Name: studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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1.細胞の調製<ol><li> 成長する細胞 <ol><li> D.を育てます組織培養プレート中の光下に23℃でAX培地中discoideumの細胞。 75％の密集度以上の高い密度で細胞を維持することは避けてください。 注：最適な応答はストレスを加熱するために、細胞が指数増殖期にあることが必要と定常期に達していてはいけません。 </li><li>撮影前日、1×10 4細胞/ mlに低い蛍光媒体（LFM）に分割細胞。 注：このステップは、AX媒体に起因するバックグラウンド蛍光を低減する必要があります。インキュベーション時間は、2時間を最小限に抑えることができます。しかし、AX媒体に取り小胞は、依然として2時間後にいくつかのバックグラウンドシグナルを生成することができます。 </li></ol></li><li> 顕微鏡用細胞を準備 <ol><li>撮影前に、LFMにおける組織プレートから収穫細胞とは、ガラス底皿に細胞の十分な数を転送します。 注：通常、1×10 5細胞/ mlで十分です。実験は、（8時間以上）、長い撮像期間を必要とする場合は、細胞数を慎重D.として、調整する必要がありますdiscoideumの細胞が発達サイクルに移行し、栄養素が低い一方で細胞数が高い場合にストリーミングと集計を開始します。 </li><li>細胞は、20分間沈降することを可能にします。慎重に新鮮な培地で使用した培地を交換することにより、非定住細胞を除去します。 </li></ol></li></ol> 2.イメージング注意：このプロトコルは広視野システムに同様に共焦点顕微鏡のセットアップに使用することができます。目的をカバーする温度制御インキュベーションボックスと顕微鏡ステージの使用は人、まだ温度制御のために必須ではありません。熱応力が行われた場合、インキュベーションボックスの温度を40℃に、 例えば 、実験に使用される最高温度に設定されます。そうでなければ、温度は25に設定されています6; C。温度変化は、撮像時の温度の変化が焦点に影響を与えることができるように、システムが適応できるようにするために事前になされるべきです。 注記：画像化の間、温度は冷却室を使用して制御されます。非ストレス細胞を画像化するための初期温度は23℃です。熱ストレス条件下では、温度を所望のレベルに応じて増加します。冷却室でピエゾ素子は、温度変化に非常に迅速に対応することができます。しかし、画像の焦点は、（それが温度変化に応じて、最大で20μmであることが逸脱する可能性が）わずかに変化します。使用顕微鏡は、ハードウェアのオートフォーカスが装備されていない限り、このようにマニュアルリフォーカスは、画像取得の最初の数分以内に必要とされます。 <ol><li> 非ストレス条件下での画像取得 <ol><li> 23℃での非ストレス条件下での画像セルは、ビューの6分野（のFOV）の最小値を取得します。 注：非ストレス条件はvisualizすることができます短い時間経過（5月30日分）又は代表静止画の取得を記録することにより、いずれかのエド。各条件または細胞株の場合はビューの6分野（のFOV）の最小値を取得します。 注：個々の細胞が関心がある場合には、FOVの中央に各セルを配置し、中央に目的の細胞を含むFOVと3×3のタイルのシリーズを記録D.。 discoideumの細胞は運動性であり、FOVの外に移動することがあります。しかし、3×3のタイルシリーズは、潜在的に、目的の細胞によって探求面積を増加させ、それは〜6時間の時間経過期間の追跡可能のまま。 </li><li>セルの全体積をキャプチャするために1から0.25ミクロンのステップで最大7ミクロンのzスタックを取得します。 </li><li>細胞の総数を評価するための基準明視野像を取得します。 </li></ol></li><li> 熱ストレスのための画像取得 <ol><li>製造者の指示に従って30℃まで冷却室の温度を調整します。&lt;/李&gt; <li>温度表示が所望の値に達した後、明視野チャンネルに手動で再集束し、時間経過を開始する前に、すべての記録のFOVをご確認ください。 </li><li>時点間の5〜10分の時間間隔で熱ストレスの4時間の時間経過を開始します。最初の2つの時点の取得中に焦点を当て、正しいかどうかを確認します。 </li></ol></li><li> 回復中の画像取得 <ol><li>熱ストレスの後、戻って23℃まで温度を下げ、調整して、手動で再び焦点を合わせるために温度表示を待ちます。 </li><li> 10-20分の時間間隔で8-10時間の回復期に記録しタイムラプスムービー。最初の時点の取得中に焦点を当て、正しいかどうかを確認します。 </li></ol></li></ol> 3.画像解析注：細胞質の病巣を保有する細胞の数を定量化するためには、各時間における細胞の総数および細胞質病巣を有する細胞の数を評価しますフレーム。明視野画像から細胞を分割することの難しさを、定量化を手動で実行する必要があります。以下では、データ分析は、フリーの画像処理パッケージ（（http://fiji.sc/Fiji）について記載されている。それは、「セルカウンター」（http://fiji.sc/Cell_Counter）プラグインが必要です。 <ol><li> 細胞の総数を評価 <ol><li> 「ファイル」と「開く」をクリックすることにより、明視野画像スタック（XYT）をロードします。 </li><li> 「セルカウンター」プラグイン（ - &quot;セルカウンター」「プラグイン」）を開きます。 「初期化」をクリックすることで、画像スタックをロードします。 </li><li>適切なボックスを刻むことにより、カウンタの適切なタイプを選択します。 注：全細胞の数および細胞質病巣を有する細胞のためのカウンタとしてタイプ2用のカウンタとして使用するタイプ1。すべてのセルを数えます。 </li><li> 「保存マーカー」をクリックしてマーカーを保存します。 </li></ol></li><li> 細胞質の病巣を有する細胞の数を評価します <ol> &lt;LI&gt;蛍光画像hyperstack（XZYT）（「ファイル」 - 「開く」）をロードし、「Z-プロジェクター」（画像/スタック）を使用して、最大値投影を行います。 </li><li> 「セルカウンター」プラグインを開きます。 「初期化」をクリックすることにより、得られた画像スタック（XYT）をロードします。 </li><li> 「ロード・マーカー」をクリックしてマーカーをロードします。 注意：参照画像と蛍光スタックのファイル名が同一である必要があります。必要に応じて、画像スタックを初期化する前にそれに応じて変更します。 </li><li>適切なマーカーの種類を選択します（3.1.3を参照）および細胞質病巣で細胞を数えます。既存のマーカーは個々の細胞の位置のためのガイダンスとして使用することができます。 </li><li> 「結果」をクリックすることで、スライスあたりのカウント数を取得し、さらに計算のために他の場所でカウントを保存します。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum.">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li><li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+of+a+model+organism:+progress+with+Dictyostelium.">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li><li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+finds+new+roles+to+model.">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li><li>M&#252;ller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+system+-+substantial+share:+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine.">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li><li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q/N-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation.">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li><li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+in+Dictyostelium:+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem.">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li><li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms.">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li><li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+misfolding.">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li><li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium.">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li><li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+yeast.">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li><li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+response+of+Dictyostelium.">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで説明するプロトコルは、熱誘発ストレスに応答して、目的の特定のタンパク質の挙動を研究するために使用することができます。 30°DのCは、熱ストレス応答を誘発することが報告されており、これらの条件下で生存能力の温度上昇discoideumのが著しく低減されます。 修正 プロトコルは、同じストレス条件下で異なるタンパク質の挙動を比較するために修飾することができます。このため、同一の蛍光タグを有する異なるタンパク質を発現する細胞は、四室皿（セクション1.3.1）のように、マルチウェルディッシュに移します。プロトコルはまた、GFPまたはRFPなどの異なるマーカーを有するタンパク質を同時発現する細胞に適用することができます。これは、タンパク質の品質管理（PQC）システムのさまざまなコンポーネントの動作を監視するために使用される例であることができます。 GFPタグ付き凝集マーカーおよび異なるRFPタグPCQ成分を発現する細胞は、マルチウエルを用いて観察することができイメージングのために皿。これは、同じストレス条件（温度上昇/低下の速度、温度上昇/低下の持続時間）を保証し、比較研究が可能になります。 また、プロトコルは、熱ストレス応答のPQCシステムの影響を研究するために使用することができます。成分の活性は、ノックアウトまたは過剰発現などの遺伝子ツールを使用して、発現レベルを変化させることによって、または市販の特異的阻害剤6を使用することによって調節することができます。プロテアソームは、増殖培地にMG132（100μM）またはラクタシスチン（10μM）を添加することにより抑制することができます。シャペロンHsp90は、ゲルダナマイシン（6μM）またはラディシコール（10μM）を用いて阻害することができます。我々はこれまでの我々の実験設定で、阻害の有効性を確認することができませんでしたが、シャペロンHsp70が、VER-155088に抑制することができます。阻害剤は、イメージングの前に一日を追加する必要があり、細胞を14時間インキュベートします。 Criti<html>プロトコル内のCALのステップ 熱による摂動を評価するための重要なステップは、イメージング実験に先立って、細胞の状態です。酵母での研究は、細胞が定常期13の間に環境ストレスの様々な耐性を獲得することを示しました。 D.あれば我々はまた、かかる熱応力を最小限の応答性を観察しましたdiscoideumの細胞は、イメージング前に定常期に達しました。したがって、一定の細胞数&lt;5×10 5細胞/ mlを維持することが重要です。 また、高い細胞数はDの栄養サイクルからの移行を誘導することができますこのようにストレスを加熱するために異なる応答につながるかもしれない飢餓経路を、トリガ、発達サイクルにdiscoideumの 。高い細胞数は、熱ストレス、ストリーミング後の回復期に到達すると、細胞が焦点から外れるように凝集細胞は、データ分析を妨害し得る場合（ 図4参照）。 コンテンツ &quot;&gt;テクニックの制限 焦点の損失は、プロトコルのボトルネックです。温度変化の間、焦点面はすぐに温度を変更した後の時間の手動再収束を必要とする、大幅に移行することができます。焦点のジャンプは時々時点間の時間が長い場合は特に、ソフトウェアのオートフォーカスにより克服することにはあまりにも極端なことができます。使用される顕微鏡は、ハードウェアオートフォーカスが装備されている場合は、このボトルネックを回避することができます。 既存の方法に関して技術の意義 このような目標や顕微鏡ステージや温度制御ステージと客観襟をカバーするエアコン付きの客室、温度制御インキュベーションボックスの使用など、既存のセットアップと比較して、冷却室の使用は、周囲のより正確な制御を提供します温度。冷却室でのペルチェ素子は、一定かつ均一テムを維持することができます実験を通してたは温度。古典的なセットアップでは、局所的な温度差は、異なる観測成果につながる可能性があります。古典的なセットアップは、特に温度を下げ、誘導された温度変化に非常にゆっくりと適応しながら、また、それは、温度誘導性の変化に迅速かつ迅速に対応することができます。冷却室でペルチェ素子はまた、15℃または40℃のような温度に到達すると、古典的なセットアップよりも広い温度範囲（15〜40°C）を覆うことができることは非常に困難です。 細胞性粘菌は、光毒性に特に敏感です。以前の研究では、光毒性を低減するために捕捉剤としてアスコルビン酸を使用します。しかし、長い撮影期間は追加の補充を必要とします。また、アスコルビン酸の使用が関心のメカニズムは抗酸化サプリメントの影響を受けていない研究に限定されています。我々は、温度制御されたイメージング代替APPRとして使用できることを提案しますoachは、光毒性を最小限にし、さらに、毒性を減少させるために、アスコルビン酸の添加と組み合わせることができます。 光毒性効果は、冷却室を使用して23℃の一定かつ均一な温度を提供することによって最小限に抑えることができます。温度制御を使用して画像化する細胞は、より長い期間のための光毒性は、そのような細胞の丸みの少ない徴候を示します。これはまた、より高い強度、より小さな時間間隔またはビュー（FOVの）の複数のフィールドでイメージングを可能にします。 一般的適用 高温での熱応力は、異なる熱ストレス応答14を誘発することが示されています。従って、34℃又は37℃に温度を上げると、異なる応答を誘導する可能性があります。適用温度ストレスに加えて、特定のストレス状態の持続時間は、応力を加熱するため、即時応答または長期適応を研究するために修飾することができます。 一般に、記載されたプロトコルをすることができますアプリケーションの広いセットに拡大しました。正確な温度制御がかなり光毒性効果を減少するため、プロトコルは、高い露光時間および/またはより高い励起光強度を必要とする設定などで、低い発現レベルでタンパク質を可視化するために、または短い時間間隔と組み合わせて使用することができますタイムラプスイメージングの間、 例えば 、イメージングの間。これらの設定は、光のzセクションの多数を必要とすることも、セル全体にわたるイメージング・オブジェクト、 例えば 、微小管のために有利であり得ます。

細胞性粘菌食作用によって取り込まれる細菌や他の微生物を餌孤独な土壌生活アメーバ、です。それは、その発見以来、1研究の主要な分野となっているユニークで顕著なライフサイクルを有します。多細胞の開発2および走化性3の分子基盤の初期の関心はすぐに細胞運動、細胞極性、先天性免疫に焦点を当てた研究によって補完されました。また、D. discoideumのは、生物医学研究の4,5のためのモデルシステムとして導入されました。 最近、我々はDを設立しましたdiscoideumのタンパク質品質管理（PQC）システム6,7を研究するための新たなシステムとして。そのプロテオームは、タンパク質品質管理8への課題となって凝集しやすいプリオン様タンパク質、に富んでいます。 D.かどうかを調べるために、 discoideumのは、その高度AGを制御するために、特別な分子機構を開発しましたgregationが発生しやすいプロテオーム、我々は通常の成長条件の下で、ストレス時の両方で凝集しやすいマーカータンパク質の挙動を研究しました。このような熱応力等の応力条件は、タンパク質ミスフォールディング9の速度を増加させるために使用することができます。したがって、我々は、温度変化を誘導し、同時にマーカータンパク質の挙動をたどることができ、システムを探していました。この目的のために、我々は、熱ステージインサート（冷却室）を用いてペルチェ制御加熱生細胞イメージングを組み合わせました。この方法では、我々は、一定で均一な温度を維持するだけでなく、迅速な、まだ正確な温度変化を誘発させました。 生細胞イメージングはDの生物学的プロセスの多様な研究するために使用されますdiscoideumの 。しかしながら、このアプローチは、2つの主要な制約に直面しています。最初に、細胞は、このように個々の細胞の追跡は、多くの場合、大面積の画像化を必要とする、高い運動性を表示し、視野の外に移動する傾向があります。セルの移動することができます寒天オーバーレイ10によって減少させることが、しかしながら、これらの条件は、生存率の減少に起因する長期的イメージングのために適していません。第二に、D. discoideumの細胞は、細胞の丸めと有糸分裂停止11その結果フォト毒性、特に高い感度を示します。前のプロトコルは、ラジカルスカベンジャーと露光時間12の減少としてアスコルビン酸を添加することによって、この問題を取り上げました。関心対象のタンパク質を低レベルで発現され、弱い蛍光信号を示している場合、後者は重要であることができます。著者らはまた、エアコン付きの部屋で撮影したり、客観的かつ顕微鏡ステージ12をカバーする温度制御インキュベーションボックスを使用してのいずれか21℃の一定温度を提供することを示唆しています。 ここでは、23℃に設定した冷却チャンバを使用することにより改善された温度制御を備えた方法を記載しています。大幅に私たちのセットアップを撮像中に光毒性に対する耐性を向上させます。それより高い露光時間およびより高い励起光強度の使用を可能にします。時間間隔は、撮像された位置の数および使用される露光時間に対して慎重にバランスをとる必要があり、これは、タイムラプス撮影中に特に重要です。画像形成された位置の数を増加させる可能性も広い撮像領域のカバレッジを可能にし、より長い期間にわたって個々の細胞の追跡を容易にします。

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

記載の撮像プロトコルは、アメーバD.で凝集しやすいプリオン様タンパク質の挙動を分析するために使用することができます熱ストレス中discoideumの 。 図1は、30℃（ 図1B）での熱ストレスの2時間後ストレス回復の6時間後に、通常の増殖条件（ 図1A）の下での細胞中のGFPタグ付きポリグルタミンタンパクQ103の分布を示して通常の成長条件（ 図1C）での成長。 30℃〜23℃の温度上昇時には、Q103-GFPマーカーは、点状構造に拡散分布から合体します。常温で応力解放と成長すると、これらの構造が溶解します。 Q103-GFPの再分配および熱ストレスによって誘導される細胞質ゾル病巣の形成は、画像解析を用いて定量することができる。 図2Aは、フィジー、プラグイン「Cを使用して、個々のFOVの分析を示しますエルカウンター」。 図2Bは、熱ストレス応答の定量化を示す。これは継続的な熱ストレスとの数の細胞質ゾルQ103-GFP病巣の増加が。熱ストレス時には、タンパク質の品質管理（PQC）システムは、このようにaggregation-、圧倒されていることを示していますこのようなプリオン様タンパク質Q103としてやすいタンパク質がサイトゾル病巣ますます集合溶解状態に維持することができない。細胞はまた、特徴的な丸めを示し、 図1Bに示すように、応力除去後のサイトゾル病巣の減少は、凝集していることを示唆していますタンパク質が溶解されています。 結像品質は、最初の細胞密度に敏感である。 図3は、適切な初期細胞密度（ 図3A）と高い初期細胞密度（ 図3B）を比較して、ストレス回復後の細胞の一例を示しています。初期細胞密度が高すぎる場合、細胞の星テッド図3bに示すようにストリームを形成します。細胞などのその後の定量化に困難を課しているこれは、焦点面の外に移動しました。 記載された方法は、上述したように温度による変化を監視するために使用することができます。生理的な成長温度で撮影。 図4は、空調室内の温度制御なしで撮像された冷却室（ 図4A）で、23℃で撮像された細胞の比較および細胞を示しているときにセット、光毒性を低減するためにも使用することができます25°C（ 図4B）へ。励起光に対する一定の曝露の際に、細胞は、温度制御された条件下で撮像されていないときに切り上げます。細胞の形状の変化は、ストレスを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> 図1： <strong&gt;凝集しやすいプリオン様タンパク質は、熱ストレスの間にそれらの細胞分布を変更します。GFPタグ付きポリグルタミンが豊富なハンチンチンエクソン1（Q103）が恒常AX2-214 D.で表現されていますdiscoideumの細胞（反転グレースケールルックアップテーブルに示されたGFPシグナル）。 （A）は 23℃で通常の増殖条件下で、Q103-GFPは、拡散細胞質に分布しています。 （B）30℃での熱ストレスの2時間後、Q103-GFPは細胞質ゾル病巣（赤い矢印）に合体します。細胞は特徴的な形状変化を示し、切り上げます。 23℃での応力解放及び成長時（C）は 、サイトゾル病巣が溶解します。 6時間後、何のサイトゾル病巣は観察されないことができます。スケールバー=10μmである。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2： 熱誘導サイトゾル病巣形成の定量無料の画像処理パッケージフィジーとプラグインの「セルカウンター」を使用して、細胞の（A）の分析。細胞（1型、ブルーカウンターマーカー）の合計量は、明視野画像において決定されます。マーカーは、GFPチャネルにロードされ、細胞質のフォーカス（タイプ2、赤カウンタマーカー）を有する細胞の数が決定されます。 （B）30℃での熱ストレスの3時間および23℃での応力回復の3時間（N =ビュー、エラーバー= SDの4分野）後病巣の定量。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html>グラム&gt;図3： 長期的タイムラプスイメージング上の細胞密度の影響初期細胞密度&lt;10 5細胞/ mlで撮像された（A）細胞。 30℃での熱ストレスの3時間および23℃でのストレス回復の6時間後、細胞はまだ栄養サイクルと分裂に残ります。ごく少数の細胞が焦点面を終了します。 （B）細胞は、初期細胞密度&gt; 10 6細胞/ mlで画像化しました。イメージング（Aのように設定）の9時間後、細胞は、発達サイクルに入り、ストリーミングと集約開始しました。凝集体中の細胞を明確に区別することはできません。細胞の大部分は、焦点面から出て、分析することができません。スケールバー=10μmである。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> .JPG &quot;/&gt; 図4： 光毒性効果に対する温度制御の効果 23℃の温度制御で10分間撮像された（A）細胞：6視野、zスタック（0.5μM間隔、試料の厚さ8μM）、時間経過（総時間10分経過し1分）、GFPチャンネル（0.07ミリ秒の露光時間、10％のレーザ強度）、RFPチャネル（0.1ミリ秒の露光時間、10％のレーザ強度）。細胞は光毒性ストレスに関連する特徴的な形態学的変化の兆候を示しません。温度制御せずに10分間画像形成された（B）細胞（Aと同じ条件）。細胞はストレスを示す、光毒性誘発される丸めの兆候を示します。 =10μmのスケールバー。細胞は、100×/ 1.4の開口数（NA）を目的とした顕微鏡に基づいて、システム上で画像化しました。画像は、1×1ビニングを用いて1,024×1024ピクセルファイルとしてCCDカメラを用いて収集しました。4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

タンパク質の品質管理システムを学びます<em&gt; D。 discoideumの</em&gt;温度制御された生細胞イメージングを用い

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.2K ビュー.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

発生生物学

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Caenorhabditisエレガンスにおける自動包接計数を用いた生体内のタンパク質凝集動態のモニタリング

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

生化学

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

神経科学

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

生物学

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージングのための柔軟なチャンバー

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

生物工学

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

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