囲の特徴です。 メタボリックシンドロームとミトコンドリア機能障害 メタボリック症候群は、ミトコンドリアの機能を破壊骨格筋OXPHOSを押し下げ、および骨格筋1、2における異所性脂質貯蔵をもたらすことが示されています。代謝およびエネルギー恒常性を調節する重要な細胞小器官として、ミトコンドリアは肥満3,4の病態生理に関与している、インスリン抵抗性5 </sup&gt;、2型糖尿病（T2DM）6、7、糖尿病関連微小8、9、10、11および大血管合併症12,13、および非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）14、15、16、とりわけO 2酸化還元酵素活性を5：抵抗.Insulinミトコンドリアのトリカルボン酸（TCA）流動速度、ATP合成速度、およびクエン酸シンターゼおよびNADHの減少を含む骨格筋ミトコンドリア活性における重大な変化によって特徴付けられます。 1つの仮説は、これらの変化が著しく、肥満および他の肥満rの間に増強された筋肉中の遊離脂肪酸（FFA）代謝産物の蓄積、に起因するかもしれないということです得意疾患2、17。高架のFFAおよび脂質中間体への筋の暴露は、脂質の酸化経路における遺伝子の発現だけでなく、TCAサイクルと電子輸送チェーン（ETC）18を減少させることができます。脂質の過負荷の設定におけるミトコンドリア骨格筋OXPHOS容量のこの減少は、定量的（ミトコンドリアの内容及び生物発生）の減少19と骨格筋ミトコンドリア20の定性的な機能を伴っています。 FFAに骨格筋や心筋細胞を公開する重度のインスリン抵抗性をもたらし、筋肉で増加したFFAの取り込みは、ヒトおよびげっ歯類21の両方におけるインスリン抵抗性と関連しています。脂質中間体セラミドおよびジアシルグリセロール（DAG）は、プロテインキナーゼCおよびPROTとして、直接のキナーゼの活性を変化させることにより、インスリンシグナル伝達経路を阻害することが示されていますEINキナーゼB 21。したがって、脂質由来分子は、骨格筋のインスリン抵抗性およびT2DMの発症において重要な役割を果たすように思われます。しかし、ミトコンドリアの容量の変化が原因またはインスリン抵抗22の結果であるかどうかは不明のままです。 フリードライヒ失調症およびミトコンドリア機能障害 減少OXPHOSはまた、遺伝的欠陥から生じ得ます。フリードリッヒ運動失調（FA）、遺伝性運動失調症の最も一般的な形態は、ミトコンドリア内鉄蓄積、活性酸素種の産生をもたらすフラタキシンにおける突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患（FXN）遺伝子であり、酸化的リン酸化23の異常、 24、25、26。この重要な発見はwhic、標的治療の開発につながりましたHの目的は、サブ細胞レベルでのミトコンドリア機能を改善します。この理解にもかかわらず、in vivoでの限られた開発、FA臨床研究のための再現性のあるバイオマーカーがありました。実際には、FAにおける標的療法の効果的な評価に重要な障壁は、ミトコンドリア機能の変化を追跡することができないことです。現在の機能的手段は、例えば、心拍出量の減少を識別することができます。しかしながら、それらは、機能不全が起こるレベル（ 図1）を決定することができません。識別し、フリードリッヒ運動失調における疾患の進行を評価するために使用され得るミトコンドリア機能の信頼できるマーカーの開発は、標的療法の関連する機械的影響を評価することが重要です。 減損OXPHOSと心機能不全 異常なミトコンドリア機能、のいずれかの取得または遺伝的には、カルディの発症または進行に寄与し得ます交流機能不全。圧負荷および心不全の条件下では、FFAの一次エネルギー基質優先スイッチがグルコースします。これは、減少したETC活性および酸化的リン酸化27に関連しています。心機能障害におけるミトコンドリアの生体エネルギーの病態生理は、ミトコンドリアの欠陥の主な起源に応じて異なる場合があります。糖尿病および還元基板の柔軟性、エネルギー効率、および最終的には、拡張機能障害28、29につながるような障害の生合成及び脂肪酸代謝のような心筋におけるミトコンドリア異常、代謝症候群をもたらします。心筋細胞30、31の大幅なミトコンドリアの鉄蓄積でFAで、一方、フラタキシン欠乏の結果。鉄蓄積は、&lt;フェントン反応32を介してフリーラジカルの産生をもたらします/ SUP&gt;とフリーラジカル誘発性心筋損傷の可能性が高くなります。ミトコンドリア内鉄蓄積はまた、酸化ストレスに対する感受性の増加および減少の酸化容量30、31に関連しています。フラタキシン欠乏に起因する鉄蓄積とそれに続く異常なミトコンドリア機能は、したがって、FA 33、34で観察された損なわれた心臓のエネルギー特性や心筋症を担当することがあります。骨格筋のミトコンドリア中の還元酸化能力は、運動不耐性に匹敵し、心不全（HF）35で代謝能を低下させたことに注目することも興味深いです。骨格筋OXPHOS容量の測定は、本明細書に詳述するように、容易に実現可能で堅牢です。 HFにおける骨格筋OXPHOSの重要性と相まって、これらの機能は、それ聞くの総合的な研究における魅力的なバイオマーカー作りますトン病36。 減損OXPHOS及び添付の心機能不全は、代謝およびミトコンドリア病の取るに足らない態様ではありません。糖尿病および代謝性疾患を有する対象は、心血管疾患を発症するリスクが高いと心筋梗塞（MI）37、38、39、40、41後の超過死亡率を持っています。 FAの半分以上の被験者は、心筋症、および心臓不整脈や心不全42の多くのダイを持っています。したがって、縮小OXPHOSの定量化は、心機能障害の早期発見と治療のための可能性だけでなく、これらの疾患における主要な臨床負担を軽減することができます。 直接OXPHOS容量を増加させる標的療法は、WHE、対象の治療を改善するための有望な領域でありますTHER代謝機能不全の原因は、遺伝的または後天性です。現在、異常なミトコンドリア機能43を軽減またはプライマリ遺伝的欠陥44を修正いずれかの新たな標的薬の開発は、FAの錯乱生体エネルギー特性を向上させることができます。取得されたミトコンドリア機能不全の場合には、増大した身体活動は、機能45、46、47、ミトコンドリアを向上させることができます。 ミトコンドリア機能の非侵襲的バイオマーカーとして31リン磁気共鳴分光法 かかわらず、試験された治療の、骨格筋の生体エネルギーのin vivo評価に統合され、特に重度の運動不耐性または従来のメタボを受けることができないの被験者に、対象となる介入の影響を評価するための重要なツールです。LICのテスト。体全体の細胞内リン（31 PMRS）に同調磁気共鳴分光法、さまざまな高エネルギー基質に見出される内因性の核は、で磁石の運動回復プロトコルを含む、様々なアプローチを用いて、ミトコンドリアの酸化的能力を定量化するために使用されてきたと筋肉刺激プロトコル48。運動回復プロトコルは規制し、バースト型抵抗と準静的な運動を可能にするストラップとパッドのシンプルな構成にワークロードを測定MRI対応エルゴメーターから複雑で測距装置の様々に依存しています。これらのプロトコルのいずれかの主要な目標の一つは、アデノシン三リン酸（ATP）の需要が最初にクレアチンキナーゼ反応49を介してホスホクレアチンの酵素的分解法（PCR）を介して満たされているエネルギーの不均衡を生成することです。運動の停止時に、ATP産生の速度は、酸化フォーによって支配されますsphorylationとは、ミトコンドリア50の生体内容量の最大値を表します。また、運動後の回復中OXPHOSは、一次速度反応51により説明することができます。 PCRを運動後の回復は、したがって、酸化ATP合成のためのより大きな能力を表すτPCRを小さい値を有する指数関数の時定数（τPCR）をフィッティングすることによって定量することができます。重要な努力が31 ex vivoでに対するPMRSとOXPHOSのより直接的な対策を検証し、この手法52、53、54、55の潜在的な臨床適用性を実証するために行われてきました。 注目すべきことに、この研究で説明されたプロトコルは、臨床的に利用可能なスキャナ上で実施することができ、広く非侵襲性バイオマーカーのOとして確認されていますFミトコンドリア機能56。しかし、神経筋障害や移動度の変化する重大度を持つ個人への適用のために最適化された運動31 PMRSプロトコルは、よく57を確立されていません。明確に定義され、広く-該当する運動プロトコルと31 PMRS技術は、ミトコンドリア機能の基本的な異常を伴う疾患の評価に特に有用であろう。 いくつかの先行研究では、被験者におけるミトコンドリア機能を定量化するために非侵襲的技術の応用を検討しています。例えば、これらの技術は、2型糖尿病の36の被験者における障害OXPHOSを示しています。ロディら。最初のFAを有する被験者にPMRS技術の実現可能性をテストし、1）FAにおける基本的な遺伝的欠陥は、骨格筋OXPHOSを損ない、2）GAAトリプレットの数が繰り返され、骨格筋Oに反比例することがわかりましたXPHOS 33。より最近では、Nachbauer ら。 7科目とFAの治験における二次アウトカム指標としてPMRSを使用していました。 PCr回復時間はロディの初期の作品を再確認し、FAでの異常なフラタキシン発現の効果がPMRS技術58を使用して検出可能であるミトコンドリア能力の低下をもたらすことができることを示す、対照と比較して、被験者において有意に長かったです。 信頼性の高い方法は十分に実現可能な、費用対効果、および再現可能な方法で生体内骨格筋の機能に定義するためには、ミトコンドリアの機能に影響を与える疾患の範囲の主題転帰を改善するために重要です。 この作品は31 PMRSを使用して、骨格筋の生体内最大酸化能力に取得するための堅牢な手順の概要を説明します。内磁石運動プロトコルはよく物理的および関数Aの広い範囲にわたる個人によって許容されますリットルの能力と安価で広く入手可能な装置を使用して簡略化された対象のセットアップを与えます。

<table><tbody><tr><td>1.5 T MR Scanner</td><td>Siemens</td><td></td><td>manufacturer will not affect results</td></tr><tr><td>10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible</td><td>PulseTeq</td><td></td><td>manufacturer will not affect results</td></tr><tr><td>3 fl oz Baby Oil</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td></td><td>manufacturer will not affect results</td></tr><tr><td>Foam triangle cushion (Knee)</td><td>Siemens</td><td></td><td>manufacturer will not affect results</td></tr><tr><td>(3) plastic buckle resistive straps; table to table</td><td>Siemens</td><td></td><td>manufacturer will not affect results</td></tr><tr><td>(1) plastic buckle resistive strap; self-connecting</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy: a tool for measuring in vivo mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in human skeletal muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

再現性の研究 六人のボランティア（男性4人と女性2人、平均年齢：24.5±6.2歳）なし自己報告心臓、代謝、またはミトコンドリア病とは、技術を評価するために、1週間以内に2別の日に説明した31 PMRS運動とイメージング技術のセッションを受けました再現性（ 図6a）。正常なボランティアで行われた研究は、ミトコンドリア機能の定量化で31 PMRS研究の再現性を確認します。 PCR回復時間のブランド・アルトマン分析は、1.03 4.83秒の平均差の標準偏差および4.66（ 図6b）の変化の間、裁判係数を示しています。プロトコルのステップ4で説明したように方法の項に記載の取得や分析プロトコルへの変更は、良質なデータを得るために必要とされませんでした。これらの解像度ultsは、この研究に記載の取得と解析手法の再現性を実証します。 フリードライヒ失調症と非歩行参加者における技術評価 4人の参加者（男性2人と女性2人、平均年齢：35）は、FAと非歩行集団において、その実現可能性を評価するために、この研究に記載さ31 PMRSの運動とイメージング技術の単一のセッションを受けました。これらの対象は、ステップ5.6に示す回復パラメータに適合するように、PCRの十分な枯渇を得るためで、磁石の演習を行うことが可能でした。しかし、長い運動時間（60から90秒）が十分のPCrレベルを枯渇させるのに必要でした。また、この疾患の特徴である筋肉制御の進行性の喪失によって引き起こされたフィットの周りの振動は、（ 図7）が認められました。これらのためのubjects、我々は不要な動きを制限するために、3ストラップの合計を与え、膝と足首の間に2つの追加の抵抗のストラップを使用していました。これらの結果は、非歩行被験者におけるPCR回復時間を得るために、取得および分析手法の実現可能性を実証します。しかし、良質のデータを得るために必要な修正は、さらなる評価及び標準化の研究が必要であることを示しています。 フィージビリティ・スタディ 心臓リハビリテーションと二次予防（CRSP）のプログラムに言及なし自己申告心血管疾患とナインボランティアと15の被験者は、地元の機関審査委員会（IRB）承認の研究に登録しました。私たちは、心臓血管の健康やメタボリック症候群の重症度の指標として、いくつかの臨床的な値を得ました。左室駆出率は、CRSPの被験者（56 10％）中で保存しました。マCRSPを開始する前に測定ximum心血管運動能力は、（3.05 0.6 0.8 3.4 対代謝当量メッツ、P = 0.4）とし、糖尿病でない被験者において同様でした。それぞれが被写体を登録し、CRSPを開始する前には、以前に64を説明し、この研究に記載31 PMRSの運動とイメージング技術、および筋肉内脂肪の定量イメージングを受けました。 PCR回復の時定数が長く（32.1 7.4秒、P = 0.05 対 41.9 1.4）で、筋肉内脂肪率は、対照に対してCRSP科目（2.54 0.6％ 対 8.7 2.9、P &lt;0.001）に高かったです。筋肉内脂肪の割合は、糖尿病（P = 0.4）とないCRSP被験者において同様であった、とのPCR回復の時定数は、糖尿病のないものでやトレンドのコントロール（P = 0.03で対糖尿病の被験者に長くなる傾向がありましたグループ間で）。予備的なフォローアップのデータががかなり悪化の改善を示唆しています糖尿病を有する被験者におけるメッツポストCRSPがないものと比べて（デルタ= 1.0 0.8対4.0 2.4、P = 0.06; 図8）。これらの結果は、既知の代謝性疾患を有するとせずに被験者間の骨格筋OXPHOSの違いを定量化するために、この技術の実現可能性を実証します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54977/54977fig1.jpg" /> 図1.ミトコンドリア、骨格筋、および心肺システム。 ミトコンドリア、骨格筋、心臓出力、換気、および機能的能力との間のリンクの表示が示されています。ミラニら 65から再生。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54977/54977fig2.jpg" /> 2. マテリアル図 。 必要な材料は、1）三角形のクッションを含みます<strオング&gt; 2）10-cmの31 P-調整された表面コイル、3）テーブル・ツー・テーブルの接続抵抗のストラップ、4）自己の接続抵抗のストラップと、ベビーオイルの5）小瓶を送受信。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54977/54977fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54977/54977fig3.jpg" /> 図3. ポジショニング。 A）被験者は仰臥位、足、第一の位置に結像されます。 31 Pコイルは、左大腿四頭筋上に配置されます。抵抗ストラップは、膝の上下に配置され、テーブルに取り付けられています。単一のストラップを一緒に膝の上に両足を結合させるために使用されます。 B）スライスの位置は、第二定位のために示されています。スライスがロカに集中していることに注意してくださいベビーオイルボトル化、およびスライスは全体の大腿四頭筋をカバーしています。 C）31 PMRS用シムボックスの配置が示されています。このボリュームは、大腿四頭筋に直接コイルの下に置かれ、表面コイルの領域内に十分な信号と適切なシミングを保証する深さを覆っています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54977/54977fig4.jpg" /> 4. データ取得 図 。 A）安静時の代表的な31 Pの取得が示されています。 PCRは、大規模な単一ピークであり、かつ最小のノイズが（左）があります。二つの大きなピークは、PiとPCR（右）におけるプロトコルの結果の運動部分の間の典型的な取得。運動が進行するにつれて、パイおよびPCRのピークはそれぞれ、増加および減少します。 B）休息と運動後でのPCRピーク高さの比較は、少なくとも約30％の減少を明らかにすべきです。このC<html> alculationは、運動研究が正常に完了したことを確実にするために、スキャナのコンソールで実行する必要があります。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54977/54977fig5.jpg" /> 図5. 分析。 代表的なスペクトルの位相補正及びアポディゼーションを示しています。 A）非段階的なピークを示す生のスペクトルとピークを不明瞭ノイズの存在を。 B） 第 0 を示すスペクトル-と第1 -order位相補正。中心周波数に位置したPCRピークは容易に識別可能であるが、他の代謝産物のピークはまだ隠されています。 C）ノイズの低減と3 ATPピークのより良い視覚化とPDEとPiのピークが生じるローレンツ線形状とアポダイゼーション後のスペクトル、。このスペクトルはアマレスツールでピーク定量化のための準備ができています。<html>ファイル/ ftp_upload / 54977 / 54977fig5large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54977/54977fig6.jpg" /> 健常者で 6. 31 PMRS 図 。 A）この図は、急速な準静的膝伸展運動との枯渇後のクレアチンリン酸（PCR）濃度の回復を示しています。行は定数τが示さ回復時間と、ステップ5.6で説明した指数の回復機能のフィットを表します。この時定数は、ミトコンドリアの酸化機能の十分に確立されたバイオマーカーです。 B）31 PMRS技術の再現性のブランド・アルトマン分析は、試験の間のPCR回復時間のために1.03 4.83秒の平均差の標準偏差を示しています。変動係数は4.66です。https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54977/54977fig6large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54977/54977fig7.jpg" /> 図 非歩行する被験者7. 31 PMRS。 非歩行対象の31 PMRS試験からの代表のPCR回復曲線が示されています。 64％をPCR枯渇がこの運動プロトコルを用いて達成されたことに注意してください。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54977/54977fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/54977/54977fig8.jpg" /> CRSP科目8. 31 PMRS 図 。 PCR RECOVの比較ERY時間は順次貧しいミトコンドリアの酸化調整能力、非糖尿病、および糖尿病被験体を示しています。エラーバーは標準偏差を表します。

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Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール<em&gt;インビボ</emヒト骨格筋における&gt;ミトコンドリア酸化的リン酸化能力

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

11.7K ビュー.  The Ohio State University. This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle. 

ビデオ: Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

発生生物学

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and physical exam alone, however the clinical presentation can vary greatly depending on the extent of injury, the patient's pain tolerance, etc. In patients with muscle injury or muscle disease, assessment of muscle damage is typically limited to clinical signs, such as tenderness, strength, range of motion, and more recently, imaging studies. Biological markers, such as serum creatine kinase levels, are typically elevated with muscle injury, but their levels do not always correlate with the loss of force production. This is even true of histological findings from animals, which provide a "direct measure" of damage, but do not account for all the loss of function. Some have argued that the most comprehensive measure of the overall health of the muscle in contractile force. Because muscle injury is a random event that occurs under a variety of biomechanical conditions, it is difficult to study. Here, we describe an in vivo animal model to measure torque and to produce a reliable muscle injury. We also describe our model for measurement of force from an isolated muscle in situ. Furthermore, we describe our small animal MRI procedure.

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo animal model of injury is described. The method takes advantage of the subcutaneous position of the fibular nerve. Velocity, timing of muscle activation, and arc of motion are all pre-determined and synchronized using commercial software. Post injury changes are monitored in vivo using MR imaging/spectroscopy.

アン in vivoで</em収縮で誘起された損傷と回復の非侵襲的モニタリングの>齧歯類モデル

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

医学

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

生化学

<meta charset="utf8"></head><body>ブラシトカゲ肝臓ミトコンドリアにおけるミトコンドリア機能評価

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of metabolic pathways. Therefore, experimentally assessing mitochondrial functionality can provide insight into variations among different populations or disease states. Additionally, it is valuable to assess whether isolated mitochondria are healthy enough to proceed with experiments. One characteristic often used to compare mitochondrial function in different samples is the rate of oxygen consumption. Oxygen consumption and subsequent calculation of the respiratory control ratio in either intact cells or mitochondria isolated from tissue can serve all three purposes. Using mitochondria isolated from the livers of brush lizards in conjunction with a phosphorescent probe that is sensitive to the fluctuations in oxygen concentration of a solution, we measured oxygen consumption using a fluorescent plate reader. This method is not only quick and efficient but also can be conducted with a small amount of mitochondria and without the need for specialized equipment. The step-by-step protocol described here increases the accessibility of mitochondrial functional assessment to researchers.

<meta charset="utf8"></head><body>プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

Assessment of oxygen consumption provides integral information about mitochondrial function. Using a phosphorescent probe with a fluorescent plate reader, accurate and reproducible data can be obtained easily without specialized equipment. This assay enables any lab to measure the oxygen consumption of isolated mitochondria and calculate respiratory control ratios.

プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

骨格筋血管カップリング、酸化容量、および 'ワンストップ ショップ「近赤外分光法を用いた微小血管機能

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

生物学

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring mitochondrial function is fundamental in biomedical research. Skeletal muscle is a robust source of mitochondria, particularly in animals with a very high aerobic capacity, such as horses, making them ideal subjects for studying mitochondrial physiology. This article demonstrates the use of high-resolution respirometry with concurrent fluorometry, with freshly harvested skeletal muscle mitochondria, to quantify the capacity to oxidize substrates under different mitochondrial states and determine the relative capacities of distinct elements of mitochondrial respiration. Tetramethylrhodamine methylester is used to demonstrate the production of mitochondrial membrane potential resulting from substrate oxidation, including calculation of the relative efficiency of the mitochondria by calculating the relative membrane potential generated per unit of concurrent oxygen flux. The conversion of ADP to ATP results in a change in the concentration of magnesium in the reaction chamber, due to differing affinities of the adenylates for magnesium. Therefore, magnesium green can be used to measure the rate of ATP synthesis, allowing the further calculation of the oxidative phosphorylation efficiency (ratio of phosphorylation to oxidation [P/O]). Finally, the use of Amplex UltraRed, which produces a fluorescent product (resorufin) when combined with hydrogen peroxide, allows the quantification of reactive oxygen species production during mitochondrial respiration, as well as the relationship between ROS production and concurrent respiration. These techniques allow the robust quantification of mitochondrial physiology under a variety of different simulated conditions, thus shedding light on the contribution of this critical cellular component to both health and disease.

Horses have an exceptional aerobic exercise capacity, making equine skeletal muscle an important tissue for both the study of equine exercise physiology as well as mammalian mitochondrial physiology. This article describes techniques for the comprehensive assessment of mitochondrial function in equine skeletal muscle.

ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール

要約

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ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

アン in vivoで齧歯類モデル

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

骨格筋血管カップリング、酸化容量、および 'ワンストップショップ「近赤外分光法を用いた微小血管機能

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール

要約

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ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

アン in vivoで齧歯類モデル

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

骨格筋血管カップリング、酸化容量、および 'ワンストップ ショップ「近赤外分光法を用いた微小血管機能

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

骨格筋血管カップリング、酸化容量、および 'ワンストップショップ「近赤外分光法を用いた微小血管機能