私たちは、エンゲルマンラボにおけるレトロウイルス組み込み部位の配列決定のためNGSプロトコルを確立することが重要であった助言のための私達の同僚スティーブン・ヒューズとヘンリー・レヴィンに感謝しています。この作品は、米国国立衛生研究所によってサポートされていましたAI039394とAI052014（ANE）とAI060354（エイズ研究のためのハーバード大学センター）を付与します。

The authors have nothing to disclose.

ゲノムの分布パターンのマ​​ッピングを介して、最初のウイルス感染の段階からのレトロウイルス組込み部位の分析のためのプロトコルは、記載されています。このプロトコルは、任意のレトロウイルスと任意の感染可能細胞型にも適用可能です。さらに、アッセイパイプラインは、6.4×10 -5のMOIで開始感染のそれにゲノムDNAと同等の連続希釈液からのユニークな組込み部位の十分な数を回復する可能性のある、非常に敏感です。細胞の小部分のみが組み込まれたプロウイルスを保有します低ウイルス量を含有することができる感染患者からのサンプルに適用すると、この感度は、プロトコルは特に有用となります。この分野36,38,41-43における従来の方法論の論文と一致して、このプロトコルのバイオインフォマティクス部における複数のステップは、配列データの大きなファイルを処理するためにカスタマイズされたスクリプトの開発から利益を得るであろう。 BLAT 58ミリアンペアですがこのプロトコルで説明するユーティリティをpping、ユーザーが適切な代替であるとボウタイ67（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）を見つけることができます。 代替的なバイオインフォマティクスパイプラインは、最近、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）組込み部位19の決意のために報告されました。それは公的に入手可能であり、それはもともと独特のMoMLV組込み部位の数十万人をマッピングするために使用されたことに非常に強力であるスタンドアロンのソフトウェアに開発されたもので、そのパイプラインが便利です。最近、アデノ随伴ウイルスとTol2のを含むように拡張されたしかし、利用可能なソフトウェアは、もともと具体的に報告されたのMoMLVデータセットを再分析するように設計された、などの実験計画（ツールの機能を交互にパイプラインをカスタマイズするために必要となる再プログラミングとAC / Dsのトランスポゾン）が68ベクトル 。また、そのプロトコルは、予備的な組み込み部位の生成を説明し.bedファイル、しかし、ゲノム注釈を関連するサイトをマッピングするために必要な具体的な手順をレイアウトしていませんでした。読者はここに記載されているプロトコルを使用して生成NGS配列を解析するのに有用な現在の原稿の審査中にリリースされた「ベクトル統合サイト分析」サーバ69を 、見つけることができます。 レトロウイルス組込み部位のデータセットを分析するために、任意のプロトコルを使用する場合、特定の点が強調されるべきです。タンデムで複数のライブラリを調製する場合、大きな潜在的可能性は、サンプルの交差汚染のために存在します。サンプルのクロストークのであっても非常に小さいレベルでは使用できないNGSランをレンダリングするレベルに結果を不明瞭にすることができます。したがって、すべてのウェットベンチワークは滅菌、専用の層流フードまたはPCRワークステーションで完了する必要があります。ピペットおよびヌクレアーゼを含まない水などの試薬のセットは、組み込み部位の増幅専用にする必要があります。各ライブラリーを調製するためのユニークなリンカーの使用は、可能性を制限することができますまた、クロスオーバーの同定を可能にするクロス増幅のために、生FASTAファイル内の各ライブラリ内で読み込みます。 ゲノムDNAを断片化するために制限エンドヌクレアーゼ消化に対する超音波処理を使用しての長所と短所を考慮することが重要です。一方で、超音波処理は、せん断点の比較的ランダムな分布を提供していますが、その後に必要なDNA修復およびA-テーリングの手順では、一貫して、制限酵素で生成された粘着末端で行わライゲーションと比較して、リンカーライゲーション生成物の収率を減少させます。一方、制限酵素消化は必ず回復されたデータの一部のバイアスを紹介しますせん断点の少ない支出集団を提供します。両方の場合において、上流のLTR配列を廃棄する制限エンドヌクレアーゼを利用します（ 図1）ゲノム内のその部位の上流に位置する組込み部位のごく一部の損失をもたらします。広告することができます可能性があり、任意のデータの偏りライブラリー調製の間のプロトコルからの酵素消化を省略し、配列決定データから上流のLTR配列を、得られた多数のをフィルタリングすることで服を着ました。 現在のプロトコルは非常に敏感で、ユニークな組込み部位21,40の何百万を生成することが可能であるが、利用可能なすべての統合の約三分の一はあっても、ライブラリの製剤（参考文献の最良と所定の実験で増幅されることが期待されるかもしれない。70そして未発表の観察）。低ウイルス量を抱い低MOI感染や患者からのサンプルを分析する際には、合併症を引き起こす可能性があります。この制限は、繰り返し同じライブラリ調製物を配列決定および/または並列に同一のDNA試料に由来する複数のライブラリを配列決定することによって部分的に克服することができます。アッセイ感度における今後の増加は、それに応じて、レトロウイルス組み込み部位の塩基配列決定の進める翻訳アプリケーションに非常に有益であろう。

宿主細胞ゲノムへのウイルスDNA（vDNA）の統合は、レトロウイルスのライフサイクルに不可欠なステップです。統合を安定挿入プロウイルス1の確立につながる二つの異なる触媒プロセスを実行するウイルス酵素インテグラーゼ（IN）、によって達成されます。サブユニットにある多量2-4によって一緒に保持端vDNAと高次intasomeを形成し、逆転写により生成された線形vDNAの端部に係合します。切断する3&#39;-処理として知られているプロセスにおける配列の3 &#39;下流不変5&#39;-CA-3からvDNAの&#39;末端は、3 &#39;陥凹残す各vDNA末端5-8で反 ​​応性ヒドロキシル基で終わります。 intasomeは、その後、ホストの大規模アセンブリおよびプレインテグレーション複合体（PIC）9-11として知られているウイルスタンパク質の一部として核にインポートされます。細胞標的DNA（TDNA）が遭遇した後、INは3&#39;-ヒドロキシルグロvDNAを使用しています同時に千鳥状にTDNAトップとボトム鎖を切断するアップとは、鎖転移12,13の過程を経てTDNA 5 &#39;リン酸基にvDNAを結合します。 ローカルおよびグローバルなスケールでレトロウイルス展示組込み部位の好み。局所的には、コンセンサス組込み部位は、上流と下流のvDNA挿入部位14,15から約5〜10塩基対から及ぶ弱く保存されたパリンドロームTDNAの配列からなります。世界的に、レトロウイルスは特定のクロマチンの注釈16をターゲットにしています。イプシロン、レンチ、およびspumaを通じてアルファ - 7つの異なるレトロウイルス属があります。ガンマレトロが優先的に、転写開始部位（のTSS）とアクティブエンハンサー領域18-20に統合しながら、HIV-1を含むレンチウイルスは、積極的に転写される遺伝子17の本体内での統合を好みます。著しく対照的に、スプーマを強くheterochromに偏っていますこのような遺伝子に乏しいラミナ関連ドメイン21とATICの地域、。地元のTDNAの基本設定は、INとTDNA 13,22,23間の核の連絡先の特定のネットワークによって決定される大部分があります。レンチウイルス及びガンマレトロのために、ゲノムのアノテーションへの統合の相対は、INと同族の細胞因子24-27間の相互作用によって支配大部分です。因子の相互作用25-27,29-32は、それぞれ、ローカルおよびグローバルレベルでの統合を再ターゲットするための戦略を証明しているIN-ホストIN-TDNAの相互作用ネットワーク13,22,23,28の仕様を変更し、破壊し、またはリエンジニアリング。 レトロウイルスの組み込み部位をカタログするために使用するDNA配列決定手順のパワーは、過去数十年にわたって非常に増加しています。組込み部位は、研究33,34ごとにユニークなサイトのほんの一握りを得るために面倒な精製および手動クローニング技術を用いて、先駆的な仕事に回収しました。外因性の組織培養細胞の感染から回収サイトの数が数千17に数百に増加して、フィールドを形質転換したヒトおよびマウスのドラフトゲノムに個々の組込み部位をマッピングする機能を持つLTR-宿主DNA接合のLM-PCR増幅の組み合わせ、18。 NGSの方法論とLM-PCRのより最近の組み合わせは、ライブラリの深さ急騰を送信しました。 DNAのクラスタリングを使用することにより、配列決定ライブラリがユニークな配列19-21,39数百万を得ることができるしながら具体的には、パイロシーケンシングは、ユニークな組込み部位30,35-38数万のオーダーで得られました。ここでは、DNAのクラスタリングNGSを使用して、レトロウイルス組込み部位を増幅し、配列決定するための最適化されたLM-PCRプロトコルを記述します。この方法は、それによってsequenする前に、追加のアダプターライゲーション工程の必要性を排除し、直接増幅されたDNA分子に、したがって、PCRプライマーに必要なアダプター配列を組み込み、40を cing。 LTR-宿主DNA接合の生配列決定データの解析からのゲノムの機能を適切にする固有の組み込み部位のマッピングのバイオインフォマティクス解析パイプラインは、また、一般的に記載されています。この分野36,38,41-43における従来の方法論のプロトコルから確立された優先順位に応じて、カスタムスクリプトは、バイオインフォマティクスパイプライン内の特定のステップの完了を支援するために開発することができます。プロトコルの有用性および感度は、増幅することにより、代表的なデータで示さシーケンシング、および1.0の感染のおおよその多重度（MOI）、並びに、このDNAの滴定シリーズで感染組織培養細胞からのHIV-1組込み部位をマッピングしています6.4×10 -5のおおよそ同等のMOIを得15625：1の最大希釈の5倍ステップで非感染細胞DNAを介して希釈しました。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibiotics to be added to DMEM</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered saline</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Used to wash cells</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Used to detach adherent cells from tissue culture plates</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>DNA transfection reagent</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m Filters</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Used to filter virus particle-containing cell culture media</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Used to quantify yield of virus production</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Used to purify genomic DNA from cells</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec</td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Used to purify DNA during library construction</td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;-5&#039; exo&amp;ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Deoxyadenosine triphosphate</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends</td></tr><tr><td>DNA Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs &amp;lt;30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Commercial mix containing DNA polymerase for PCR</td></tr><tr><td>dNTPs (100 mM solutions)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Spectrophotometer for determination of DNA concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorimeter</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&amp;reg; 3.0</td><td>Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Used for NGS</td></tr></tbody></table>

amplification, next-generation sequencing, and genomic dna mapping of retroviral integration sites

両方のローカルおよびグローバルなスケールでレトロウイルスの展示署名統合好み。ここでは、（2）各ウィルスのゲノムの位置をマッピングする、ライゲーション媒介PCR（LM-PCR）増幅および次世代シークエンシング（NGS）を使用して、レトロウイルス組込み部位の多様なライブラリーの（1）の生成のための詳細なプロトコルを提供しますBEDToolsを用いて接合をホストし、そして（3）統計的関連性のためにデータを分析します。感染細胞から抽出したゲノムDNAを制限酵素で、または超音波処理による消化によって断片化されます。適切なDNA末端修復した後、二本鎖リンカーは、DNAの末端にライゲーションされ、半ネステッドPCRは、ウイルスの長い末端反復（LTR）の端部と連結させたリンカーDNAの両方に相補的なプライマーを用いて行われます。 PCRプライマーは、別々のアダプターライゲーションのための要件を否定、NGS中にDNAのクラスタリングに必要な配列を運びます。品質管理（QC）は、DNA断片のサイズ分布を評価し、適応させるために行われますNGSの前にDNAの取り込みを小胞体。シーケンス出力ファイルは、LTR-含む読み込みのためにフィルタリングされ、及びLTRおよびリンカーを定義するシーケンスが離れてトリミングされます。トリミングされた宿主細胞の配列は、BLATを用いて基準ゲノムにマッピングされ、参照ゲノムにおけるユニークな点に最小限97％の同一性のためにフィルタリングされます。ユニークな組み込み部位は、様々なゲノム機能に隣接するヌクレオチド（nt）の配列および分布の相対のために精査されています。このプロトコルを使用して、高い複雑性の組込み部位のライブラリーは、三日中のゲノムDNAから構築することができます。組込み部位の解析に影響を受けやすい組織培養細胞の外因性のウイルス感染を包含する全体の手順は、従って、約1〜2週間で行うことができます。この技術の最近のアプリケーションでは、HIV感染患者からの組込み部位の長手方向の分析に関連しています。

表4に、代表的な実験の結果は、感染細胞の培養物からの組込み部位を回収するためのNGSの感度を例証します。非感染細胞DNAが直列平均して各セル一積分40を含有する感染からのゲノムDNAを希釈するために利用されました。 15,625：希釈は1の最大希釈の5のステップで調製しました。滴定シリーズのゲノムDNAは、その後、超音波処理によって断片化または制限で消化することにより、LM-PCRに続いてのMseIおよびBglIIを、エンドヌクレアーゼました。固有の組み込み部位の数、ならびに選択されたゲノム注釈の近位にマッピングするサイトの数は、上記のプロトコルに従って計算しました。データ分析は、理論的には唯一の15625には、感染した細胞から調製したライブラリーから回収されたユニークな組込み部位の数十（ニートゲノムDNAから回収量の1〜2％）を明らかにしました。 </p&gt; 統合サイトのデータセットを分析するとき、マッチしたランダム制御またはMRCと呼ばれるランダムなゲノム部位の一致したセットにデータを比較することが重要です。代表的な結果は、制限酵素消化によって、または超音波処理によって、ゲノムDNAを剪断したように、二つの異なるMRCデータセットを構築しました。 MRC ランダム抱い万のサイトが設定され、ゲノムマーカーからの距離を正規化することなく、生成されたのに対し、MRC ENZは 、無作為のMseIおよびBglII制限酵素消化部位に近接してhg19からサ ​​イトを選択することによって生成50,000ユニークゲノム部位を含んでいます。ユニークなゲノム位置に戻ってマッピングすることができる唯一の​​サイトでは、MRCのデータセットで使用されるべきです。配列の偏りを本質的に含まない超音波処理ばさみゲノムDNAとしては、MRC ランダムは 、超音波処理によりDNAの断片化によって生成されたデータセットへのより適用とみなすことができます。制御統合の代替スタイルサイトデータセットは、LM-PCRおよびNGSプロトコール21以下その後、タンパク質中の組換え体を反応させることにより、in vitroで生成された21 intasome核タンパク質複合体、または脱タンパクのゲノムDNAで急性感染させた細胞17から抽出されたのPICとすることができます。 組込み部位の分布が回復制限消化（比較はきちんとしたサンプル間である）、ならびにランダム MRC ENZとMRCと比較するために、 図2に表示されている。対超音波処理によって回収組込み部位の分布を比較するためのP値次の超音波処理は、CpGアイランドの近くの点で明らかに最大の分散で、酵素調べたすべての注釈のために制限消化によって回収されたものと同様でした。予想されたように18,65の両方のデータセットはのRefSeq遺伝子および遺伝子D内の統合の面でのMRCから有意に異なりました両方のデータセットは、CpGアイランドとのTSSへの分配の相対的な面でのMRCと同様であった一方で、平均積算部位を取り囲むensity。比較的少数のHIV-1の統合サイトはサイトの合計数は回復し増加し、CpGアイランドまたはTSSの2.5キロバイト以内にマッピングするので、データセット（ 表4および図2）との間で発生する可能性が変動性を減少させる可能性が高いです。統合サイトのデータの真正性を確認するためのシーケンスのロゴ、図3に示されている。コンセンサスHIV-1組込み部位14,22（-3）TDG （G / V）TWA（C / B）CHA（7）（生化学ベースコードの国際連合を使用して書かれ、バックスラッシュは参加プラス鎖vDNAの位置を示し、下線は5-bpの配列は、HIV-1の統合およびDNA修復、次の重複を示している）の両方の断片化技術により調製ライブラリのは明らかです、確信度は、感染細胞の増加希釈減少するもののDNA。対照的に、MRCのデータセットから整列ランダムな部位は、基本設定のかなりのレベルを生成することができませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53840/53840fig1.jpg" /> 図1：統合サイトライブラリの準備のフローチャートでは、（A）、48時間後HEK293T細胞、収穫およびフィルタリング上清をトランスフェクトする超遠心分離によって濃縮し、そしてウイルスの適切な濃度で標的細胞に感染させることにより、ウイルスストックを生成します。感染後少なくとも5日間は、ゲノムDNAを抽出します。追加の実験の詳細については、本文のセクション1と2を参照してください。 （B及びC）断片を制限酵素で、または超音波処理による消化により、ゲノムDNAを精製しました。制限酵素カクテルは、下流、上流ウイルスLTRから切断するには、カウンターを選択することを酵素（ 例えば BglIIで）LM-P用を含める必要があります内部vDNA系列のCR増幅。緑色アスタリスク及び（C）中の分枝の矢印をBglIIリンカーライゲーション後に適用されるべきであることを意味します。黒のハイライトは、細胞配列をホストしながら、レッドは、ウイルス配列を強調しています。暗黙のDNAブレークポイント（正確な縮尺ではない）「X」でマークされていHIV-1は、多くのMseIおよびBglII部位を含みます。唯一のプロトコルに関連するものが示されています。マップ上のブラケットは、優先的LM-PCRによって増幅U5、細胞DNAの領域を意味します。 （D）は （その後、超音波処理の場合とテール・修理を終了）および（E）互換性の非対称リンカー分子（青色）に連結断片化DNAを精製します。 （D）におけるマゼンタ円が増幅される組込み部位を示しています。リンカー短鎖の3 &#39;末端におけるアスタリスクは、アミノブロッキング修飾を意味します。 （F）は、最初のラウンドLTRプライマー（赤）とリンカープライマー（青）を使用して、半ネステッドPCRの最初のラウンドを実施します。トンでLTRプライマーは、そのような配列を欠いている間、彼のPCRラウンド、リンカープライマーは、（青リンカープライマーと緑の付属物としてグループ化された）DNAクラスタリングとNGSプライマー結合配列をコードします。 （G）第一ラウンドのPCR産物を精製し、半ネステッドPCRの第二ラウンドを行っています。 PCRのこのラウンドでは、一緒にDNAクラスタリングとNGSのプライマー結合配列を有する第二ラウンドLTRプライマー（赤）と同様に多重化するためのバーコード（と、最初のラウンド（青+緑付属物）と同じリンカープライマーを使用赤LTRプライマーと緑の付属物）としてグループ化されました。 （H）（マゼンタ円でマークされた組み込み部位で、マゼンタに箱入り）の最終統合部位ライブラリように、第2ラウンドのPCR産物を精製します。 QCとNGSのためのシーケンシング施設への一定分量を提出してください。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <imgのALT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53840 / 53840fig2.jpg&quot; /&gt; 図2： 統合サイト増幅の比較のための P 値 は、それぞれのMRC対超音波処理によって、または制限酵素消化によってDNA断片化に続いては、のRefSeq遺伝子内の組込み部位と近くのCpGアイランドとのTSSの数だけでなく、地域の遺伝子密度プロファイルは、に記載されています。太字や斜体で強調表示され≥0.05 表4 P値 Wilcoxonの順位和検定により算出し、フィッシャーの正確確率検定のb P値によって計算されたP値C MRC ENZ：。。。ランダム制御と一致しました。 50,000ユニークな組み込み部位のセットがランダムHGビルドでのMseI / BglII制限部位に近接した位置を選択することにより製造した19 日間 MRC ランダム ：ランダムなSelectIによって生成万のユニークな組込み部位を含むランダム制御と一致しました制限部位近傍に正規化することなくhg19でngの位置。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53840/53840fig3.jpg" /> 図3：代表的な実験ライブラリからの配列ロゴス描いたHIV-1ベースの環境 WebLogoソフトウェアを使用して整列させた制限酵素（A）消化または（B）の超音波処理によって調製したライブラリから統合サイト。一番下にある15625：滴定シリーズの各希釈は1の最大希釈の図の上部にきちんとしたDNAから、描かれています。 （C）50,000ユニークなゲノムサイトのMRCのためのシーケンスのロゴ。エラーバーは、本質的に、任意の特定の位置での塩基の取り込みの標準偏差を表します。具体的には、T各エラーバーのotal高さが比較的小さいデータセット内に存在するエントロピーの過小評価のための制御二回小さなサンプル補正66、と等価です。 x軸は、ポイントゼロでの統合の部位に対して、宿主細胞のゲノムDNAの塩基の位置を表している。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53840/53840table1.jpg" /> 。表1：リンカー構築およびPCR増幅のためのオリゴヌクレオチド配列リンカー固有および第二ラウンドLTRプライマーは、色分けされた次のとおりであるDNAクラスタリングアダプター配列、エンコード：黒、リンカーに、またはHIV-1 LTRと相補的な塩基を、赤、一意のインデックスまたはバーコード;緑、結合部位配列決定プライマー; DNAのクラスタリングのための青、アダプター配列。シングルエンド（SE）のシーケンシングレアペアエンド（PE）の反応は（READ1とREAD2）配列決定プライマーの両方を使用する一方ctionsは、第二ラウンドLTRプライマーREAD1（緑）の配列にアニールする配列決定プライマーを利用します。リンカ短いストランドが変更をブロック3 &#39;アミノが含まれています。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840table1large.jpg" target="_blank">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 反応あたり追加します </td></tr><tr><td>最初のラウンドLTRプライマー（15μM）： </td><td> 2.5μlの</td></tr><tr><td>リンカー特異的プライマー（15μM）： </td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td> 10×PCR緩衝液： </td><td> 2.5μlの</td></tr><tr><td> dNTP（各2.5mM） </td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td> DNAポリメラーゼミックス。 </td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td>ライゲーション反応： </td><td> 100 ngの</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水： </td><td>最大25μlの</td></tr></tbody></table> 表2：第一ラウンドPCRのためのレシピ各個体のPCRチューブに添加される、指定された各試薬の量が示されています。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 反応あたり追加します </td></tr><tr><td>第二ラウンドLTRプライマー（15μM）： </td><td> 2.5μlの</td></tr><tr><td>リンカー特異的プライマー（15μM）： </td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td> 10×PCR緩衝液： </td><td> 2.5μlの</td></tr><tr><td> dNTP（各2.5mM） </td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td> DNAポリメラーゼミックス。 </td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td>最初のラウンドのPCR： </TD&gt; <td> 100 ngの</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水： </td><td>最大25μlの</td></tr></tbody></table> 表3：第二ラウンドPCRレシピ各PCRチューブに添加される各試薬の量が示されています。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ライブラリ </td><td> #Uniqueサイト </td><td> ％のRefSeq A </td><td> ％のCpG +/- 2.5キロバイトのB </td><td> ％TSS +/- 2.5キロバイトC </td><td> 平均。遺伝子密度+/- 500キロバイトdの </td></tr><tr><td>超音波処理、ニート</td><td> 3169 </td><td> 71.2 </td><td> 5.1 </td><td> 3.7 </td><td> 15.8 </td></tr><tr><td>超音波処理、1：5 </td><td> 366 </td><td> 75.1 </td><td> 2.7 </td><td> 3 </td><td> 16.3 </td></tr><tr><tD&gt;超音波処理、午前1時25分</td><td> 254 </td><td> 74 </td><td> 7.1 </td><td> 5.1 </td><td> 16.7 </td></tr><tr><td>超音波処理、1：125 </td><td> 430 </td><td> 69.8 </td><td> 6.9 </td><td> 6 </td><td> 14.6 </td></tr><tr><td>超音波処理、1：625 </td><td> 314 </td><td> 65.6 </td><td> 5.6 </td><td> 6.7 </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td>超音波処理、1：3,125 </td><td> 116 </td><td> 73.6 </td><td> 3.5 </td><td> 2.5 </td><td> 13.1 </td></tr><tr><td>超音波処理、1：15,625 </td><td> 72 </td><td> 62.5 </td><td> 0 </td><td> 1.4 </td><td> 14.7 </td></tr><tr><td>きちんとしたダイジェスト、 </td><td> 7428 </td><td> 69.8 </td><td> 3.6 </td><td> 2.9 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td>ダイジェスト、1：5 </td><td> 1460 </td><td> 71.4 </td><td> 4.4 </td><td> 3.4 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td>ダイジェスト、1時25分</td><td> 394 </td><td> 68.8 </td><td> 4.3 </td><td> 3.3 </td><td> 15.8 </td></tr><tr> &lt;TD&gt;ダイジェスト、1：125 </td><td> 172 </td><td> 71 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 14 </td></tr><tr><td>ダイジェスト、1：625 </td><td> 134 </td><td> 73.9 </td><td> 3.7 </td><td> 3.7 </td><td> 14.1 </td></tr><tr><td>ダイジェスト、1：3,125 </td><td> 100 </td><td> 83.1 </td><td> 6.4 </td><td> 5.2 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td>ダイジェスト、1：15,625 </td><td> 73 </td><td> 74 </td><td> 4.1 </td><td> 1.4 </td><td> 9.7 </td></tr><tr><td> MRC ENZ 電子 </td><td> 50,000 </td><td> 44.7 </td><td> 4.2 </td><td> 4 </td><td> 8.7 </td></tr><tr><td> MRC ランダム F </td><td> 10000 </td><td> 41.3 </td><td> 5.3 </td><td> 4.2 </td><td> 8.6 </td></tr></tbody></table> 表4： 代表滴定シリーズからの統合サイトのゲノム分布番目の合計組み込み部位の割合。TSSの2.5キロバイト内のCpGアイランドの2.5キロバイト内BのRefSeq遺伝子内に入ると、cにおけるD平均積算部位を取り囲む1 Mbの内の遺伝子密度電子 MRC ENZ：。。ランダム制御と一致しました。 50,000ユニークな組み込み部位のセットがランダムにhg19中のMseI / BglII制限部位に近接して位置を選択することで生成されたランダム MRC F：。ランダムに固定された位置に正規化することなく、hg19における位置を選択することにより製造万のユニークな組込み部位を含むランダム制御と一致しました。

Watch this Scientific Journal Video about Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites at JoVE.com

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

amplification-next-generation-sequencing-genomic-dna-mapping

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K ビュー.  Dana-Farber Cancer Institute. We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

ビデオ: Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

遺伝学

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

So this is a 10 day old mouse pup and I'm going to be taking a tail biopsy and then I'm going to extract genomic DNA from its tail. So what I'm gonna do is snip a little bit of its tail off, roughly about three millimeters, and then I'll place the piece of tail in an einor tube and I'll place the einor tube on dry ice. Now, to avoid contamination from one mouse to another, I usually mark the razor blade at the part in which I made the last cut.That way for the next mouse, I'll be sure to use a clean piece of razor blade for taking the next tail biopsy. In order to distinguish between the different mice in your litter, you're gonna need a way to identify the mice. One way to do that is by punching a hole in their ears using an ear hole puncher that's shown here.Gently take the mouse by the scruff of its neck like so turn it over and pinch its tail between your fingers. Take the ear hole puncture in the other hand and make a quick snip in the mouse's ear there. See how painless that was?Okay, so now you can see I've got some pieces of tail in these einor tubes and now I'm gonna add the solutions that will help them to digest. First I'm going to add 720 microliters of STE solution, and then I'm going to add 30 microliters of protein. Ace K.So here's a look at the piece of tail that we've cut prior to digestion.Now I'm gonna place the tail pieces on a 55 degree heating block. Many protocols call for continuous motion rocking at 55 degrees, but for my purposes this won't be necessary because I'll be vortexing the tail pieces. Now I'm gonna vortex the piece of tail for two seconds.One, two. So after vortexing, here's a look at what's left inside the einor tube here, and you could see that the piece of tail has been completely dissolved and activate the proteinase K at 70 degrees Celsius for five minutes. Quench on ice for five minutes.Spin down tail pieces in a micro centrifuge for 10 minutes at full speed. In this micro centrifuge, full speed is 13, 000 RPMs. While the digestive tails are spinning down, label some einor tubes fill the einor tubes with 750 microliters of isopropanol.After spinning down the digested tails, the hair and undigested material will form a pellet at the bottom of the tube decant. The solution containing the digested material, STE and proteinase K into the einor tube containing the isopropanol DNA will begin to come out of solution, will appear ghostlike and feather like, and right there swimming around that bubble is genomic DNA that's been isolated from the mouse's tail. After mixing the isopropanol and STE solution, the genomic DNA will come out of solution and it is appear as this little ball right here, spin down the precipitated genomic DNA for five minutes at full speed in a micro centrifuge.There at the bottom of the tube is a look at our pelleted genomic DNA. Now I'm going to aspirate out the solution inside the tube, leaving only the pellet of genomic DNA behind. Each time I aspirate another tube, I'll change the pipe.Pet tip on the tip of this aspirator. After aspirating away the STE and isopropanol, I'll add one milliliter of 70%ethanol to wash the genomic DNA pellet. Because the pellet of genomic DNA usually adheres to the side of a micro fuge tube and is difficult to get off to thoroughly wash it in the 70%ethanol, you'll need to rake it across the micro fuge tube rack I have here.You can do that like so. So here's a look at the genomic DNA after it's been pelleted and washed in 70%ethanol. I'm gonna spin this down again at full speed for five minutes and then aspirate away the 70%ethanol spin down the genomic DNA pellets after they've been washed.Their 70%ethanol five minutes at full speed, going to aspirate the 70%ethanol and let the DNA dry for five minutes. There's a look at the genomic DNA pellet at the bottom of the tube, and that's about as dry as you want to get it. So I've dried out the pellets of genomic DNA from the mouse tails, and now I'm gonna add a hundred microliters of 40 millimolar triss at pH eight.So I've got the genomic DNA at 50 degrees Celsius, where it will go into solution more rapidly than add room temperature. After about an hour or so at 50 degrees, I'll either freeze it or put it at four degrees until I want to run my PCR reactions to actually figure out which mice are positive for my transgene.

マウスの尾からのゲノムDNAの単離

生物学

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

ゲノムMRI - ゲノムDNA内の配列パターンを研究するためのパブリックリソース

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

線形増幅媒介のPCR  - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

要約

さらに動画を探す

この動画の章