Name: evaluation of planar-cell-polarity phenotypes in ciliopathy mouse mutant cochlea
Uploaded: 2016-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
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著者はマシュー・ケリー、ティツィアーナCogliati、ジェシカGumerson、ウーヴェウォルフルム、Rivkaルブロン、ヴィオラクレッチマーとゾーイマンに感謝し、原稿の彼らの重要な評価のためにしたいと思います。この作品は、Sofjaコワレフスカヤ賞（Humbodlt財団）とヨハネス・グーテンベルク大学マインツ、ドイツによって賄われていました。

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The author declares no competing financial interests.

分析のための蝸牛組織を調製する場合、心に留めするためのいくつかの重要なポイントがあります。まず、遺伝的背景の違いは、それが必要なだけ同腹のコントロールを分析し、比較すること、蝸牛の表現型を変更することができます。第二に、被蓋膜の完全な除去は、免疫組織化学で最高の画像を得るために必要とSEMのために必須です。被蓋膜は不透明構造であり、イメージングがより困難に、その下に直接感覚上皮の細胞を曖昧にすることができます。時折処理中に、被蓋膜は有毛細胞を暴く、バック縮むことがあります。これらの場合であっても除去が強くお勧めします。このステップは、忍耐と練習が必要です。第三に、毛様体タンパク質、高度に圧縮された基礎体温に局在し、特にもの、に対する抗体を用いた免疫組織化学は、挑戦することと最適化を必要とすることができます。 permeabilを強化し、抗原の検索を行う考えてみましょう化工程、または固定の濃度または時間を減少させます。 P1を以降ベース - 頂点勾配で - 最後に、運動毛（蝸牛有毛細胞上に見られる一次繊毛）を撮像する場合は、それがP0から退避し始めることに留意してください。運動毛の長さを測定する場合したがって、蝸牛の同じ領域から、年齢一致動物における有毛細胞を比較することが重要です。インターカレートされた支持細胞も後退していない一次繊毛を持っています。ケアは、細胞繊毛と有毛細胞kinociliaを支援区別するために注意しなければなりません。 マウスが成熟するにつれ、それはきれいに起因する一時的な骨や骨迷路の石灰化に、蝸牛感覚上皮を分離することは、ますます困難になります。組織の脱灰は、常に、さらに免疫学的技術と互換性がありませんが、総表現型の検査を可能にしないし、また、SEMの準備と互換性のある、必要とされます。近交系マウスSTRAINSはしばしば知られている聴覚遺伝子またはモディファイ遺伝子の突然変異に、このような有毛細胞の損失または上昇した聴性脳幹反応（ABRに）などの聴覚の欠陥を示します。したがって、年齢マッチした同腹子対照を比較したり、代替の遺伝的バックグラウンドに繁殖することが不可欠です。 この分析の制限の1つは、マウスにおいて、運動毛ポスト出産を後退し始め、もはや成体有毛細胞に存在しない、ということです。この理由kinocilia測定は、組織の開発に行うことができます。また、それは慎重に変異体と対照試料との比較のために、年齢をマッチさせたコントロールを選択する必要があります。別の制限は、毛様体変異マウスは、重度の聴覚障害は表示されませんこれまで分析していること（ すなわち、聴性脳幹反応、のABRまたは耳音響放射、OAEs）蝸牛開発が損なわれてもいます。これと一致し、聴覚欠陥は一般的なヒト繊毛病表現型ではありません。例外的に、hearinの損失グラムは、基礎体タンパク質ALMS1 28,29の突然変異によって引き起こされるアルストレーム症候群の主な機能の一つです。 Vangl2 CKO変異体30について報告されているように、これは、後に開発中のため、バンドルの是正再配向の可能性が高い、stereociliaryバンドル形態は必ずしも繊毛の変異体では、聴覚障害にリンクされていないことを示唆しています。繊毛病スペクトルはアッシャー症候群、聴覚障害者、失明の最も一般的な先天性の原因を含むように広がっている場合は、聴覚機能障害が関連性の高いとなります。最近のデータは、シンドロームをアッシャーに関連するいくつかのタンパク質はまた、繊毛に局在し、毛様体関連プロセス31に関与することが示されているが、これらのタンパク質は、PCPシグナル伝達に関連するかどうかはまだ検討されていません。 今まで蝸牛PCP欠陥について分析ほとんどの繊毛マウス変異体はぼんやりとしか検討されています。この原稿に記載された技術は、広範囲のディテールを可能に間違いなく脊椎動物のPCPシグナル伝達を確立する上で毛様体の関与のより正確な理解につながる蝸牛表現型、。利用可能な繊毛病マウスモデルの多くにもかかわらず、驚くほど少数の蝸牛PCP欠損に関して分析されています。これらのモデルに関連する一般的な落とし穴は、胚性致死です。開発蝸牛が開発耳にPCPに胎生繊毛の役割を調べることができるので、まだ調査することができます。また、非常に初期の胚性致死が条件付きノックアウトを使用して回避することができる。Foxg1 Creが JacksonLaboratoriesから入手可能な32のマウス、一般的にE8.To日から内耳をthedeveloping に関心のinactivategenesに使用されている、努力は主に疾患を引き起こす繊毛病の遺伝子を調べることに焦点を当てていますしかし、他の繊毛関連タンパク質の探査とどのようにこれらは、開発中にPCPシグナル伝達に影響を与えるには、CILに大きな洞察を提供することができますとりわけ生物学および機能。 聴覚表現型が分析されているマウスモデルで疑われる場合は、可能なさらなる分析は、ABRに33またはOAEs 34の聴力テストが含まれます。蝸牛外植片の伸長アッセイ（月- Simera らに記載されているように。2012 25）、また、実行以前発達時点で収束拡張欠陥の識別を可能にすることができます。蝸牛外植片の培養はまた、それによって関連する発達過程のメカニズムの理解に貢献し、外植拡張子を変更することができ、様々なシグナル伝達活性化剤または阻害剤での治療が可能になります。それは運動毛が出生11,13,14後に後退することが知られているが、この後退を十分に毛様体の変異体の文脈において対処されていません。これは、毛様体のプロのための主要な役割こと繊毛mutants.Consideringでkinociliaの出現と後退の時間固有の測定を行うことは興味深いだろうteinsが微小管に沿って貨物の動きであり、これらのタンパク質はまた、細胞骨格35-37に沿って細胞内輸送の側面を調節することができる可能性が高いです。繊毛タンパク質のサブセットは、輸送およびPCP分子8の非対称局在に影響を与えることが示されています。 PCP分子の免疫組織化学による局在化は、そのようなVangl2、Frz3とDSHとして特に膜結合タンパク質は、したがって、PCP分子がmislocalizedされている場合を確立することをお勧めします。極性の確立は、多面的な事件であるように思われる、とも感覚毛細胞38内の正しいPCPのために必要とされる追加の細胞自律的な経路のための証拠が存在します。最近の論文は、Gタンパク質依存性シグナルが細胞自律的な方法39で繊毛の移行を制御することを示しました。極性分子の局在の毛様体タンパク質の役割と一致して、ヘテロ三量体Gタンパク質α-iのサブユニット3（Gαi3）リットルocalizationは蝸牛8,39ノックアウトBbs8とBbs6で破壊されています。 PCPシグナル伝達に対する個々の毛様体の構成要素とそれらの明確な効果の役割を区別することは私たちに正しい極性の確立に繊毛の役割へのより深い洞察を与えるだろう。特に重要なのは、毛様体文脈で機能繊毛タンパク質、対そのような細胞内輸送に関連する非繊毛の調節におけるそれらの役割のような伝統的に考えられて毛様タンパク質の非繊毛機能を区別することです。細胞パターニングおよびstereociliary束方向を含む蝸牛構造の多くの側面において、規則性の高度は、繊毛関連タンパク質の遺伝的または分子の摂動のいずれかに応答してPCPの開発の微妙な変化を検出することができます。多くの繊毛マウスモデルが利用可能であること、現像マウス蝸牛はPCPを検討するための最良の場所の一つであることを考慮すると、シグナルは、個々のタンパク質の変異は蝸牛の開発を混乱させるどの程度学習する非常に興味深いです。

一次繊毛は、ほとんどの哺乳動物細胞の表面から延びる長い微小管ベースの付属しています。一次繊毛常にセルごとに複数存在し、そのうちの多くの場合、運動性繊毛と混同しており、その目的は、膜の表面を横切って流体を移動させることです。一次繊毛は、対照的に、感覚的役割を採用し、その結果、また感覚繊毛と呼ばれます。いったん長い忘れて、この細胞小器官は、最近、ヒト遺伝病1の多数との会合の結果として「再発見」されました。理想的には、シグナリングオルガネラとして位置付け、一次繊毛は、組織の恒常性と疾患ではなく、開発の2の間だけでなく、重要であるそれらの多くは、多数のシグナル伝達経路を調節することが示されています。 繊毛機能不全に関連することが示され、最初のシグナル伝達経路の一つは、平面内細胞極性（PCP）経路としても知られている非標準Wntシグナル伝達経路、ました<sup<html> &gt; 3。最初にショウジョウバエで同定され、このシグナル伝達カスケードは、胚形成のために重要です。特に収束と拡張のプロセスのために上皮4の平面内での細胞の正しい向きのため。調節タンパク質のコアセットのシーケンシャルシグナル伝達は、最終的に細胞骨格の再編成につながると平面5における上皮細胞の協調分極が生じる方向性の手がかりを変換します。収束と拡張のプロセスは絶対に細長くする蝸 ​​牛管のために、正しい携帯パターニング6のために必要とされます。これはPCP経路の活性化を介して調節されるように、蝸牛のPCP変異体の最も印象的な表現型の一つが無秩序な感覚上皮7に短縮蝸牛管です。正確にこれを調節する方法が解明されないままでも同様に、繊毛を欠くマウス変異体は、また、そのような収束と拡張表現型8,9を示します 。 ve_content &quot;&gt;収束と拡張のプロセスは蝸牛管の伸長、および蝸牛管の中の感覚上皮の細胞パターニングのために重要であるため、開発蝸牛は脊椎動物の開発中にPCPシグナル伝達を検討する中で理想的な器官である。器官コルティ、その行蝸牛管を特殊な感覚上皮に与えられた用語は、一様に10を機能させるには蝸牛のために配向させる必要があり、非感覚支持細胞と機械刺激有毛細胞から構成されている。機械刺激有毛細胞がそのように理由で呼ばれていますクチクラ板から延びるstereociliary束それぞれの感覚有毛細胞11の（先端面）。mechanosensationのと不動としての命名法にもかかわらず、一次トランスデューサとしてこれらの行為は、実際に変更されたアクチンフィラメントベースの微絨毛で構成されている。各山形の髪の中でバンドルは、不動の3行は非常に注文し、定期的なPAで構成されています階段のケース状にttern。実微小管ベースの繊毛、kinociliaは、stereociliary 束 12の開発と方向のために必要とされていると呼ばれます。各有毛細胞の際に、一つの運動毛は、物理的に不動の一番高い行に中央に隣接して位置する、不動毛束に取り付けられています。運動毛の正確な機能は不明である、と1の仮説は、彼らが微絨毛12から成熟するにつれて運動毛が形に不動を「引っ張る」ということです。脊椎動物では、蝸牛内kinociliaは一過性のみ存在し、11,13,14を聞くの開始前にマウスでの有毛細胞から退避。 深刻な短縮蝸牛管、誤形成され、誤指向stereociliaryバンドルだけでなく、誤位置付け基礎体8,9の途上蝸牛結果の繊毛の完全な損失。機能的な繊毛はちょうど繊毛軸糸で構成されていません。繊毛に関連した多くのタンパク質機能は、基礎体温、移行帯、または繊毛軸糸15として繊毛関連のサブドメインに局在する複合体で起こります。中心体の母中心小体由来基礎体温は、また、細胞体に繊毛から離れて延びている微小管のための微小管組織化の中心であり、細胞内輸送、ならびに繊毛輸送を調節することができます。毛様体遷移ゾーンは、繊毛機能が毛様体化合物16のインポートおよびエクスポートを整理するのが規制されている別の領域です。 正確なメカニズムは、17不明であるものの、複数の研究は、繊毛および非標準Wnt（PCPシグナリング）との間の接続を確認しています。毛様体およびPCP遺伝子の冗長性と一般化された細胞異常に細胞極性の感度は、それが困難な直接PCP-特定の赤字に変異をリンクすることを可能にします。 PCPシグナル伝達の読み取りアウトの一つは、基礎体温とprimarの位置付けでありますしたがって、2次欠陥から、主なものを分離するのy繊毛は、困難です。ゼブラフィッシュとマウスの変異体におけるいくつかの研究は、18-20シグナリング繊毛およびWnt間の接続を示唆していません。データの矛盾は、種、組織、またはWntシグナル伝達に向かって毛様体の貢献の時間依存性の違いを反映しているのかもしれません。基礎体が機能している場合はさらに、正常なWnt応答性が保持されることがあります。細胞シグナル伝達経路中の毛様体タンパク質の役割をより深く理解し、他の生物学的現象は、細胞および発生生物学の我々の理解のためだけでなく、標的治療戦略の開発のために重要です。

<table><tbody><tr><td>Tools/Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomere - Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td>See Note 2</td></tr><tr><td>Micro dissecting scissors-straight blade</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope.</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uncoated glass microscope slides</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slips (22 mm &amp;times; 40 mm &amp;times; 0.15 mm)</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>&amp;nbsp;Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SEM sample holder</td><td>tousimis</td><td>8762</td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscopy studs</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Tabs: Carbon adhesive</td><td>TED PELLA</td><td>16084-3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue&amp;nbsp;</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Paint Brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times; Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp; (PFA) (EM Grade Required for EM)</td><td>Various</td><td></td><td>Prepare a 4% solution in 1&amp;times; PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.</td></tr><tr><td>2.5% Glutaraldehyde Grade1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7.5)</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Mounting media</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14065</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide (OsO4 )</td><td>Sigma-Aldrich/Fluka Analytical</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti Arl13b</td><td>Protein Tech</td><td>17711-1-AP</td><td>Suggested concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>anti acetylated tubulin (611-B1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>Suggested concentration 1:800</td></tr><tr><td>anti gamma tubulin (GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td>Suggested concentration 1:200</td></tr><tr><td>anti Zo_1&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>40-2300</td><td>Suggested concentration 1:500</td></tr><tr><td>Myosin VI</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6791</td><td>Suggested concentration 1:1000</td></tr><tr><td>Myosin VIIa</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td>Suggested concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>anti Vangl2</td><td>Merk Millipore</td><td>ABN373</td><td>Suggested concentration 1:250</td></tr><tr><td>anti G&amp;alpha;i3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4040</td><td>Suggested concentration 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Suggested concentration 1:300 - 1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Suggested concentration 1:300 - 1,000</td></tr></tbody></table>

evaluation of planar-cell-polarity phenotypes in ciliopathy mouse mutant cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

蝸牛解剖と組織調製 脳を除去した後、P0マウスヘッドの後正中線矢状切開、後ろから見骨迷路は、（ 図1A、白矢印）可視化し、除去することができる。 図1Bは、蝸牛有毛を有する単離骨迷路を示しています、腹、上向き（左）と後ろから、背側（右）。 1は、外側の軟骨の除去を開始することができ、そこから卵円窓に白い矢印ポイント。外側の軟骨が完全に除去された後、露出された蝸牛管は、まだ無傷の（ 図1C）を観察することができます。切開を補助する前庭領域を通るピンの位置決めが示されています。異なる角度で配置された2つのピンは、また、組織を固定するために使用することができる。 図1Dはライスナー&#39;の除去後に蝸牛管を示しています; sの膜とふたとなる膜（左）とそれが免疫組織化学（右）のために実装するための準備として、前庭領域から単離された後、単離された蝸牛上皮のスパイラル。露出された蝸牛毛がどのように見えるかの一般的なアイデアを与えるために、無傷のSEMの製造は、図1Eに示されています。 コントロール蝸牛におけるモルフォロジーと免疫蛍光 蝸牛組織の調製後、コルチ器官を含む蝸牛管の背側表面が露出され、SEMまたは免疫蛍光染色を経由して閲覧されてすることができます。全マウント製剤として見、機械刺激有毛細胞（内有毛細胞の1行外有毛細胞の三列）の4つの列を区別することができる。 図2Aは、マウス胎児蝸牛の基底回転の低倍率図を示しています、fは用意またはSEM。アクチンベースstereociliary束の均一な配​​向および位置合わせに注意してください。さらにstereociliary束の形態は一貫して、各バンドルは、古典を持っている」）」（内有毛細胞の場合）または外有毛細胞の「W」（形状）。この年齢追加の微絨毛に近い倍率時には支持細胞（ 図2B）に有毛細胞の頂端表面上だけでなく、イン間のみならず、有毛細胞見ることができます。これらは、外有毛細胞および成人における内有毛細胞上の2つのstereociliaryバンドルの3行のみを残して後退します。 図2C（白矢印）に見られるように、単一の微小管ベースの運動毛（真の一次繊毛は）各stereociliaryバンドルの頂点に不動の最も高い列に隣接して配置されます。これらはkinociliaリンクを介してバンドルに取り付けられています。 ファロイジン、ラボでの蛍光標識ELSアクチン、対照組織（ 図2D）での束の均一な配向と形状を強調しています。皮質アクチンは、各個々の有毛細胞の頂端円周を決定するのに有用である、ラベル付けされています。ファロイジンとミオシン7aと（ 図2E）、有毛細胞マーカーに対する抗体を用いた同時標識は、また、有毛細胞と支持細胞とを区別するのに役立ちます。ミオシン7aは（ 図3Aを参照）も、蝸牛管の拡張を測定するための有用なマーカーです。アセチル化αチューブリンに対する抗体は、一般的に、微小管ベースの運動毛（ 図2F）を識別するために使用されます。支持細胞は、一次繊毛を抱くように、有毛細胞から出る対の支持細胞を挿入繊毛を区別することが重要です。明らかに蝸牛管の頂端膜のモザイクパターン化の概要を説明し、このようなZO-1（ゾナOccludens 1）に対する抗体などの追加の膜マーカーは、&lt;（そのために有用です強い&gt;図2F）。さらなる検討のアセチル化αチューブリンに対する抗体はまた、内部の微小管にラベルを付けるので、有毛細胞頂端面に焦点を合わせる撮影するときに注意が必要ということです。柱細胞内の微小管は、（ 図2G、白アスタリスク）が特に密です。ファロイジンおよび抗アセチル化αチューブリン標識の組み合わせは、多くの場合、同時にstereociliary束および隣接kinocilia（ 図2G、白矢印）を識別するために使用されます。 繊毛変異体で蝸牛表現型 蝸牛管の伸びが収束と拡張欠陥の最良のリードアウトの一つであり、短縮蝸牛管は、一般的に、古典的なPCP変異体で観察されています。毛様体変異体における蝸牛は、多くの場合、蝸牛管を短くし、感覚epitheの顕著な広がりを示していますIft20 CKO / CKOマウス （ 図3A）に見られてすることができますように頂点でLIA、。 - / -マウスの免疫組織化学を有する（ 図3B、右矢印）の両方とSEM（ 図3C）とBbs8に見られるように、別の古典的なPCP欠陥は、蝸牛有毛細胞の均一な配向の破壊です。誤指向の束に加えて、平坦化と奇形バンドルはまた、一般的に（ 図3B、中央の矢印; 図3D）が観察されます。多くの場合、 図3Eに見られてすることができますように時間円形バンドルは、特にkinociliaを完全に欠い有毛細胞に存在します。運動毛の誤局在はまた、一般的です。 誤局在する運動毛はまたはstereociliaryバンドル（; 図3F 図3B、左矢印）に添付してもしなくてもよいです。府を定量化する方法の例ndle向きとkinociliaまたはバンドル位置決めは、図3Gおよび 3Hに示されています。各個々の束の方向は、その後、内側と外側の有毛細胞を分離ピラーセルの行に垂直に延びる直線に対して束の相対的な回転を決定することによって評価することができます。通常の方向を有する細胞は、この垂直軸に沿って整列し、そのように0°（ 図3G）の回転を持っています。運動毛の位置、またはstereociliary束の中心は、有毛細胞の管腔表面上の位置のグリッドを重ね、その後、グリッド（ 図3I）内kinociliaまたはバンドルの場所を決定することにより、プロットすることができます。繊毛の遺伝子の変異は、多くの場合、繊毛の長さに影響を与えるので、運動毛の長さを評価することができます。 Cep290 RD16 / RD16突然変異体では、kinociliaは、コントロール（ 図3J）よりも長くなっています。繊毛の後退として、年齢一致した同腹仔を持つようにし、蝸牛の同じ領域からの測定値を取ることが重要です。分析と定量化のための良好な画像を得るためには、免疫組織化学およびSEMの両方のために、被蓋膜を除去することが重要である。 図3Fは被蓋膜が完全に除去されていない中でのSEM顕微鏡写真を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig1.jpg" /> 開発マウス蝸牛（P0）の 図1. 解剖。（A）P0マウスヘッドのミッドラインサジタル解剖脳を取り外しました。骨迷路の位置に白矢印ポイント。解剖骨迷宮の（B）の腹側（左）と背側（右）の景色。蝸牛は、卵円窓に下部白矢印点で前庭部分と上の方に位置しています。 （C）骨迷路の後方蝸牛の外側の軟骨のER除去。ピンは、前庭系を通って配置されています。 （D）左、ライスナーの膜と被蓋膜を除去した後、Cの場合と同じビュー。取り付けの準備ができて右、孤立蝸牛管。感覚上皮を含む蝸牛管の床を、露光そのまま露出蝸牛スパイラルの（E）走査型電子顕微鏡写真。スケールバーは100μmです。 （A - D）。月-Simera らから適応、2012年25 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53559/53559fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig2.jpg" /> コントロール蝸牛図 2.モルフォロジーと免疫蛍光 （A - C）。基礎TURの走査型電子顕微鏡写真n個の胚（E18.5）における野生型蝸牛。内有毛細胞（下）と外有毛細胞（上）の3行の1つの行を分離し、支持細胞によってインターカレーションされています。山形stereociliaryバンドルは一様に、各有毛細胞（画像の上端）の横方向の縁部に向かって方向付けます。 E18.5で、追加の微絨毛はstereociliaryバンドル、およびインターカレートされた支持細胞（B）の下に、有毛細胞の頂端面を覆います。 （C）単一微小管ベースの運動毛（白矢印）は、横方向のエッジからここに示した、バンドルの頂点に位置しています。基底回転の出生後1日目（P1）は、野生型蝸牛の- （D G）免疫蛍光染色。ファロイジンは細胞周辺（D、E、G）で不動と皮質アクチンで繊維状アクチンにラベルを付けます。ミオシン7aは、内側と外側の有毛細胞（E）のマーカーです。 Zo_1は、細胞BOUNDAを区別すること偉大なマーカー作り、中に-間の細胞のタイトジャンクショ​​ンをラベルリース（F）。アセチル化αチューブリンは、バンドル（F、G白い矢印）の頂点での運動毛のマーカーとして使用されます。内部微小管はまた、柱細胞に豊富特定されているアセチル化αチューブリン、（G白い星印）により標識されています。スケールはバー：10μmで、B：5μmで、C：1μmで、DG：5μmで<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53559/53559fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig3.jpg" /> 繊毛変異体図3.蝸牛表現型。対照と比較しIft20 CKO / CKO蝸牛管の（A）著しい短縮。 E18.5での解剖蝸牛管は、アセチル化チューブリンで染色しました。 （B </Bbs8における基底蝸牛ターンの強い&gt;）ホールマウントの画像- / -変異体（P0）。ファロイジンで標識された繊維状アクチン、不動（赤）、アセチル化チューブリン、kinocilia（緑）。 Bbs8でStereociliaryバンドル- / -蝸牛可変（右矢印）を回転させるには、（中央の矢印）平坦化および/ ​​またはmislocalized。 Kinociliaはmislocalizedされているか、軸糸（左矢印）不足しています。 （C - F）Bbs8でstereociliaryバンドルとkinociliaの高倍率SEM - / - OHCS。 Cでは 、バンドルを回転させ、Dは 、Eでは 、円形のバンドルをバンドルを平らにし、Fでkinociliaをmislocalized。 （G - I）バンドル異常定量化の概略図。 （G）左、凸部（高さ）をバンドル。バンドルの頂点とバンドル「腕」の両端を通って延びる線との間の最短距離。 dと黒い実線によってepicted。バンドル下右、面積;エリア。 （H）stereociliary束の配向を定量化するために使用される基準の概略図。束の回転角度は、柱セルの行に対して垂直に延びる線に対して計算されます。 （I）kinociliaとstereociliary束の位置分析のための基準の概略図。セグメント化されたグリッドは、有毛細胞の円周上に敷設され、位置は指摘しました。ファロイジン標識不動毛束（赤）の（J）より高倍率の画像とP0蝸牛外有毛細胞のアセチル化チューブリン標識kinocilia（緑）。隣接する単色パネルでは、赤い線がコントロール（白矢印）に比べCep29の RD16 / RD16の変異体では長いkinociliaを識別します。 （K）被蓋膜の除去が不完全で胚蝸牛のSEM顕微鏡写真。規模バー：100μmで、B：5μmで、C - F：2.5μmで、I：5μmで、J：50μmです。 （A - F）。。。月-Simera らから変更された、2015年8、J重版レイチェルらからの許可を得て、2012年27 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53559/53559fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

evaluation-planar-cell-polarity-phenotypes-ciliopathy-mouse-mutant

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K ビュー.  Johannes Gutenberg-Universität Mainz. Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

ビデオ: Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

発生生物学

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

神経科学

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

In vitroモデルとしての新生児蝸牛外植片全体

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

生後マウスにおける聴覚ブラの解剖：中耳の骨の単離および組織学的解析

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

生物学

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>マウスの内リンパ嚢の解剖

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

マウスの内リンパ嚢の解剖

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...