This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.

注：特に指定のない限り、すべてのステップは室温で実施されるべきです。個々の試薬を準備する方法の詳細については、試薬のセクションを参照してください。 1.ラベリングL1プローブ注：プローブは、化学的またはPCRの標識によって標識することができます。 <ol><li> 化学的標識 <ol><li>臭化エチジウム（0.5μgの/ ml）を追加し溶融するまで、電子レンジでトリス - 酢酸-EDTA（TAE）バッファー、暑さの中で0.7から1パーセントアガロースゲルを作成したゲルを冷却することを可能にする、と。ゲルトレイに注ぎ、コームを追加し、ゲルは室温で固化することができます。 </li><li>製造者のプロトコルに従って、37℃で1時間Cy3またはFITCでSNeoプローブ（1-2μgのを）ラベルを付けます。 注：SNeo Sは ネオマイシン遺伝子は、レトロ転位の完全なサイクル後に発現pliced ​​意味します。プローブのサイズは〜千塩基対です。 SNeoは、任意のベクターから、またはGENOMからPCR増幅することができますIC DNA。ストレプトアビジンCY3 / FITC標識試薬の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 </li><li>各ウェルに1×DNAローディング緩衝液、負荷とラベルされたSNeoプローブ溶液を混合し、15〜20分間75-100ボルトで実行します。 </li><li>ウルトラバイオレット（UV）照明装置を用いたプローブバンドを可視化します。 SNeoプローブの大きさを調整し、ロック核酸（LNA）も（ 図2）を加えることができることができることに留意されたいです。 </li><li>きれいな刃でゲルからSNeoの標識プローブの切断は、製造業者のプロトコルに従ってPCRクリーンアップキットを用いてゲルからSNeoプローブを可溶化し、精製します。 注意：カバー保護シールド（ すなわち、実験室のコートとUVクリアなフェイスマスク）との体のあらゆる露出部分のゲルを表示して切断。 PCR産物を精製したゲルへの情報のための材料および試薬の表を参照してください。 </li><li>再実行SNeoの5μlを0.7％アガロースゲル上の未標識SNeoプローブで標識プローブコンする（1.1.1を参照）企業規模の増大や信号強度の損失（ 図2）。 </li><li> 260nmの吸光度を測定することにより、標識SNeoプローブの量を定量し、ヌクレアーゼフリーのH 2 O中に10ng /μlのアリコートにSNeoプローブを希釈分注して-20℃で保管。 </li></ol></li><li> PCRラベリング（プローブ標識のための代替方法） <ol><li>単一のチューブにPCR試薬とSNeo特異的プライマー（5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;および5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;）を組み合わせる：13.6μlのヌクレアーゼフリーのH 2 O; 0.1μlののdATP、dCTPを、dGTPを（10 nM）を、 0.05μlのdTTPの（10 nM）を、 0.05μlのdUTPをビオチン/ dUTPを-FITC / CY3（10 nM）を、 4μlのバッファ5倍タグを移動します。 0.4μlのタグポリメラーゼを行きます。 1μlのSNeoテンプレート（10 NG）。 PCR試薬の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 </li><li>サンプルの総数を乗じて各試薬の量を調整します。 </li><li>以下のPCRサイクルパラメータを使用しますsが増幅し、ラベルSNeoプローブする：2分、95℃; 30秒、30秒、62℃、60秒間72℃、95℃の35サイクル; 2分間72°C;無期限に4℃で保持します。 注：アニーリング温度を調整することができるか、勾配PCRは、他のプローブのための最適なアニーリング温度を決定するために完成させることができます。 </li><li>セクション1.1.1、負荷のように0.7から1パーセントゲルを作成し、セクション1.1.4のようにプローブのバンドを可視化します。 </li><li>セクション1.1.5のようにラベルされたSNeoプローブをカットし、精製します。 </li><li> SNeoの再ラン5μlを（ 図2を参照）信号強度の大きさが増加し、損失を確認するために、未標識SNeoプローブで標識プローブ。 </li><li> 260nmの吸光度を測定することにより、標識SNeoプローブの量を定量し、ヌクレアーゼフリーのH 2 O中に10ng /μlのアリコートにSNeoプローブを希釈</li></ol></li></ol> 2.準備染色体スプレッド<ol><li>ベクター骨格を発現する安定なクローンを生成します（制御L）または標準的な選択方法を使用してレトロ転位コンピL1。12,16非エピソームレポーターは、転写の研究で結果を関連付けるために使用されたが、エピソームベクターを使用することもできます。安定的に制御またはL1ベクトル完全増殖培地中で（必要に応じて作られたプレートサイズの調整と10cmプレートあたり1×10 6個の細胞を、）を発現する細胞を増殖させます。 HepG2細胞は、RPMI-1600、10％FBSおよびハイグロマイシン200μg/ mlのを使用します。 37℃で70％コンフルエンスに培養を成長させ、5％のCO 2。 注：成長培地の選択は、細胞型に依存します。ここで使用されるプラスミドは、ハイグロマイシンおよびネオマイシン両方の選択カセットを運ぶことを指定された、クローンの安定した選択はまた、ハイグロマイシンでの選択の後にネオマイシンを用いて行うことができるが、ネオマイシンの量は、各細胞型のための許容レベルを確立するために最適化する必要があります。 </li><li>培養培地にコルセミド（0.4μgの/ ml）を追加し、metaphで細胞を停止させるために90分間インキュベートASE。異なる種類の細胞を使用している場合は、経験的に最適な中期停止のためのコルセミドと露光時（60、90、および120分）の最適濃度を決定します。 </li><li>洗浄細胞は、細胞に0.25％トリプシン溶液を3-5 mlで添加することによりトリプシン処理し、細胞を分離するために5分間インキュベートし、1×ダルベッコPBS（DPBS）10mlで2倍。 10％FBSを含む培地の等量とトリプシンを不活性化します。 </li><li> 4℃、1,000×gで2分間遠心分離細胞は、細胞ペレットから培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄します。細胞を再懸濁するためにDPBSの200μLを残して吸引し、すべてのDPBS、。確認した細胞を十分に混合され、すべての塊が分散していること。ミックスと塊を分散し、ボルテックスを回避するために、ちらつきや穏やかなピペッティングを使用してください。 </li><li>低張溶液5mlを加える（ すなわち、75 mMの塩化カリウム）で水平15mlチューブを回転させながら37℃滴下する前に温め、20分間37℃でインキュベートします。材料とReagenの表を参照してください。取得し、低張液を作成する方法の詳細については、TS。 </li><li>各洗浄後の細胞を再懸濁するために低張液の約200μLを残して2.5 3X - 5 4℃で分間繰り返し、120×gで遠心分離した細胞は、2.4を繰り返します。 3回の洗浄の最後に、ペレットは目に見えて白と腫れであることを確認してください。 </li><li>カルノア固定液溶液200μlでペレットを再懸濁し、1にする：2、1：4、1：8を、カルノア固定液溶液中で1：16の希釈。上記の約1cmからドライクリーンスライド上に各希釈液10μlを削除し、すぐに30秒を沸騰水から熱い蒸気に広がりのない側を露出させます。カルノア固定剤溶液を作成する方法については、材料および試薬の表を参照してください。 </li><li> 、室温でスプレッドを乾燥コプリンジャーで15-20分間の浸漬によっては0.1μg/ mlのヘキスト33342で染色し、DPBSで3回洗浄します。ヘキスト33342溶液を作製する方法については、材料および試薬の表を参照してください。 </li> &lt;李&gt;表示は40倍の倍率で蛍光/位相差顕微鏡に広がります。スプレッドの準備を最適化した後、スプレッドはヘキスト33342で染色する必要はありません 。ビューは、結果セクションで概説されるように広がり、品質と分離を決定するために10倍の倍率で位相差顕微鏡に広がる（ 図3を参照）。 </li><li>スライド（ すなわち、広がりのない側）とは反対側のダイヤモンドポイントマーカーとの良好なスプレッドを選択し、円。 </li><li>ストアは月まで-20℃で広がります。湿気への暴露を避けます。 </li></ol> in situハイブリダイゼーション（FISH）3.蛍光<ol><li> スプレッドを安定化し、脱水 注：-20℃で保存した場合に平衡化中期染色体を室温に広がります。試薬を入手して作成する方法の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 <ol><li>中期染色体が200μlのRNase Aで広がるインキュベート37℃で1時間。 </li><li>洗浄は、それぞれ10mMのHCl溶液ですすぎ、続いて5分間二回2×SSC、バッファにスライド。 </li><li>脱イオンH 2 Oで洗浄し、5分間ずつ2回-SSC緩衝液で2回洗浄し、37℃で10分間、1％ペプシンでスプレッドをインキュベートします。 </li><li> 10分間、4％パラホルムアルデヒドでスプレッドをインキュベートし、5分間ずつ二回2×SSC緩衝液で洗います。 </li><li> 70％、80％、および95％エタノール：エタノールシリーズ中で2分間インキュベートすることによって広がる脱水。 </li><li>空気乾燥スライド。 </li></ol></li><li> ハイブリダイゼーションは、L1標識レトロ転位プローブ（ すなわち、SNeo）とスプレッド 注意：直接標識プローブの場合は、すべての回で光から遠ざけます。試薬を入手して作成する方法の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 <ol><li> 10分間の72℃でのハイブリダイゼーション緩衝液にSNeo 30ngの、熱を加え、室温で2分間のクール。 </li><li>電子にSNeoプローブ溶液の30μlのを追加ACHスプレッドは、カバーガラスで覆い、ゴムセメントでエッジを封印します。全く泡の形成を確認していません。 </li><li>徐々に37℃まで温度をドロップし、37℃で暗所の加湿チャンバー内で一晩インキュベートし、ヒートブロック上で5分間、72℃でスライドを加熱します。 </li></ol></li><li> 洗濯と表示（または二次抗体の添加） 注意：直接標識プローブの場合は、すべての回で光から遠ざけます。 注：準備する方法については、材料および試薬の表を参照してください。染色体全体の広がりをカバーするのに十分な量の使用が推奨されます。カバーガラスを添加した場合、過剰なボリュームが失われることに注意してください。 <ol><li>カバースリップを削除するには、2×SSC緩衝液でスライドを浸し。 </li><li>洗浄は5分間、45℃で2×SSC、バッファー中に浸漬することによりスライド。 </li><li> 5分間、2×45℃で洗浄緩衝液に浸漬することによってスライドを洗浄します。 </li><li>洗浄は、10分間、45℃で0.1×SSC緩衝液中に浸漬することによりスライド。 </li><li>洗浄は、10分間、45℃で2×SSC緩衝液中に浸漬することによりスライド。 注：場所水浴中で推奨される緩衝液を含むコプリンジャーは、45℃に温度を調整します。 </li><li>室温にスライドを冷却し、検出緩衝液でスライドを平衡化します。 </li><li>直接標識プローブの場合は、3.4.10に進みます。 </li><li>間接的な標識プローブの場合は、20〜30分間、およびブロッキング緩衝液中のブロックは、DPBSで3回洗います。 </li><li> 1時間ブロッキング緩衝液（ 例えば 、5μg/ mlのストレプトアビジン-FITC、またはαCY3）二次抗体を50μlとインキュベートします。 </li><li>洗浄は回5分間、2×SSC中でスライド。 </li><li> 10分間ヘキスト33342溶液（0.1μgの/ ml）で対比染色。 注：この染色はプローブとの共局在化のための染色体を染色するために行われます。 </li><li> DPBS 3倍に洗って、マウンティング培地のドロップを追加し、カバースリップを置き、マニキュアとエッジを封印。 </li><li> 40Xミリアンペアで蛍光顕微鏡を用いて、L1のレトロ転位を分析gnification。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、潜在的な競合する利益を宣言しません。

このような全ゲノムシーケンシング、逆PCRおよびサザンブロッティングなどの方法論は、L1のレトロ転位を研究するために使用されてきました。これらの方法論は、L1の挿入がゲノム内で発生する場所位置で非常に貴重であるが、それらのすべてのための交絡課題は、シーケンスを再構成するためのインシリコプログラミングの必要性があります。ここで説明するFISH法は、特に培養細胞における異所性のL1レトロ転位の分析を必要とする研究の場合には、これらの方法を補完するように設計されています。アプローチは、レトロ転位事象の定量的および定性的評価の両方のために使用し、核を間期に適用することができます。この方法は、異所性L1挿入部位16を決定するために用いられる後続のインシリコ配列アラインメント方法の精度を誇ります。反復配列のアラインメントは、反復sequenながら、によるホモポリマーの形成にあいまいにすることができますCESは、反復配列の過少に結果のテンプレートのプライマー増幅の間に失われる可能性があります。 FISHプローブはホモポリマーにアニールし、完全な反復配列16に対して付勢されそうにないことができるので、FISH法は、これらの問題を克服することができます。また、細胞培養ベースのレトロ転位アッセイに比べて、FISHは、単一の核レベルでのレトロ​​転位率を決定することができます。複数の挿入を単一の核16に発生する可能性がありますなどのように、このアプローチは、レトロ転位率の推定の下と上を両方防ぐことができます。 NGSから得られた最近のデータは、細胞培養ベースの方法論は、レトロトランスポジション頻度25を過小評価していることを確認しています。 若いL1S挿入することを好むとターゲティング機構は、ゲノム内のこれらの挿入を指示するために存在しているかどうかをどこかは不明のまま。上記の方法論を用いて、我々は、L1は 、遺伝子貧しい再に優先的に挿入することが示されていますゲノム16のgions。その他はL1配列の存在量がより少ない遺伝子密度17,18と染色体の増加であることを示しています。まとめると、これらの知見は、細胞への脅威は、ゲノムの「低いアクティブ」領域にL1を挿入することによって最小化され、挿入の規制モードを示唆しています。下等生物における転移因子の動きのパターンは、この解釈にサポートを貸しました。例えば、分裂酵母レトロトランスポゾン、Tf1のは、遺伝子プロモーターの上流の時間の95％を統合し、これらの遺伝子の大部分は、応力調整19,20に関与しています。窒素へのアクセスを欠いている酵母細胞では、Ty5はのORFの代わりにヘテロクロマチン領域21に統合されています。トウモロコシでの実験は、DNAトランスポゾンの統合は多彩なトウモロコシの色の表現型につながることを示したとVvTFL1A遺伝子のプロモーター領域にHatvine1-RRMの DNAトランスポゾンの統合はinfluenすることが示されています分岐パターンとブドウ22,23の果実の大きさをCE。 ここに詳述FISH方法論の成功への重要なステップは、良好な染色体スプレッドと適切な標識、精製およびプローブのハイブリダイゼーションの世代です。プローブが適切に洗浄されていない場合は、得られる高バックグラウンドシグナルは、それが困難な染色体に結合するプローブを解決するために行います。好ましくは、プローブは、ゲル精製したdNTPからの残留蛍光を排除することであるべきです。また、スプレッドはカルノア固定溶液中でインキュベートされる時間の長さは、良好な染色体スプレッドを調製することが重要です。長すぎる場合、細胞膜が早期に破裂し、染色体の損失を引き起こす可能性があります。短すぎる場合、原因欠損破水の適切なスプレッドを得ることが困難となります。ホルムアミドの量/濃度は、染色分のフォーカスを決定し、したがって、最良の結果を得るために実験的に最適化することが重要です。すべての洗浄はENSに徹底すべきですすべての未結合プローブ及び二次抗体が洗い流されているURE。 結論として、ここで説明するFISH法は、完全長および切断型の異所性のL1レトロ転位事象の両方を検出するために使用することができ、レトロ転位インジケータカセットとして緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用して、他のレトロ転位ベクトルに適用することができます。全長L1の挿入は、この方法論を用いて決定することができますが、それが原因で切り捨てL1のゲノム内の数に新たな内因性の切り捨て挿入を識別しません。プローブのアクセスも増加のヘテロクロマチン形成16,24によって制限される可能性があります。しかし、FISHプローブ内のLNAの包含は、プローブのアニーリングを増強するために使用することができます。 SNeoの検出は、レトロ転位およびプローブ/削除を逃したことができるよりも小さい挿入のフルサイクル次第です。 whicでの実験の詳細な説明について時間これらのベクターの使用およびL1タンパク質およびレトロ転位の発現が特徴としているが、公開された作品12,16を参照してください。

人間の長い散在要素-1（ ライン1またはL1）は 、「コピー＆ペースト」レトロ転位機構を介してゲノム内を伝播する自律移動要素です。典型的なヒトL1は 〜6キロバイトの長さであり、プロモーターとして機能5&#39;UTR（非翻訳領域）で構成され、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）：L1 -ORF1とL1 -ORF2、およびポリAとの3&#39;UTR 。コイルコイルドメイン、RNA認識モチーフとC末端ドメイン、L1 -ORF2タンパク質はエンドヌクレアーゼを持っていながら、転写酵素およびシステインリッチドメイン1,2,3,4,5リバース ：尾L1 -ORF1タンパク質は、3つの異なるドメインを持っています。 L1 -ORF2はレトロ転位1,2,6-に必要な両方のタンパク質と、酵素活性を提供しつつ、L1 -ORF1は、核酸シャペロン活性を示します。 L1のレトロ転位のサイクルは、L1の5&#39;UTRからの転写で始まります</RNAポリメラーゼII、細胞質への転座、および翻訳によってem&gt;の二シストロン性mRNAを。細胞質では、L1 -ORF1展示どちらかそれは独自のRNAまたはそれがL1 -ORF2p 7とリボ核タンパク質粒子（RNP）を形成するために他のRNA（ すなわち、SINE / SVAS /偽）をパッケージ化し、トランス -結合をパッケージ化シス -結合、 8。 RNPはOHを露出させるために、L1 -ORF2pニックのエンドヌクレアーゼ活性ゲノムDNA（gDNAを）核内に移行-グループ9、それが素数に逆転写酵素によって使用される順番で、3 &#39;末端からDNAにRNAを合成する逆。逆合成の間、DNAの第二鎖は、署名のL1挿入配列（ 例えば 、TTTTAA）と呼ばれる標的部位の重複（TSD）9,10を形成するために充填されている互い違いの休憩を作成するために、オリジナルのニック部位7から20塩基対をニックが入っています。このプロセスは、ターゲットプライム逆転写（TPRT）として知られており、insertiにつながります挿入配列の両端にTSDSとL1 /他のDNAの完全または切断型コピーの上。L1のレトロ転位はまた、いくつかの細胞型11にTPRT状の非相同末端結合を介して媒介されることが示されています。 私たちの研究で採用さL1のレトロ転位ベクターは、非エピソームであるとタグ付けされたL1 -ORF1＆2P組み合わせたCMV-L1-5&#39;UTRプロモーターによって駆動される（ 図1）12から構成されています。この構築物の以前のバージョンでは、酵母とヒトの細胞培養物13,14,15を用いた研究に記載されています。スプライシングおよび統合後ネオマイシンの発現を駆動するために逆方向に配置された3 &#39;末端を有する、ベクターの5&#39;および3 &#39;末端に位置する2つの別個のCMVプロモーター。 3 &#39;末端のレトロトランスポジションインジケーターカセットは、L1 -ORFsにネオマイシン遺伝子挿入アンチセンスで構成され、グロブによって半分に分離することによって不活性化さスプライスドナー（SD）およびスプライスさアクセプター（SA）部位（ 図1）とイントロンインチ染色体への組み込みの際に、L1はシストロン性mRNAおよび非アクティブネオマイシンのmRNAから構成されてmRNAを生成するために、共通のプロモーターから転写されます。 RNAプロセシングの間に、グロビンイントロンは完全に機能するネオマイシン遺伝子を復元するために、ネオマイシン遺伝子の外にスプライスされます。ハイブリッドmRNAはシスでRNPにパッケージ化し、それがTPRTを使用して、完全長または切断のいずれかの挿入などゲノムに組み込まれている核内に移行されます。 ここでは、単一の核レベルでのL1 -retrotransposiitionパターンと挿入率を追跡するために、具体的スプライシングされたネオマイシン遺伝子（SNeo）に向けプローブを用いたin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光を使用する方法について説明します。検出の効率と特異性は、DETにレトロ転位有能と無能な構築物およびプローブを用いて確認しました電気ショック療法SNeoまたはネオマイシンおよびイントロン接合部16をグロビン。この方法論は、このような複数の挿入、コロニー抵抗、良好なクローンの拡大などの細胞培養ベースのレトロ転位アッセイの欠点のいくつかを占めます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Labeling Probes&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x colorless buffer</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2&amp;nbsp;mM and dTTP to 1.5&amp;nbsp;mM in nuclease free water.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotin (0.5&amp;nbsp;mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0.5&amp;nbsp;mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0.5&amp;nbsp;mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Labeling Kit</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Labeling Kit</td><td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR Clean-Up kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit</td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td></td><td></td><td>Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Preparing chromosome Spreads&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Dilute 1&amp;nbsp;M KCl solution to 75&amp;nbsp;mM solution to make Hypotonic Solution</td></tr><tr><td>Carnoy Fixative Solution</td><td></td><td></td><td>Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1&amp;nbsp;mg/ml.</td></tr><tr><td>Diamond Point Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>R001100</td><td>To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media.</td></tr><tr><td>Cover slides</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.</td></tr><tr><td>Beaker (600&amp;nbsp;ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.</td></tr><tr><td>Nikon Microscope</td><td>Nikon</td><td>125690</td><td>Any microscope can be used to look at spread quality.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents and Materials for FISH&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chroride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1&amp;nbsp;mg/ml.</td></tr><tr><td>Rubber Cement/Cytobond Sealant&amp;nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Seven Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Dark Humidified chamber</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Cover slides</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Dry Digital Heat Block</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Combine 175 g of NaCl, and 88.2&amp;nbsp;g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 &amp;micro;m Filter paper. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;mg/ml of Rnase A</td><td></td><td></td><td>Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1&amp;nbsp;mg/ml. Make fresh solution every time.</td></tr><tr><td>1% Pepsin</td><td></td><td></td><td>Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time.</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60&amp;nbsp;&amp;deg;C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100&amp;nbsp;ml, filter through 0.22 &amp;micro;m Filter paper and store 5 ml aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Thaw aliquot of PFA at 37 &amp;deg;C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Wash Buffer</td><td></td><td></td><td>Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td>Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount.</td></tr><tr><td>Detection Buffer</td><td></td><td></td><td>Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.</td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td></td><td></td><td>Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer.</td></tr><tr><td>Dehydrating Solution</td><td></td><td></td><td>Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.</td></tr></tbody></table>

analysis of line-1 retrotransposition at the single nucleus level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

L1のレトロ転位ベクターの模式図を図1に示されている。ベクターは、センス配向でグロビンイントロンによって中断され、SDおよびSA部位により挟まれているL1のORFに対してアンチセンス配向のネオマイシン遺伝子から成ります。安定して染色体に組み込まれた場合、L1 mRNAが組み合わさCMVおよびL1-5&#39;UTRプロモーター（ 図1）から転写されます。 RNAプロセシングの間に、グロビンイントロンはネオマイシン遺伝子の外にスプライスされます。ネオL1 RNAは、パッケージ化された転座および全長又は切断挿入のいずれかとしてゲノムに組み込まれます。示されるように、L1のレトロ転位は、スプライスネオマイシン（ 図1）に特異的なプローブを用いてFISHによって追跡することができます。 図2は labeleと、ネオマイシンプローブの概略図を示しますdはそれが原因で励起波長の違いにサイズが大きく、蛍光不足しているプローブしました。 CY3とFITCは、臭化エチジウム染色されたDNAとは異なる波長で励起することに注意してください。 2、1：4、1：8と1：16希釈液と10倍の倍率での核からスプレッドの密度、分布および距離の評価を行った各スプレッド（分裂中期の染色体スプレッドの密度は1に、元の原液を希釈することによって決定しました図3A）。結果は、高密度を示し、塊状とスプレッド（ 図3A-I〜II）、ならびに均等に分配し、よく間隔のスプレッド（ 図3A-III〜IV）をアウトバースト。均一な分布は、その後の分析のために選択したと低密度で広がります。 染色体スプレッドは、ヘキスト染料および染色体の長さに基づいて評価広がり品質、Sの丸みで染色しましたPREADSと間染色体の距離（ 図3B）。これらの指標は、細胞は、コルセミド、低張液、カルノア固定液溶液および/または細胞が染色体を解放するために逮捕された方法で処理した時間の長さによって影響を受けました。細胞を低張液中で短時間インキュベートした場合には、染色体スプレッドは、しっかりと結ばれ、個々の染色体が（ 図3B-i）を可視化することは困難であったになりました。一方、低張液中でより長いインキュベーションは、核の破裂で染色体の散乱をもたらし、および/ ​​または染色体の損失（ 図3B-II）。コルセミドでより長いインキュベーションは、中期で細胞の数を増加したが、染色体の凝縮につながる（ 図3B-III）。このように、良質の染色体スプレッドは、コルセミドおよび低張KCl溶液の両方に最適なインキュベーション期間を必要とします。 37での低張液中コルセミド、20で私たちの手で、90分のインキュベーション°Cと細胞破裂する熱蒸気の使用は、高品質の広がり（ 図3B-IV）の生成のための最適条件であることが見出されました。 染色体スプレッドは、L1のレトロ転位がSNeoをターゲットプローブを用いて染色しました。プローブは、いずれの場合もL1のレトロ転位は、野生型L1を発現する細胞でのみ見られることを示すために、FITCおよびCy3の両方で標識しました （ 図4）。染色だけでは、ベクター骨格を発現する細胞において見られなかった（ 図4;各蛍光団のために上部と下部のパネルを比較します）。私たちの手では、プローブ信号は、単一のレトロ転位事象を表す信号の圧倒的多数で、核の百分の80から90で検出されました。私たちは、複数の挿入に核内にレトロトランスポジションを獲得し、スプレッドの品質は常にFISHの前に調べました。 L1の レトロ転位ベクトル の図1.模式図 。図は、完全または切断L1挿入につながる目標プライム逆転写のプロセスを示す。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53753/53753fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53753/53753fig2.jpg" /> 図2. SNeoと非標識ネオマイシンプローブ。標識プローブの展示少ない蛍光を標識し、非標識プローブに比べてサイズが大きくなっている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53753/53753fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3.位相コントラスト（明視野）とヘキスト染色染色体スプレッド。 A）よく間隔の調製物を得るためにスプレッドの希釈を表示します。スケールバーは、スプレッドの品質にコルセミド、低張液、カルノア固定溶液と破裂の影響を示す50μmである。B）ヘキスト染色染色体です。スケールバーは10μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53753/53753fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53753/53753fig4.jpg" /> L1の レトロ転位 の 図4 FISH分析 。SNeoの染色は、対照細胞には存在しないが、L1野生型ベクターを発現する細胞内に存在します。スケールバーは10μmです。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53753/53753fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

単核レベルでのLINE-1レトロ転位の分析

ここでは、安定的に合成LINE-1を発現したHepG2細胞株の染色体スプレッドの単核レベルでのLINE-1レトロ転位を追跡するためにFISH法を採用しています。

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K ビュー.  University of Arizona College of Medicine. ここでは、安定的に合成LINE-1を発現したHepG2細胞株の染色体スプレッドの単核レベルでのLINE-1レトロ転位を追跡するためにFISH法を採用しています。 

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

遺伝学

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

発生生物学

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so by a process called retrotransposition wherein they transcribe to form an mRNA intermediate which is then consequently inserted into the genome by reverse transcription. Despite being silent in normal cells, LINE-1s are highly active in different epithelial tumors. De novo LINE-1 insertions can potentially drive tumorigenesis, and hence it is important to systematically study LINE-1 retrotransposition in cancer. Out of ~150 retrotransposition-competent LINE-1s present in the human genome, only a handful of LINE-1 loci, also referred to as &#34;hot&#34; LINE-1s, account for the majority of de novo LINE-1 insertion in different cancer types. We have developed a simple polymerase chain reaction (PCR)-based method to monitor retrotransposition activity of these hot LINE-1s. This method, based on long-distance inverse (LDI)-PCR, takes advantage of 3&#180; transduction, a mechanism by which a LINE-1 mobilizes its flanking non-repetitive region, which can subsequently be used to identify de novo LINE-1 3&#180; transduction events stemming from a particular hot LINE-1.

This article outlines a simple PCR-based assay to monitor the activity of an active LINE-1 retrotransposon and to map de novo retrotranspositions in a given genome. Using the MCF7 cell line, we demonstrate herein how this method can be applied to detect activity of a LINE-1 located at 22q12.1.

長距離逆PCRによるホットLINE-1のレトロトランスポジション活性の検出

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

がん研究

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and mutagenesis. Understanding the expression patterns of L1 loci at the individual level will lend to the understanding of the biology of this mutagenic element. This autonomous element makes up a significant portion of the human genome with over 500,000 copies, though 99% are truncated and defective. However, their abundance and dominant number of defective copies make it challenging to identify authentically expressed L1s from L1-related sequences expressed as part of other genes. It is also challenging to identify which specific L1 locus is expressed due to the repetitive nature of the elements. Overcoming these challenges, we present an RNA-Seq bioinformatic approach to identify L1 expression at the locus specific level. In summary, we collect cytoplasmic RNA, select for polyadenylated transcripts, and utilize strand-specific RNA-Seq analyses to uniquely map reads to L1 loci in the human reference genome. We visually curate each L1 locus with uniquely mapped reads to confirm transcription from its own promoter and adjust mapped transcript reads to account for mappability of each individual L1 locus. This approach was applied to a prostate tumor cell line, DU145, to demonstrate the ability of this protocol to detect expression from a small number of the full-length L1 elements.

Here, we present a bioinformatic approach and analyses to identify LINE-1 expression at the locus specific level.

RNA 次世代シーケンシングと、遺伝子座固有のレベルで表現されたライン-1s を識別するバイオインフォマティクスパイプライン

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>DNA複製およびフォークストールイベントの解析のための2Dゲル電気泳動

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:病原性リピートのDNA複製の特性評価による複製フォークの停止と拡大のメカニズムの解明

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

マウス心臓前駆細胞からの単一細胞分解能での核単離

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

著者スポットライト:マウス心臓前駆細胞からの核単離によるエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリング(シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリング)  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

単核レベルでのLINE-1レトロ転位の分析

要約

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双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究

長距離逆PCRによるホットLINE-1のレトロトランスポジション活性の検出

RNA 次世代シーケンシングと、遺伝子座固有のレベルで表現されたライン-1s を識別するバイオインフォマティクスパイプライン

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)