この作品は、リーバーヒューム信託の助成金（RPG-2012から708）とGAWにBBSRCの助成金（BB / M00709X / 1）によって賄われていました。

1.コロニー、飢餓時代からミツバチをキャプチャ注：ここで説明する実験は、 セイヨウオオマルハナバチのオーダックスとニューカッスル大学、英国で行われました。複数の（2-3）、商業的に購入したコロニーは、治療ごとに使用しました。コロニーは、実験室条件一定の暗闇の中で（25±2℃、28±2％RH）でのベンチ上で維持されており、ミツバチ収集花粉や糖溶液自由摂取させました。 <ol><li>終了すると、捕獲されたことが1ハチのためだけに十分な長さの植民地に門を開いた後、穴のあいたプラスチック製の栓でプラスチックバイアル（7センチ、2.8センチメートル内径）を使用して、個々の労働者マルハナバチを収集します。 </li><li>実験の前に、個別にプラスチックバイアルに2-4時間、すべてのマルハナバチを餓死し、完全な暗闇の中で、室温で保管してください。 </li></ol> 2.ホールディングチューブ、Hにミツバチを転送abituationフェーズ<ol><li>飢餓期間の後、保持管にプラスチックバイアルから直接熊蜂を転送します。溶融により内部の固定;：先端に掘削さ4ミリメートルの穴とスチールメッシュ（高さ30ミリメートル8ミリメートルベース）の作品で、;：保持管は、修正された15ミリリットルの遠心分離管（直径17ミリメートル119ミリメートル長）であり、加熱された解剖スチール針とチューブのプラスチック。 </li><li>歯科用ワックスとポリスチレンホルダーにマルハナバチを含む保持管を修正しました。保持管の両側に段ボールの2作品を修正します。これは実験に干渉する可能性がある視覚刺激からミツバチを保護することです。 </li><li> 5センチメートル保持管の先端の上にデジタル顕微鏡カメラを配置し、互換性のあるノートパソコンにカメラを接続します。 </li><li>少なくとも保持筒先端の最初の18 mmは、ビデオフレーム内にあるように保持管を調整します。実験の前に、3分間の馴化期間を開始します。 </li></ol> 3。事前テストフェーズ：スクロースのドロップを提示<ol><li>ショ糖溶液（〜3.5μlを、脱イオン水に溶解し500mMのスクロース）の液滴を含むメスアダプタにシリンジを接続します。吻の延長をやる気にさせる保持管の先端部の内部のショ糖を提示します。 </li><li>ショ糖液滴を消費するために5分まで熊蜂を与えます。液滴が消費されない場合は、実験からマルハナバチを削​​除します。 </li><li>馴化期間後に録画を開始します。本研究では、吻活性は、26.7フレーム/秒-1 25X倍率とで記録しました。 </li></ol> 4.テストフェーズ：テストソリューションを提示します<ol><li>試験溶液に100μlのマイクロキャピラリーチューブを埋めます。シリコンチューブ（6センチの長さ、内径1ミリメートル）の作品にそれを接続し、マイクロマニピュレーターにそれを修正。 <ol><li>別のシリコンチューブにオスアダプタを介してチューブを接続します（6センチの長さ、内径4ミリメートル）、WHIchがピペットの電球として機能します。 </li><li> 5〜10ミリメートル離れて保持管の先端からマイクロキャピラリーチューブを置きます。静かにマイクロキャピラリーチューブの先端の供給溶液を維持するためのチューブを絞ります。 </li></ol></li><li>熊蜂はショ糖液滴を消費した後、すぐに500mMのスクロース溶液を含む注射器を取り外します。 </li><li> 2分間の試験フェーズを開始するとき熊蜂の口吻接点マイクロキャピラリーチューブ内の溶液。 <ol><li> 、可能な蒸発を制御スクロース又は水との2の追加のマイクロキャピラリーチューブを記入し、テスト段階中のように正確にそれを操作します。 </li></ol></li><li>各試験の前と後の食料消費（ 図4A）の量を測定するために600dpiでスキャナを使用して、マイクロキャピラリーチューブ内の液体のレベルをスキャンします。 </li></ol> 5.画像の解析<ol><li> ImageJの（バージョン1.48）、画像PROCを用いて溶液の消費量を決定しますソフトウェアをディエッサー。 <ol><li>画像ファイルをアップロードした画像（〜400％）に拡大します。基準縮尺を設定するには、直線ツールを選択し、マイクロキャピラリー管の両端の間に線を引きます。その後、「設定スケール &#39;&#39;を分析する」を選択します。入力「既知の距離」と「長さの単位」の下で、対応するユニットの下でチューブの長さの合計。 </li><li>再び直線ツールを選択し、液面の両端の間に線を引きます。その後、「メジャー &#39;&#39;を分析する」を選択します。結果ウィンドウでは、液体の長さは、「長さ」列の下に与えられています。 </li></ol></li><li>式を用いて溶液の消費量を計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq1.jpg" /> どこ<img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq2.jpg" />微小管の長さであり、そして<img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq3.jpg" />そして<img alt= &quot;式4&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54233 / 54233eq4.jpg&quot; /&gt;は、それぞれ、テストフェーズの前と後のマイクロキャピラリーチューブ内の液体の測定された長さです。 </li></ol> 6.ビデオ分析<ol><li>イベントロギングソフトウェアを使用して、各動画の2分のテスト段階摂食行動スコア（ 材料表を参照してください）。 <ol><li>まず、摂食行動（ すなわち要素）レコーディングソフトウェアの行動のクラスメニューのを定義します。以下のように摂食行動は、次のとおりです。 、吻が延びており、マイクロキャピラリーチューブ内の溶液と接触していない（3）（2）を吻/非接触テングはマイクロキャピラリーチューブ内の溶液と接触して延びており、（1）/接点を口先ありません口吻は収納：口吻が延長されるのではなく、頭（4）視力のうち下収納：熊蜂は、ビデオフレームの外にあります。 </li><li>各動作を設定プロパティメニューの「状態」と「相互に排他的」などと2分間隔の連続録音を行います。より精度のためにスローモーションモード（2倍遅い）で動画を再生します。 </li></ol></li><li>モーショントラッキング・映像ソフトを使用して（ここに示されているビデオ録画で37.5ミリ秒で区切られた）2つの連続するフレーム間の最初の接触後の試験溶液から吻後退の速度を測定（ 材料表を参照してください）。 <ol><li>動画ファイルをアップロードし、口先最初に接触ソリューションのフレームに進んでください。 </li><li>基準縮尺を設定するには、ラインツールを選択して、ビデオフレーム内のマイクロキャピラリーチューブの幅に線を引きます。右の行にクリックして、「メジャーをキャリブレーション」を選択します。入力毛細管の幅と対応するユニット。 </li><li> 「座標系の原点」、次に「イメージ」を選択します。新しいウィンドウで吻の先端をクリックして選択します9; &#39;適用します。 </li><li>手の移動ツールを選択し、右側のビデオフレームに吻の先端をクリックして、「トラックパス」を選択します。次のフレームに移動し、吻の先端に追跡点を再調整します。 </li></ol></li><li>右側の追跡点をクリックし、「設定」を選択します。 「完全パス」を選択し、測定の下にある「スピード」を選択します。選択して「適用」。スピードが表示されます。 </li></ol>

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著者らは、利害の対立を宣言しません。

この小説の行動アッセイでは、キニーネはバフ尾のマルハナバチ蜂の供給を阻止することが示されています。水と減少テングの接触時間と給電試合周波数やキニーネが混入ショ糖溶液は、非栄養または潜在的に有毒なソリューションの更なる送りを開始する拒否としてここに解釈されます。キニーネは、それらが消費する溶液の体積を減少させる1 Mショ糖溶液、マルハナバチないだけに追加されると、それらはまた、このように口器と毒素を含む溶液との接触時間を減少させる、高速吻状部を後退させます。一緒に、これらの結果は、すでに以前にミツバチ9で識別されるキニーネが、熊蜂の口器に味覚受容体細胞によって認識されることを示唆しています。キニーネは、マラリア蚊（ ハマダラカ ）23でミツバチ10とノックダウンに倦怠感のような挙動を誘発する昆虫のための毒素です。このアッセイはよくidentificatにつながる可能性マルハナバチで口器に味覚受容体細胞によって認識されているいくつかの抑止力と潜在的に有毒な化合物のイオン。 微小管は試験段階を通じて持続する試験溶液の十分量で充填されることが重要です。マイクロキャピラリーチューブ（ 例えば 70〜80マイクロリットル）の少なくとも周りの四分の三が満たされることをお勧めします。しかし、ケアは完全スキャンの処理中に流出のリスクを軽減するために、マイクロキャピラリーチューブを記入し、実験装置にマイクロキャピラリーチューブを装着しないように注意しなければなりません。実験者は、保持管に液滴を漏れることを回避するように、マルハナバチへの500mMショ糖液滴を提示するときのケアにも注意が必要です。 保持管の先端の4ミリメートルの穴は自然に試験溶液に向かってその口吻を拡張するために大人ワーカーマルハナバチ蜂のための十分な大きさです。しかし、可能性がありますマルハナバチは、彼らのproboscisesを拡張する前に、それらのアンテナで溶液を味わうことができます。 PERは、糖液15とのアンテナを刺激することにより、マルハナバチにおいて誘発することができたので、これは口吻拡張の確率に影響を与える可能性があります。実際には寄生蜂（Trissolcus brochymenae）24やミツバチ13のようなハチの触角は、彼らはキニーネのような糖や毒素を味わうすることができ、味の感覚器が装備されています。その結果、キニーネのような高度な抑止力の化合物を含む溶液との最初の触角の連絡先は、その口吻を拡張するために熊蜂のモチベーションを低下させるため、実験的な成功率に影響を与える可能性があります。試験溶液と触角の接触を制御することはできませんが、本研究では、我々は試験溶液に向けて口吻の延長上に触角接触の任意の有意な効果を見つけることができませんでした。このアッセイでは、すぐ前のテスト段階ワット後にマイクロキャピラリーチューブを設定しますマルハナバチ」のアンテナは、保持チューブ内に残っている鶏は自分のアンテナをもつ試験溶液を味わうマルハナバチの機会を減らすことができます。 モーショントラッキングのビデオソフトウェアを使用して、第1の口先の接触後の試験溶液から離れて口吻の後退を追跡するとき、このアッセイの主な制限が生じます。ビデオ映像は吻の2次元の動きを表示するので、速度計測の与えられた出力は、下または過大評価することができます。しかし、いくつかの変更を加えて、アッセイのこの側面を向上させることができました。 このアッセイは、天然の植物二次代謝産物を含む種々の化合物を含有する溶液に向けて自然摂食応答を観察するために使用することができます。このアッセイと直接送り応答を観察することマルハナバチは、これらの化合物を検出する方法に関する詳細な情報を提供します。これはPER 18,19のような既存の「行かない-noが行く」の方法よりも有利で ​​す</sup&gt;この方法は、離散送り試合中の食物消費を含むいくつかの行動の対応策を生成するので、7 2択アッセイオーバー。 同時にいくつかのパラメータを測定することは、化合物の嗜好性をよりよく評価することができます。我々のアッセイの例では、マルハナバチは、水またはキニーネが混入ショ糖ソリューションを消費しません。テングの後退は、糖受容体細胞12,13の応答の変化によって発生する可能性があります。私たちのアッセイは、マルハナバチが水単独よりもショ糖を加えたキニーネのソリューションを接触させた後に速く口吻を撤回することを示しています。これは、キニーネがニューロン9,12,13,25を感知砂糖を阻害することに加えて、ニューロンの別個のセットに影響を与えることを示唆している可能性があります。 私たちのアッセイは、給紙時の行動応答の時間的パターンの分析を可能にします。消費時間と発作の数が測定された同様のプロトコルは、アルがあります準備は栄養と非栄養糖26にショウジョウバエの摂食応答を評価するために実施されて。私たちは、ミツバチが保持管21に自由に動くことができるので、ミツバチは、PERなどの他の方法に比べて我々のアッセイにおける摂食刺激に、より信頼性の高い応答を示すであろうと予測しています。この技術は、栄養素やマルハナバチ、潜在的に他の蜂種を送り込むのメカニズムを照明する毒素のための味覚閾値の徹底的な分析を可能にします。

植物花粉媒介の相互作用は複雑です。花粉媒介者は食料として蜜や花粉を得るために花を訪問します。今度は、花粉媒介者は、植物で有性生殖を促進します。この関係は、主に共生ですが、花の蜜や花粉は時々毒素または他の植物化合物1-5を含んでいます これは花粉媒介に害を与えることができます。蜜や花粉におけるこのような化合物の存在のための生態学的な根拠は、すべての設定では明確ではありません。この分野における一つの未解決の問題は、ミツバチなどの花粉媒介が毒素を含む蜜と花を検出し、回避することができる方法です。 熊蜂の種、 セイヨウオオマルハナバチ （リンネ、1758）は、毒素6を含有するもの産蜜を含む多くの植物種の花を訪れジェネラリスト授粉です。マルハナバチで24時間二選択アッセイ7毒素の高濃度を含有するかかるソリューションを回避することが示されています。このアッセイTiedeken ら食物消費を7は 、ミツバチが溶液中苦味化合物を検出することができることを明らかにしました。しかし、このアッセイはまた、この時間間隔8-10にわたって摂食行動に影響を及ぼす可能性があり、このような倦怠感などの後処理食物摂取プロセスから味を区別することができませんでした。 ミツバチは、化合物11-13を検出するために彼らのアンテナ、口器とtarsusの複数形の味覚感覚器を有しています。口先の伸展反射（PER）実験は、ハーネス内の個々の蜂を拘束してから送り反射14-17を生成するためにハチの触角感覚器を刺激することを含みます。ミツバチは、個々のハーネスに拘束した後、化合物18,19を味わうする能力のアッセイとして送り反射を生成するように刺激することができます。その他は、毒素9,20にアンテナや口器の感度を研究するためにPERアッセイを変更しました。しかし、ハチを利用する時の応力にさらされます。これがどのように影響を与える可能性が彼らは、化合物21に応答します。 ここでは、新しいアッセイは9とミツバチ（ ミツバチ ）とマルハナバチに対して毒性10（ マルハナバチをスクロースおよびキニーネ、以前に抑止力であると報告されているアルカロイドにマルハナバチを自由に移動の行動味の応答を評価することが記載されていますマルハナバチ ）7、22。キニーネは、植物の蜜で発見されていないが、このアルカロイドは、多くの場合、ハチ7,9,12,13,22における行動や生理学的研究における嫌悪刺激として使用されています。この方法は、試験溶液との最初の口吻の接触の間に大きな解像度でマルハナバチ」口器をビデオ録画することを含みます。具体的には、摂食応答の微細構造は、連続的に2分間隔で動作を採点することによって検査されます。消費された溶液の量は、給​​餌期間中に測定されるので、食べる食物の量の微細構造と相関させることができます摂食行動。また吻後退の速度が能動的回避の指標として測定されるので、事前摂食検出。

<table><tbody><tr><td>Bumblebee colonies</td><td>Koppert Biological Systems</td><td></td><td>NATUPOL Beehive</td></tr><tr><td>Digital microscopic camera&amp;nbsp;</td><td>Dino-lite Europe</td><td>AM4815ZT</td><td>Dino-Lite Edge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l microcapillary tube&amp;nbsp;</td><td>Blaubrand IntraEND</td><td>709144</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropylene centifuge tube&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849650</td><td></td></tr><tr><td>1 ml disposable plastic luer slip syringe</td><td>BD</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Dell Latitude 3550 laptop</td><td>Dell</td><td></td><td>Check for compatibility with video software&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Canon CanoScan LiDE 120</td><td>Canon</td><td></td><td>Check for compatibility with the computer/laptop</td></tr><tr><td>Observer software version 5.0.25</td><td>Noldus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinovea software version 0.8.15</td><td>Kinovea&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicone tubing</td><td></td><td></td><td>6&amp;nbsp;cm length, 1&amp;nbsp;mm inside &amp;Oslash; &amp;amp; 6&amp;nbsp;cm length, 4&amp;nbsp;mm inside &amp;Oslash;</td></tr><tr><td>Male luer x1/16&quot; standard hose barbed polypropylene adapter</td><td>Cole-Parmer</td><td>TW-45518-22</td><td></td></tr><tr><td>Female luer x 1/16&quot; standard hose barbed polypropylene adapter</td><td>Cole-Palmer</td><td>TW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Steel mesh&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.5 mm mesh size</td></tr><tr><td>Sucrose (grade II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>Quinine hydrochloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q1125</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software version 1.48</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel behavioral assay to investigate gustatory responses of individual, freely-moving bumble bees (bombus terrestris)

バフ尾のマルハナバチ蜂のようなジェネラリスト花粉媒介、 セイヨウオオマルハナバチは 、彼らは植物の開花から集める花の蜜に栄養素や毒素の両方が発生しました。ごく少数の研究では、食品中の毒素に向かってミ​​ツバチの味覚応答を記載しており、これらの実験は、拘束ミツバチ上の口吻拡張応答を主に使用してきました。ここでは、新しい行動アッセイは栄養素や毒素に、個々の労働者マルハナバチを自由に移動の送り応答を測定するために提示されています。このアッセイは、各熊蜂が摂取溶液の量を測定し、食品中の味物質が摂食行動の微細構造にどのように影響するかを識別します。 ソリューションは、以前に2-4時間飢餓状態にされた個々のマルハナバチにマイクロキャピラリーチューブに提示されています。動作は、デジタルビデオで撮影されます。摂食行動の微細構造を連続的proboの位置を採点することによって分析されますイベントロギングソフトウェアを使用してビデオ録画からSCIS（口器）。吻の位置は、3つの異なる行動のカテゴリによって定義される：（1）吻状部が拡張され、溶液と接触し、（2）吻が拡張されているが、溶液（3）吻状部に接触してヘッドの下に収納されていません。さらに、溶液から離れて後退吻の速度も推定されています。 溶液の容量が消費本アッセイでは、摂食発作の数、送り発作の持続時間と最初の接触後の吻の後退速度がphagostimulatoryまたは試験化合物の抑止活性を評価するために使用されます。 この新しい味アッセイは、研究者が蜜で見つかった化合物は、ミツバチの摂食行動にどのように影響するかを測定するために、また、受粉生物学者、毒物学者や熊蜂の味覚系を研究neuroethologistsに有用であろうことができます。

新規なアッセイは、1 Mのショ糖、1 Mショ糖溶液を加えた1mMのキニーネ単独脱イオン水に送り応答を試験するために使用されます。各処置に即時給電応答は、試験溶液、摂食発作の頻度および2分間のテスト段階中に第1の接触の後に離れて、試験溶液から後退吻の速度で吻接触の持続時間を定量することにより決定されます。消費された溶液の体積は、試験段階の後に測定されます。本研究では、フランス人らによる以前の研究に基づいて、5秒の試合基準間隔（ 図1、 補足ファイルを参照してください）を選択しました。抑止力に応答して、 ショウジョウバエにより口吻の後退動作を特徴づけるために5秒のしきい値を使用する25化合物25。したがって、我々は、拡張口吻と溶液との間の連絡先として送り試合を定義されていませんtは5秒以上の接点の不在によって中断します。 スクロースおよび単独の脱イオン水、ショ糖液にキニーネを加えると比較して明らかに彼らは嫌悪物質（ ビデオ図1）を検出した場合、彼らは急速に離れて移動するようマルハナバチによって摂食を阻止します。 この実験では、治療は、テスト段階中吻コンタクトの累積持続時間に有意な影響有する（対数変換データのANOVAを、F 2,31 = 41、p &lt;0.001）。キニーネを含むショ糖との接触時間の累積持続時間が大幅に単独で、スクロース（P &lt;0.001）にではなく、単独で、脱イオン水（P = 0.219）（ 図2）と比較して低減されます。同様に、治療は、対数変換データ、F上のANOVA（送り発作の累積期間に大きな影響を与えます<sUB&gt; 2,31 = 27.95、P &lt;0.001、 図3A）。スクロース含有キニーネで発作を供給する累積持続時間は有意に（p &lt;0.001）ではないが、単独で、脱イオン水た（p = 0.41）と比較して、単独でスクロースと比較して低減されます。ショ糖を含むキニーネと発作の数が有意に高かっができる、：トリートメントも送り発作の頻度（P &lt;0.050ログリンク機能を持つポアソンGLM、C 2分布に比べて乖離度の変化）に大きな影響を与えますショ糖と比較した（p &lt;0.01）が、（原因1マルハナバチが水の上に7供給発作、 図3Bを表示するにはp = 0.055）を脱イオン水処理にわずかに大きく異なります。同様に、吻の後退の速度は、治療（対数変換されたデータにANOVA、F 2,31 = 5.12、P &lt;0.050）との間で大きく異なります。マルハナバチは、PRを撤回しますスクロースまたは単独の脱イオン水（P &lt;0.050、 図3C）よりもキニーネを含むスクロースと最初に接触した後に大幅に高速離れて試験溶液からoboscis。これらの結果は、キニーネがマルハナバチに積極的に回避行動をトリガーすることを示唆しています。治療はまた、キニーネを含むショ糖の消費がスクロースと比較して低減される消費溶液の全体積（対数変換データのANOVA、F 2,32 = 62.5、p &lt;0.001）、（Pに大きな影響を与えます&lt;0.001）ではないが、脱イオン水（P = 0.457）（ 図4B）へ。試験期間中に毛細管から蒸発した溶液の量はごくわずかです。実験室条件（25±2℃、28±2％RH）において、蒸発はそれぞれ0.276μlの脱イオン水の0.171μlの平均は0.033 0.883にμlの1 Mショ糖との間で変化します。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;1&quot;&gt;このアッセイでは、アンテナと、試験液との接触を防止することができません。それにもかかわらず、テストフェーズ中に供給溶液味わうために彼らのアンテナを使用してマルハナバチの割合（ショ糖：46.1パーセント、ショ糖をプラスキニーネ：60.0％、イオン交換水：33.3％）が治療の間で有意差はない（二項GLM、変更逸脱でC 2分布と比較：P = 0.450）。 ;ショ​​糖を加えたキニーネのための1.10秒、純水用0.80秒、ANOVAにスクロース2.67秒：治療の効果は、最初の触角の接点との間の待ち時間や試験溶液と口吻（中央値の最初の接点に発見されないん対数変換データ、F 2,13 = 0.620、P = 0.550）。 66.7％;スクロースプラスキニーネ：また、試験溶液を味わうために口先を拡張マルハナバチの割合は、スクロース（トリートメントにわたって一定のままで50.0％、イオン交換水：52.2パーセント;二項GLM、C 2分布に比べて乖離度の変化：P = 0.840）。これらの結果を総合すると、アンテナはこのアッセイ中の毒素の検出にマイナーな役割を果たしていることを示唆しています。 別の実験では、長い2分以上の時間にわたってハチをテストする必要があるか否かを調べます。 2分の試験時間と10分の試験期間：ミツバチによって消費される食物の量は、1 Mスクロースまたは2の条件で1 Mショ糖溶液中での1 mMのキニーネでテストされています。両方の処理については、総食物消費量は、試験期間の違いはありません。また、有意な相互作用が試験期間と治療（N = 6の間に発生していない-ログ変換されたデータに13、ANOVA;処置の効果を：F 1,31 = 54.8、P &lt;0.001;試験期間の効果：F 1,31 = 0、P = 0.979;相互作用の効果：F = 0.1、P = 0.457）。要約すると、2分間の試験期間は、マルハナバチこのアッセイにおいて毒性または忌避物質の抑止効果によって消費された食物の合計量に対する溶液の効果を評価するのに十分です。従って、食物消費を測定し、摂食行動を分析することにより、アッセイ中に摂食の微細構造に総食物消費を相関させることが可能です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig1.jpg" /> 図1：摂食アッセイの最初の2分の間にテングザルコンタクト間のレイテンシ期間 1 Mショ糖溶液、1 Mショ糖+ 1 mMのキニーネ溶液および水で各テング接触を分離する時間の遅延期間の密度プロット。 13、10および11ミツバチからの累積データは、それぞれ表されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54233/54233fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &lt;/ P&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig2.jpg" /> 図2： テングザルの接触持続時間摂食アッセイの最初の2分の間に 1 Mショ糖、1 Mショ糖+ 1 mMのキニーネや水を食べマルハナバチによってテング接触持続時間の密度プロット。サンプルサイズは、図1のように<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54233/54233fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig3.jpg" /> 図3：1 Mスクロースに摂食マルハナバチのテングザル活動、1 Mスクロース+ 1 mMのキニーネまたは水 （A）テスト段階（B）の間に供給発作の累積期間送り発作および（C）の周波数スピード。吻の再の最初の接触後の牽引。レタリングは有意差を示す：異なる文字での治療は、P &lt;0.05を示しています。ボックスプロットは、中央値（黒棒）、四分位範囲の1.5内でまだ最低と最高のデータポイント（ウィスカー）と外れ値（円）を表します。サンプルサイズは、図1のように<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54233/54233fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig4.jpg" /> 図4：マルハナバチによってキニーネsupresses送りテストフェーズ前後の1 Mスクロースまたは（黒線で示される）1 Mスクロースに加えて1 mMのキニーネ溶液のレベルを示すマイクロキャピラリーチューブの（A）スキャンした画像。それぞれ。 （B）1 Mショ糖の消費、1 Mスクロースに加えて、1mMのキニーネまたは脱イオン水<html>テストフェーズの後マルハナバチによるだけでは。レタリングは有意差を示す：異なる文字での治療は、P &lt;0.001を示します。ボックスプロットは、中央値（黒棒）、四分位範囲の1.5内でまだ最低と最高のデータポイント（ウィスカー）と外れ値（円）を表します。サンプルサイズは、図1のように<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54233/54233fig4large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ビデオ図1：（A）に向かってテングザル活動のビデオレコーディング<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1A_1M_Sucrose.m4v" target="_blank">1 Mスクロース</a> 、（B） <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1B_Quinine.m4v" target="_blank">1 Mスクロースプラス1 mMのキニーネ</a>及び（C）テストフェイズD / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;脱イオン水。

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A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

小説行動アッセイ個人の味覚応答を調査するために、自由に移動バンブル蜂（<em&gt;セイヨウオオマルハナバチ</em&gt;）

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

a-novel-behavioral-assay-to-investigate-gustatory-responses

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

8.7K ビュー.  Newcastle University. A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution. 

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

神経科学

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（<em&gt;ミツバチ</em&gt; L.）

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

匂い物質へ節足動物Responseの垂直T-迷路チョイスアッセイ

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em&gt;ミツバチ</em&gt;）

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

での採餌行動のためのシングル·フライアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification (RFID) readers built into artificial flowers that display various visual cues, and RFID tags (i.e., passive transponders) glued to the thorax of bumblebee workers. The novelty in our implementation is that RFID readers are built directly into artificial flowers that are capable of displaying several distinct visual properties such as color, pattern type, spatial frequency (i.e., &#8220;busyness&#8221; of the pattern), and symmetry (spatial frequency and symmetry were not manipulated in this experiment). Additionally, these visual displays in conjunction with the automated systems are capable of recording unrewarded and untrained choice behavior. The second method consists of recording choice behavior at artificial flowers using motion-sensitive high-definition camcorders. Bumblebees have number tags glued to their thoraces for unique identification. The advantage in this implementation over RFID is that in addition to observing landing behavior, alternate measures of preference such as hovering and antennation may also be observed. Both automation methods increase experimental control, and internal validity by allowing larger scale studies that take into account individual differences. External validity is also improved because bees can freely enter and exit the testing environment without constraints such as the availability of a research assistant on-site. Compared to human observation in real time, the automated methods are more cost-effective and possibly less error-prone.

This video describes Radio-Frequency Identification (RFID) and motion-sensitive video recording methods to monitor choice behavior by bumblebees.

無線周波数識別かつ効率的にモーションセンシティブビデオがマルハナバチによって報わ選​​択行動の記録を自動化

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: 昆虫アンテナの動きと共通の準備と従来のハードウェアを使用して吻伸展反射のリアルタイム追跡

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis. This has traditionally been done by netting foragers at nest entrances or on flowers, chilling the bees on ice, and then removing the pollen loads from the corbiculae with forceps or a brush. This method is time and labor intensive, may alter normal foraging behavior, and can result in stinging incidents for the worker performing the task. Pollen traps, such as those used on honey bee hives, collect pollen by dislodging corbicular pollen loads from the legs of workers as they pass through screens at the nest entrance. Traps can remove a large quantity of pollen from returning forager bees with minimal labor, yet to date no such trap is available for use with bumble bee colonies. Workers within a bumble bee colony can vary in size making size selection of entrances difficult to adapt this mechanism to commercially reared bumble bee hives. Using 3D printing design programs, we created a pollen trap that successfully removes the corbicular pollen loads from the legs of returning bumble bee foragers. This method significantly reduces the amount of time required by researchers to collect pollen from bumble bee foragers returning to the colony. We present the design, results of pollen removal efficiency tests, and suggest areas of modifications for investigators to adapt traps to a variety of bumble bee species or nest box designs.

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

We present a non-lethal and automated mechanism to collect pollen from bumble bee (Bombus) workers returning to a hive. Instructions for producing, preparing, installing and using the devices are included. By using 3D-printed objects, modification to the design was timely, efficient and allowed for quick turnaround for testing.

バンブルビー(ボンバス)ハイブ入口のための3Dプリント花粉トラップ

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

小説行動アッセイ個人の味覚応答を調査するために、自由に移動バンブル蜂（

要約

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ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（

匂い物質へ節足動物Responseの垂直T-迷路チョイスアッセイ

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（

での採餌行動のためのシングル·フライアッセイ

昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

無線周波数識別かつ効率的にモーションセンシティブビデオがマルハナバチによって報わ選択行動の記録を自動化

SwarmSight: 昆虫アンテナの動きと共通の準備と従来のハードウェアを使用して吻伸展反射のリアルタイム追跡

バンブルビー(ボンバス)ハイブ入口のための3Dプリント花粉トラップ

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