Name: observation and quantification of telomere and repetitive sequences using fluorescence in situ hybridization (fish) with pna probes in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans at

Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&amp;D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health &amp; Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).

PCRによりジゴキシゲニンdUTPで1標識プローブ<ol><li>以前に13を説明したようにジゴキシゲニンdUTPをを含む10×dNTPミックスでPCRラベリングを行います。 </li><li>製造者の指示に従ってスピンカラム精製を用いてPCR産物を精製します。 <ol><li>プローブはより短い200bpのであれば、反応混合物からのスピンカラムクロマトグラフィーではなく、スピンカラム精製で無料ジゴキシゲニンdUTPをを削除します。 </li></ol></li></ol> 2.準備ポリリジン被覆スライド注：全体の手順は、約2時間かかります。ステップのほとんどは、乾燥工程を除いて、室温で行われます。 <ol><li>スライドのクリーニング<ol><li>プラスチック容器にスライドを置き、簡単に蒸留水（DW）でスライドをすすぎます。水を除去し、1％のガラスクリーナーを含むDWで容器を満たします。 </li><li>室温（RT）で50 rpmで15分間スライドを攪拌します。 DW 3でスライドを洗浄室温で5分間、回。 </li><li>攪拌しながら15分間、70％エタノールでスライドを洗浄します。 70％エタノールを捨て、15分間65℃で乾燥ブロックと空気乾燥でスライドを配置します。 </li></ol></li><li>マルチウェルガラススライドのポリリジンコーティング 注：それは染色手順を通じてサンプルの接着性を提供するので、スライドガラスのポリリジンコーティングは、重要なステップです。不十分なコーティングされたスライドは、サンプルが失われます。 <ol><li>蒸留水で（w / v）の0.01％にポリリジン原液を希釈します。きれいなガラススライドのウェルにポリリジン（w / v）の希釈した0.01％の20μLを加えます。 </li><li>室温で5分間、ガラススライドをインキュベートします。 </li><li> 1時間65℃で乾燥ブロックと空気乾燥でスライドを置きます。 </li><li>埃ボックスにポリリジンスライドを保管してください。 </li></ol></li></ol>スライドガラス上のワームの3.固定（図1） <ol><li> FISHのための準備胚 注：収穫のワームをすべてト​​ンの前に彼細菌食品は、顕微鏡下で増殖培地を見て消費されます。飢餓は、成虫の産卵を低減し、卵の孵化を増加させます。詳細な方法は、14,15に記載されています。 <ol><li>標準的な方法14に従って50ミリメートルペトリ皿にワームを育てます。 </li><li>すべての細菌の食物が消費された後、スパチュラで四半期の寒天培地をカット。汚染を防止するために切断する前へらを滅菌します。 </li><li> 100ミリメートル線虫の増殖培地（NGM）プレート上の寒天のすべてのピースを置きます。新鮮な細菌性食品に到達するためにワームのために逆さまに寒天片を回します。 </li><li> 48〜72時間後、M9バッファーでワームを収集します。 NGMプレート上のM9緩衝液5ml - 3を追加します。ワームを洗浄するNGMの表面上にピペットM9バッファー。 </li><li>ワームと液体を収集し、15mlチューブに追加します。 注：30％ショ糖溶液中での収穫、遠心ワーム後の寒天の破片がある場合。破片をペレット化しているが、ワームは、上のフロート表面。 </li><li> 15ミリリットルにボリュームを補うためにM9のバッファを追加します。 3分間300×gで遠心分離することによってワームをペレットし、M9バッファーの大部分を除去。このステップをさらに2回繰り返します。 注：ワームはまだ遠心分離後、浮遊している場合は、値= 1に遠心分離機のブレーキレベルを設定します。 </li><li>吸引しM9バッファー。ワームに漂白液を追加します。ワームの0.5ミリリットル当たり、次亜塩素酸の2ミリリットルをDWの6.5ミリリットルを追加し、5 M KOHの1ミリリットル。 </li><li> 50 rpmで3分間室温で揺らしながらワームをインキュベートします。 15秒間ボルテックスワームは、機械的にワームをせん断し、卵を露出させます。 </li><li>漂白時に解剖顕微鏡下で管を観察します。ワームは半分に切断され、卵が放出されていることを確認します。成人の体のほとんどが解散されたときは、15ミリリットルにボリュームを補うためにM9のバッファを追加します。 </li><li> 3分間300×gで遠心分離します。吸引しM9の大部分を、15 mlにボリュームを構成するために、新鮮なM9バッファーを追加します。繰り返し洗浄ステップ3回。 注意：彼らは漂白工程を妨げるとして、ワームの過剰な量を使用することは避けてください。未満8分洗浄まで、全体的な反応時間をおいてください。過漂白卵は強い自家蛍光を生成します。 </li><li> 200μlの2％PFAを行うための4％パラホルムアルデヒド（PFA）を200μlまでのポリソルベート20（PBST）を含むリン酸緩衝生理食塩水を加えます。 注意：PFAは発癌性であるため、PFAを使用する前に、防護服、手袋、アイシールドを着用してください。 </li><li>ポリリジンコートスライドのウェルに2％PFAで卵の40μLを加えます。 </li><li>加湿チャンバー内でスライドを置き、RTで15分間インキュベートします。スライドを内側に配置された直後の湿潤チャンバーを閉じます。 注：固定された状態で卵がスライドの底に沈みます。 </li></ol></li><li> FISHのための解剖生殖腺の準備<ol><li>収穫成虫はM9緩衝液1mlをピペットで50ミリメートルNGMプレート上で増殖させました。細菌性食品の前に収穫ワームが枯渇しています。 </li><li>任意の細菌のウィットからワームを洗いますH M9緩衝液、2回。 注：残留細菌はポリリジン被覆スライドに付着解剖生殖腺を妨害し得ます。 </li><li> 300×gで遠心分離することによりワームをペレット。 M9を取り外し、マイクロピペットによって空のNGMプレートにワームを転送します。 </li><li>ポリリジン処理したスライドのほかに2mMのレバミゾールを含むM9緩衝液30μlを追加します。 </li><li> 1ミリリットルチューブにM9バッファー500μlのを追加します。口のピペットでワームを転送するために、このバッファを使用します。 </li><li> M9緩衝液を含む1mLのチューブに毛管を配置することによって、M9緩衝液で口ピペットの先端を満たします。 </li><li>ワームの頭が口のピペットに入るように解剖顕微鏡下で、ちょうど大人のワームやドラッグ口のピペットの頭の前で口のピペットの先端を置きます。ワームのヘッドが先端に入ると、ワームの本体全体をチップ内に描画されます。 </li><li>口のピペットを用いて、ポリリジンコートスライドにワームを転送します。 </li><li>のかみそり、カットを使用して、頭やスライド上のワームの尾の先端F。ワームが切断されると、生殖腺が飛び出します。生殖腺は、スライドに固執します。 <ol><li> 1つのウェル中に少なくとも30ワームを準備します。複数のウェルをさらに30ワームのために使用することができます。 </li></ol></li><li>加湿チャンバー内でスライドを入れて、口のピペットでM9バッファーを吸引します。 </li><li>加湿チャンバー内で室温で15分間2％PFAを20μlを添加することにより、サンプルを修正してください。 </li></ol></li></ol> 4.固定および透過処理<ol><li>ドライアイス上にアルミニウムブロックを配置し、ディープフリーザーに保管（-80°C）。 -20℃に保管し、メタノールおよびアセトン。 </li><li> PFA固定工程3.1.15または3.2.11た後、固定液の〜5μLを残しマイクロピペットを用いて固定液を除去します。 </li><li>試料スライド上の別のポリリジンコートスライドを入れてください。解決策が過剰である場合はペーパータオルで固定液を除去します。彼らは一緒に立ち往生しているしたら、スライドを移動しないでください。 </li><li>スライドを凍結少なくとも15分間、アルミブロック上。 注：サンプルは、少なくとも2のために保存することができます - 3日間。 </li><li>スライドが凍結されている間、氷上で冷メタノールおよびアセトンを含むjarを置きます。 </li><li>スライドを取り出し、サンプルを凍結クラックするためにそれらをねじります。上部のスライドを捨てます。すぐに5分間氷冷メタノール中にスライドを浸します。 </li><li> 5分間氷冷アセトンにスライドを転送します。 </li><li>残留固定剤を除去するために、5分間、スライドをPBSTで3回洗浄します。次のステップに進むか、4℃で、100％エタノールでスライドを保存します。 注：サンプルは、少なくとも2のために保存することができます - 3日間。 </li></ol>固定された細胞の5ハイブリダイゼーション<ol><li> （PBSTはを10μg/ mlのRNase Aを含む）のRNase溶液20μlを追加します。 37℃で1時間湿潤チャンバー内のスライドをインキュベートします。 </li><li> 15分ごとに（2×SSCT）ポリソルベート20で2回生理食塩水とクエン酸ナトリウムで二回スライドを洗浄します。 </li><li> 20を追加します。ハイブリダイゼーション溶液μlの37℃のインキュベーターで加湿チャンバーを置きます。 1時間後、ピペッティングによりハイブリダイゼーション溶液を除去します。 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液を取り外す前に、プローブを準備します。プローブが二本鎖DNAである場合、乾燥ブロック上95℃で5分間加熱することにより、プローブを変性させます。加熱後、簡単に氷の上にプローブを冷却します。 </li><li>サンプルにプローブを含むハイブリダイゼーション溶液10μlを加えます。 2,000及びDIG標識プローブのための、1の比率で使用濃度：200 PNAプローブ、1の比で使用濃度について。カバーガラスでサンプルをカバーしています。 </li><li>ヒートブロック（80℃）で水に浸した紙タオルを置きます。湿度と温度を維持するためにヒートブロック上のプラスチックの箱のカバーを置きます。 </li><li>加熱ブロックの温度（80℃まで）安定した後、加熱されたペーパータオルの試料スライドを配置し、プラスチック製の箱のカバーを有するサンプルをカバーします。 3分間サンプルを変性。 </li><li>株式会社一晩37℃で湿潤チャンバー内のスライドをubate。 </li></ol> 6.洗浄および免疫蛍光<ol><li> 37°Cへのハイブリダイゼーション洗浄溶液（2×SSC、50％ホルムアミド）をウォームアップ。 </li><li>室温で5分間二回PBSTでサンプルを洗ってください。カバーガラスを外します。 </li><li> 30分間、37℃でハイブリダイゼーション洗浄溶液中で試料を洗浄します。 </li><li> RTでPBSTで試料スライドを3回洗浄します。注：室温で湿潤チャンバー内の後続のすべての手順を実行します。 </li><li>ブロッキング溶液の20μlを添加して、湿潤チャンバー中、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液を外し、FITC結合抗ジゴキシゲニン抗体溶液（1：200）を追加し、室温でまたは4℃で一晩3時間。 </li></ol> 7.取付け・観測<ol><li> 15分間ずつPBSTで2回サンプルスライドを洗浄します。 </li><li> DAPIでマウント溶液10μlを加えます。カバーガラスとプレスを静かに置きます。余分な溶液を除去しますペーパータオルで。 </li><li>取付溶液の蒸発を防ぐために、マニキュアでカバーガラスのエッジをシール。 </li><li>共焦点顕微鏡下で観察します。高いバックグラウンドを持つ胚を除外します。 20核 - 4でフィールドに焦点を当てています。 </li><li> 100X対物レンズで、製造元の指示に従って画像を撮影します。 注：FITCのための488nmレーザーで、Cy3のための555 nmレーザーで、DAPI用の405 nmのレーザーを試料にエキサイト。 </li></ol>テロメアシグナルの8定量注意：以前に16記載のように定量化が行われました。比較されるすべての画像は、露光時間と光源を含む同じ設定で撮影する必要があります。 <ol><li> tifファイル形式で画像をエクスポートします。 </li><li>画像解析ソフトウェアをダウンロードし、インストールします。 </li><li>画像解析ソフトウェアを実行し、ボタンを同意する]をクリックします。 </li><li>オープンボタンをクリックします。イメージファイルをダブルクリックすることにより、テロメアFISHで画像を開きます。 </li><li>クリック[編集] - [選択処理領域]、左クリックしてドラッグすることで、目的とする選択領域。すべての非特異的な染色を除外します。 </li><li> [対策]をクリックして - 、[光学密度を見つけ]テロメア信号とチャンネルを選択し、.txtファイルに結果を保存するファイル名を入力します。 注：結果の列の順序は、次のようにスポットの蛍光、スポットとスポットのエリアの背景強度を。 </li><li>値をコピーし、スポットの蛍光からのスポットのバックグラウンド強度を差し引きます。値は、現在、統計的に分析することができます。 </li></ol>

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	<li>Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+cells+with+no+detectable+telomerase+activity.+A+review.">Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review.</a> Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).</li><li>Seo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+maintenance+through+recruitment+of+internal+genomic+regions.">Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions.</a> Nat Commun. 6, 8189 (2015).</li><li>Cesare, A. J., Reddel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+models,+mechanisms+and+implications.">Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications.</a> Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).</li><li>Meier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=trt-1+is+the+Caenorhabditis+elegans+catalytic+subunit+of+telomerase.">trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase.</a> Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).</li><li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+measurement+by+quantitative+PCR.">Telomere measurement by quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).</li><li>Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+longevity+and+telomere+length+in+C.+elegans.">Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans.</a> PLoS Genet. 1, 30 (2005).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Specific+Sequences+among+DNA+Fragments+Separated+by+Gel-Electrophoresis.">Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+extension+by+telomerase+and+ALT+generates+variant+repeats+by+mechanistically+distinct+processes.">Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes.</a> Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).</li><li>Cheung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+telomere+length+revealed+by+single+telomere+length+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).</li><li>Shtessel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+POT-1+and+POT-2+repress+telomere+maintenance+pathways.">Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways.</a> G3. 3, 305-313 (2013).</li><li>Duerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).</li><li>Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+meiosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans.</a> Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , 171-195 (2009).</li><li>Emanuel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+system+for+synthesis+of+non-radioactive+nucleic+acid+hybridization+probes+using+PCR.">Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR.</a> Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J Vis Exp. , e4019 (2012).</li><li>Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+measurements+using+digital+fluorescence+microscopy.">Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy.</a> Cytometry. 36, 267-278 (1999).</li><li>Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shelterin+protein+POT-1+anchors+Caenorhabditis+elegans+telomeres+through+SUN-1+at+the+nuclear+periphery.">The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery.</a> J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).</li><li>Lee, M. H., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+in+situ+hybridization+of+dissected+gonads.">RNA in situ hybridization of dissected gonads.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li><li>Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-well+version+of+in+situ+hybridization+on+whole+mount+embryos+of+Caenorhabditis+elegans.">A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+(Q-FISH).">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH).</a> Curr Protoc Cell Biol. 18, 14 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

私たちのプロトコルの主な利点は、細胞構造の形態に目立つダメージのない手続きの簡単さです。いくつかのステップは、C。のために最適化されましたこのプロトコルでFISH エレガンス 。成功FISHのための重要なステップは、プローブのラベリング、胚および浸透の固定を含みます。ジゴキシゲニンdUTPを標識方法は、PCRまたはニックトランスレーションにより使いやすい標識法を提供します。長い標的配列にラベルを付けるには、ニックトランスレーションが好ましいです。この場合、プローブは、プローブの侵入を容易にするために、適切な制限酵素で消化されるべきです。ビオチン標識プローブは、細胞質からのバックグラウンド信号を過剰に産生されているためビオチン-dUTPタグは推奨されません。内因性ビオチンブロッキング試薬が市販されているが、それは行われませんでした。 このプロトコルは、効率的な定量化のための細胞の密度を増加させるために、単離された胚を使用します。 Cの腸内核。エレガンスは、サイズが大きく、過剰な数と体細胞核の残りの部分に比べてテロメアスポットの強度を寄与する、倍数体です。このため、全体のワームは、Cのテロメアの定量化には ​​適していませんエレガンス 。彼らは倍数性の影響を受けることなく、均質な細胞を提供するようにこれとは対照的に、胚は、テロメアの長さの評価に適しています。 このプロトコルは、テロメアFISHの罰金働いていた2％PFA固定液を使用しています。グルタルアルデヒドは、より低いバックグラウンド信号およびRNA in situハイブリダイゼーションで硬く固定をもたらすことが報告されていますが、グルタルアルデヒドは大幅に18自家蛍光を増加させました。この過剰なバックグラウンドは、未反応のアルデヒド基を減少させる水素化ホウ素ナトリウムの処理後に廃止されていませんでした。この理由のために、グルタルアルデヒドを使用しませんでした。信号対雑音比が低い場合には、プレハイブリダイゼーションの時間は、非特異的結合部位をブロックするために数時間まで延長することができます。にさらには、ストリンジェントな洗浄の時間は、バックグラウンドレベルを減少させるために増加させることができます。 で染色技法 C.エレガンスは、適切な透過性の治療のために挑戦することができます。C.エレガンスは、抗体およびプローブの浸透を阻害厚いクチクラ外骨格が含まれています。従来の抗体染色法が多くの時間と最適化プロセスを必要とするコラゲナーゼの治療を含みます。酵素浸透法も損害賠償の浸透効率の引き換えにワームの形態。凍結亀裂及びメタノール - アセトン処理は、プローブの浸透を促進するために使用されました。凍結亀裂キチナーゼまたはyatalase処理19と比較して、簡単かつ迅速です。脱水またはメタノールシリーズの再水和は、FISHの品質に影響を与えていないようでした。これらの手順は、このプロトコルで単純化されました。それは、プロテイナーゼK消化がRNA in situハイブリダイゼーションのために必要であったことが報告されたが、19、明らかな差が付きおよびプロテイナーゼK処理なしのテロメアFISH結果との間で観察されませんでした。また、胚の凍結割れは大きな定量分析のための単一の焦点面上で同時に多くの細胞を可視化するための使いやすい方法を提供します。 PNAプローブを使用することによって、テロメア信号は著しくDNAプローブを用いて得られたものと比較して増加しました。これは、その相補的な標的とその小さなサイズ（4リピートに比べて3リピート）のためのより高い結合親和性のためである可能性があります。蛍光標識されたPNAプローブを直接その後の工程を最小限に抑え、その標的に結合します。以下の免疫蛍光手順に維持強い親和性は、バックグラウンドノイズを回避することができ、後の固定が不要となります。 しかし、いくつかの制限は、この技術に存在しています。一つは、透過性のステップが少しダメージこと、効率的なプローブの浸透のコストで形態です。生殖腺の治療sおよびメタノールとアセトンとの胚は、未処理対照と比較して、核の真円度を歪め。完全に保存形態を必要とする実験のために、異なる透過処理方法が試みられるべきです。別のテロメア信号を任意の単位で定量化されることです。これは、主に独立した実験のばらつきに起因しています。リボソームDNAは、各サンプルを正規化するための内部コントロールとして考えることができます。もっと便利な方法は、参照20で見つけることができます。 シンプルなテロメアFISHプロトコルは、最小限の手順を必要とする、ここに記載されています。多くの手順は、胚の大量の分析のために低減されます。しかし、さらなる修飾は、そのような浸透のためキチナーゼ処理として強いシグナル、および他の革新的な試験のために作製することができます。細胞培養法と組み合わせて、超解像の撮像が可能です。このプロトコルは、Cで、新規テロメア維持メカニズムを発見するのを助けることができますエレガンス 。

テロメアは、異常な融合と分解か​​ら染色体末端を保護します。哺乳類テロメアは、Gリッチ六量繰り返し、TTAGGG、およびshelterin複合体で構成されています。線虫のテロメア反復配列は、哺乳動物（TTAGGC）のものと同様です。ほとんどの真核生物は、それらの染色体の末端にテロメアリピートを追加するには、テロメラーゼを利用します。しかし、10 -癌細胞の15％がテロメアの代替長くする（ALT）3として知られているテロメラーゼ独立した機構を利用します。以前、我々はテロメアとTALTという名前のその関連配列は、重要な無菌性2を生き延びテロメラーゼ変異系統のテロメアで増幅されたことを報告しました。 テロメア長は、定量的PCRにより、または合計テロメア4,5,6,7-の平均長さを提供し、サザンブロットによって測定しました。全ゲノム配列データにテロメアリピートの回数を読むまた、全テロメア内容8の指標です。罪が、GLEテロメア長解析（STELA）は、それがテロメア9の空間的な情報を提供することができない、単一のテロメアの長さを提供することができます。 POT-1 :: mCherryをレポータータンパク質が生体内でテロメアの空間的な情報を提供していますがPOT-1は、タンパク質10を結合一本鎖テロメアであるとして、それは、二本鎖テロメアの長さを表すことはできません。 上述の方法は、反復配列の平均の情報を提供するが、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、染色体規模量、対象の個々の配列の空間的なパターンを観察することができます。代わりにDNAの精製、組織または細胞は、FISHにおける天然の空間情報を保存するために固定されています。このように、FISHは、テロメアリピートなどの個々の反復配列の観察のための定量的および定性的な両方のツールです。 このプロトコルは、両方のteloの同時検出のための効率的な方法を提供します前述の方法11,12からの改良に基づく単なるおよびその他の繰り返し。C.エレガンスの幼虫や成虫は非常に分化した細胞と多細胞生物です。細胞の不均一性は、テロメアスポットの多数の定量分析に妨げます。分析した細胞の数を最大にするために、胚を単離し、FISH用ポリリジン被覆スライド上に広げています。また、このプロトコルは、免疫蛍光法と組み合わせることができます。 プロトコルが動作していることの証明として、我々は、2つの異なる反復配列を観察し、定量化することが可能であることを示します。 TALT1に対するDNAプローブは、ジゴキシゲニンdUTPをを取り入れたシンプルなPCRで生成しました。このTALT1プローブおよび蛍光標識されたテロメアPNAプローブを同時にハイブリダイズさせました。その後、ジゴキシゲニンは、標準的な免疫蛍光法によって検出しました。ここではTALT1はTRT-1にテロメアと共局在代表画像を提示します</eメートル&gt;生存者。

<table><tbody><tr><td>PNA probe</td><td>PANAGENE</td><td>custom order</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>use 1:200 diluted in PBST</td></tr><tr><td>Digoxigenin-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Hybridizaiton solution</td><td></td><td></td><td>3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 &amp;#956;g/ml heparin, 100 &amp;#956;g/ml yeast tRNA , 100 &amp;#956;g/ml sonicated salmon sperm DNA</td></tr><tr><td>Hybridizaiton wash solution</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 50% formamide</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td>toxic</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>make 10 mg/ml for stock solution</td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0.1% tween-20</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>Commercial name is Tween-20</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>prepare fresh 0.01% w/v solution before use</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L</td></tr><tr><td>Bleaching solution</td><td></td><td></td><td>20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH</td></tr><tr><td>Antibody buffer</td><td></td><td></td><td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)</td></tr><tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L, adjust pH to 7.0</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0.1% tween-20</td></tr><tr><td>10x digoxigenin-dUTP mix</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>PCR purification columns</td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Glass cleaner / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan pure chemicals</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well glass slide</td><td>MP biomedicals</td><td>96041205</td><td></td></tr><tr><td>Nematode growth media</td><td></td><td></td><td>To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25 ml of 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>Feather</td><td>blade No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.</td></tr><tr><td>Humid chamber</td><td></td><td></td><td>Plastic box filled with paper towel soaked in DW</td></tr><tr><td>Image Analysis Software&amp;nbsp;</td><td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flintbox.com/public/project/502&quot;&gt;http://www.flintbox.com/public/project/502&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

observation and quantification of telomere and repetitive sequences using fluorescence in situ hybridization (fish) with pna probes in caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

これは、以前にALTの生存者は、内部ローカライズ」ALTのテンプレート「テロメア維持2用（TALT）配列を複製することによって、低周波では、テロメラーゼ欠損変異体、TRT-1（ok410）から出てくることが報告されました。 PNAプローブを使用して、我々は解剖生殖腺（ 図2A）にテロメアを可視化することができました。かすかなテロメア信号は、TRT-1（ok410）とALTの生存者の両方で検出されました。ファジー信号は、それらが自家蛍光ではないかもしれないことを示唆している、唯一のDAPIと重なりました。間質テロメア様反復（ITR）は、一貫してCの研究にTRFアッセイで観察されますエレガンステロメア4,10。 PNAプローブの高い特異性を考慮すると、それらは、ITRは、ゲノム全体に分散される可能性があります。 テロメアスポットの数は、TRT-1（ok410）で約9太糸期核当たりでした。以前の研究では、12病巣がPOT-1 :: mCherryをタンパク質、一本鎖テロメアDNA 10に結合することによって観察されました。核あたり24病巣の最大値は、野生型胚17で観察されました。結果は、mCherryをレポーター方法はテロメアの数をカウントする必要があり、実験のために良好であることを示唆しています。しかし、PNA FISHは、テロメアの長さに比例して二本鎖テロメアDNA、ならびに一本鎖テロメアDNAを検出することができます。対照的に、テロメアスポットの数は約7染色体に融合しているALTの生存者であった（N = 3）2。この結果は、テロメアスポットがALTの生存者で6だろうという予測と一致しています。我々は、ALTの生存の信号強度を観察するのに十分であると結論付けました。 テロメア信号はTALT1はteloの不存在下でテロメアのためのコピーテンプレートとして使用されていることを示唆し、ALTの生存者でTALT1と共局在しました。メラーゼ（ 図3）。 ALT生存者のテロメア信号は（ 図4）テロメアは堅牢テロメラーゼなしでALTの生存者で維持されていることを示す、親のTRT-1（ok410）突然変異体に比べて増加しました。 PNAプローブのシグナルは、ジゴキシゲニン標識プローブ（ 図4）のそれよりも大きかったです。 PNAオリゴマーとの設計プローブは、ジゴキシゲニン標識よりも強い信号が発生する場合があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig1.jpg" /> 図1：FISH実験の概要卵が成虫を漂白することにより回収し、ポリリジンでコーティングしたスライド上に2％PFAで固定されています。サンプルは凍結割れとプローブの浸透のためのメタノールとアセトンで透過されています。プローブがサンプルに添加し、37℃で一晩ハイブリダイズさせます。ジゴキシゲニン標識プローブは、免疫蛍光によって検出されます。次いで、試料を画像化しているquantifie画像解析ソフトウェアにより、D。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54224/54224fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig2.jpg" /> 図2： 解剖生殖腺におけるテロメアFISHは、（A）テロメア（赤）生殖腺の遠位先端部（矢印）でのCy3-PNA-（TTAGGC）3により検出しました。 ALTの生存の強度は、TRT-1（ok410）のそれよりも大きいです。 Zスタック画像は最大投影でレンダリングされました。核は吹きアップされて右上の白い矢印で示しました。スケールバーは10μm。太糸期段階での核あたりテロメアスポットの（B）の数を目視により測定しました。 N = 50エラーバー、SEM。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54224/54224fig2large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig3.jpg" /> 図3： 胚におけるテロメアとTALT1 FISH代表テロメアの画像（赤）とTALT1（緑）FISH。テロメアとTALT1プローブが同時に胚にハイブリダイズさせました。 DNAをDAPI（青）で対比しました。スケールバーは10μm。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54224/54224fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig4.jpg" /> 図4：FISH データテロメアの定量および図3からTALT1強度を画像解析ソフト（ピーター・Lansdorpからの贈り物）で定量しました。各スポットは、閾値レベルOVで定量しました。非特異的バックグラウンドを排除する小胞体15。 T検定は、統計的有意性を評価するために使用しました。 （* P &lt;0.001）。エラーバーは、SEM。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54224/54224fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em&gt;その場で</emPNAプローブのある&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

observation-quantification-telomere-repetitive-sequences-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

10.3K ビュー.  Seoul National University. We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT). 

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Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

遺伝学

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

線虫Caenorhabditis elegansにおけるエピジェネティックな遺伝とChIP

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through factors such as non-coding RNAs and chromatin modifications. The phenomenon of RNA interference (RNAi) inheritance in the nematode Caenorhabditis elegans is an effective model to investigate TEI that takes advantage of this model organism's short life cycle, self-propagation, and transparency. In RNAi inheritance, exposure of animals to RNAi leads to gene silencing and altered chromatin signatures at the target locus that persist for multiple generations in the absence of the initial trigger. This protocol describes the analysis of RNAi inheritance in C. elegans using a germline-expressed nuclear green fluorescent protein (GFP) reporter. Reporter silencing is initiated by feeding the animals bacteria expressing double-stranded RNA targeting GFP. At each generation, animals are passaged to maintain synchronized development, and reporter gene silencing is determined by microscopy. At select generations, populations are collected and processed for chromatin immunoprecipitation (ChIP)-quantitative polymerase chain reaction (qPCR) to measure histone modification enrichment at the GFP reporter locus. This protocol for studying RNAi inheritance can be easily modified and combined with other analyses to further investigate TEI factors in small RNA and chromatin pathways.

著者スポットライト:C. elegansにおけるRNAi遺伝とChIP 

This protocol describes an RNA interference and ChIP assay to study the epigenetic inheritance of RNAi-induced silencing and associated chromatin modifications in C. elegans.

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes such as development are affected. The Caenorhabditis elegans germline is a great model system for studying PPIs that are related to the regulation of stem cells, meiosis, and development. There are a variety of well-developed techniques that allow proteins of interest to be tagged for recognition by standard antibodies, making this system advantageous for proximity ligation assay (PLA) reactions. As a result, the PLA is able to show where PPIs occur in a spatial and temporal manner in germlines more effectively than alternative approaches. Described here is a protocol for the application and quantification of this technology to probe PPIs in the C. elegans germline.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates use of the proximity ligation assay to probe for protein-protein interactions in situ in the C. elegans germline.

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

発生生物学

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

生物学

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

免疫・感染学

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

神経科学

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列

要約

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この動画の章

カエノラブディティス・エレガンスにおける倍数性の操作

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

基本的な

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)によるカエノラブディティスエレガンス腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

の発達過程を追跡し、定量化

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列

要約

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カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

基本的な

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

の発達過程を追跡し、定量化

カエノラブディティス・エレガンスにおける倍数性の操作

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)によるカエノラブディティスエレガンス腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化