Name: dissolution dynamic nuclear polarization instrumentation for real-time enzymatic reaction rate measurements by nmr
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
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著者は、有益な議論のための機器の選択と組み立てアシストするために博士のJJのファン・デル・クリンク、ならびに博士F.カテブ博士G. Berthoに感謝します。 ACは、スイス国立科学財団（PPOOP2_157547を付与する）によってサポートされていました。私たちは、パリソルボンヌシテ（NMR @コム、DIM解析、ヴィル・ド・パリ、財団デラRECHERCHEMédicale（FRM ING20130526708）、およびParteneriatヒューバートCurienブランクーシ32662QKから融資を認めている。私たちのチームはEquipexプログラムパリ・アン・共振の一部でありますそして、CACSICE。

注：すべてのデータ分析は、市販のソフトウェアを用いて行きました。 1.偏光液を調製<ol><li> 1.12 M 13 C標識ピルビン酸ナトリウム（のNa + [CH 3 -CO- 13 COO] - 、基板）の2ミリリットル準備ラジカルTEMPOLの33 mMの（でドープされた解決策4 -ヒドロキシ- 2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル、偏エージェント）4 2：1、D 2 O / D 13 C観測のための6 -エタノール。注意：使用上の注意点によるD 6 -エタノールの引火性の性質のために注意する必要があります。 </li><li>ラジカル濃度が達成分極の面で最適であることを確認します。 <ol><li> （30 mm以上35 mmで、 例えば ）少しポイント1.1での溶液のラジカル濃度を変更します。 </li><li>反復固体増強を決定する（ステップ3を参照）、最大向上につながるラジカル濃度を見つけます。 </li></ol></li></ol> 2. Polarizatイオン<ol><li>クールダウンの手順で、DNPのクライオスタットの温度を下げます。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「クールダウン」ボタンをクリックします。 </li><li>充填手順を通じてDNPのクライオスタット内の液体ヘリウムを収集します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「充填」ボタンをクリックします。 </li><li> DNPの偏光板が設けられた試料容器中のステップ1.1から最適化された偏光の溶液300μLを置きます。穏やかに液体窒素浴中に浸漬することによって内部に試料と試料容器を凍結。 </li><li>液体窒素浴から試料容器を抽出し、逆さまに回転させることによって凍結手順（ステップ2.3）後の試料容器中に存在し得る液体窒素を排除します。 注：この手順は（ステップ5を参照）、サンプルの完全な溶解を得ることが重要です。 </li><li>クライオスタット内に試料を挿入します。 注：このセントEPは、以下のサブステップから成る、（ すなわち 、未満10から20秒で）融解からサ ​​ンプルを防ぐために迅速に実行する必要があります。 <ol><li>サンプルホルダーに試料容器を挿入します。主クライオスタットインサートに試料ホルダーを挿入します。サンプルホルダーにマイクロ波の導波管を挿入します。 </li></ol></li><li> 1 K冷却手順を開始することにより、クライオスタットの温度を下げます。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「1K冷却」ボタンをクリックします。 </li><li>上のマイクロ波源をオンにして、サンプルを照射します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「MW-ON」ボタンをクリックします。 </li></ol> 3.固体NMR測定<ol><li> 90°コネクタ反時計方向に回転し、それを引いて、分光器コイルからNMRコンソール検出チャンネルの同軸ケーブルを外します。クライオスタットの同軸コネクタに検出チャンネルの同軸ケーブルを差し込みNMRコイル。オリエンテーションピンに着目し、クライオスタットのNMRコイルのメスコネクタにNMRコンソールケーブルのオスコネクタを挿入します。しっかりと押して、90°コネクタを時計回りに回転させます。 </li><li> T = 5分の間隔で繰り返さ未校正し、低フリップ角パルスでシンプルなパルス取得シーケンスを使用して、クライオスタットサイトで固体状態でNMR熱信号を測定します。測定を設定した後、ソフトウェア「ZG」のコマンド行で記述し、Enterキーをキーボードのキーを押してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li><li> DNP-強化されたNMR信号を測定します。第2節で説明したように、DNPプロセスを開始した後、ステップ3.2の動作を繰り返します。 </li><li> 90°コネクタ反時計方向に回転し、それを引いて、クライオスタットのNMRコイルからのNMRコンソール検出チャンネルの同軸ケーブルを外します。 DETEの同軸ケーブルを差し込み分光器コイルの同軸コネクタにctionチャンネル。オリエンテーションピンに着目し、分光器コイルのメスコネクタにNMRコンソールケーブルのオスコネクタを挿入します。しっかりと押して、90°コネクタを時計回りに回転させます。 </li></ol> 4.メインマグネットフィールド（ &#39;シミング&#39;）の均一性を最適化<ol><li>分析計内で前の実験（ すなわち 、ステップ6.2の後）で製造された混合物の500μLを含むチューブを置きます。 </li><li>最大値を探索するシミング勾配コイルの電流を変化させることにより、NMR分光計のシミングを行う重水素の信号を「ロックします」。 NMRコンソールに対応するボタンを押すことにより、関連するシミングコイルを選択します。 <ol><li>ロック信号を増加させ、回転方向を決定するためにNMRコンソール上のノブを回します。信号が最大に達するまで回転し続けます。別のシミングコイルを選択し、最大化解除を繰り返しますすべてのシムコイル用の極大ゴマ発見されました。詳細については、NMR分光計の取扱説明書を参照してください。最後には、ロックに用いたサンプルを削除します。 </li></ol></li></ol> 5.解散<ol><li>溶解挿入ボイラーでD 2 Oの5ミリリットルを挿入します。加圧するとT≈180〜200゜Cに達するまで抵抗ワイヤによってD 2 Oを加熱します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「ヒーターの準備」ボタンをクリックします。 </li><li>サンプル偏光手順の完了後（ 例えば 、3 T DNP後）は、室内圧力よりわずかにクライオスタットを加圧します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「SSオペレーション」ボタンをクリックします。溶解インサートからのマイクロ波ガイドを削除します。 </li><li>サンプルホルダーにダウン溶解インサート（ 図3B）をスライドさせ（ 図3A-C）。溶解インサートは、サンプルホルダーの底に達する必要があり、クライオスタットでD 2 O漏れを回避するために、試料容器との漏れ止め接続を行うためにしっかりと押さなければなりません。 </li><li>溶解シーケンス、空気弁の操作の予め定めタイミングシーケンスを開始するために、ハードウェア・トリガ（ 図3C-h）を押してください。 </li></ol> 6.インジェクション<ol><li>解散場所の前に5ミリメートルのNMRチューブ、500μlのサンプルを含む（ 例えば 、D 2 Oのために<img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> 11.74 T NMR分光計のアイソセンタのステップ9での酵素活性の測定のためのステップ8からステップ7またはLDH溶液中で測定）、（ステップ4を参照）。 </li><li>ただ、解散（ステップ5）した後、ステップ6.1にNMR分光器に置かれた試料に過分極溶液500μlを混合します。 <ol><li>マニュアルインジェクション：過分極を収集NMR分光器の磁石の近くに配置されたガラスビーカー中で2.5メートルの長い移送管の終わりにソリューションを提供します。手動でカスタムメイドのキャピラリシステムを介してNMR試料管に過分極溶液500μlを注入。 </li><li>自動注入：溶解工程の前に、転送に使用されるヘリウムガスから過分極ソリューションを分離する自動化されたカスタムメイドの噴射装置へ移送管を接続します。デバイスは自動的にサンプル管に過分極溶液500μlを実現します。 </li></ol></li></ol> 7.液体状態NMR測定<ol><li>溶解後、基板（A）の磁化の進行及び製品（B）に追従するために1.5秒だけ離れた10°のフリップ角パルス取得一連のシーケンスにより分光器のサンプルからのNMR、超偏極信号を測定。測定を設定した後、ソフトウェアのコマンドラインで「ZG」を書いて、キーを押します＆＃39; &#39;キーボードのキーを入力してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li><li>磁化が完全に緩和すると（ すなわち 、T = 10、T 1の後）、90°のフリップ角パルス-取得T = 3 T 1≈3分だけ離れた配列を一連のNMR熱信号を測定します。測定を設定した後、ソフトウェア「ZG」のコマンド行で記述し、Enterキーをキーボードのキーを押してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li></ol> （ピルビン酸から乳酸の変換のための具体的な）酵素含有試料の8準備<ol><li>以下のレシピとの反応緩衝液を調製：50mMの0.1 Mリン酸緩衝液中でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、1mMのエチレン - ジアミン四酢酸（EDTA）、0.1mMのジチオスレイトール（DTT）を低減し、pH値=7.0。 </li><li>ウサギ筋肉LDH溶液を20μg/ mlのウシ血清アルブミン、BSAとの反応緩衝液中で新たに調製した1 U / mlで調製します。 </li><li> 20μlのD 2 Oは、分光器の磁場安定化（ &#39;ロック&#39;）を可能にし、2μlのLDH溶液（ステップ7.2）するために、478μlの反応バッファー（ステップ8.1）を混ぜます。 </li><li> 5ミリメートルのNMRチューブにステップ8.3で調製した500μlの溶液量を置き、500 MHzのNMR分光計にチューブを置きます。 </li></ol> 9.完全な酵素反応速度測定手順<ol><li>偏光の試料（ステップ1）を準備し、（ステップ2）それを偏光。 </li><li>分光計（ステップ4）にシミング実行し、酵素サンプル（ステップ8）を準備します。 </li><li>溶解（ステップ5）、注射（ステップ6）を実行します。 </li><li> 1.5秒（ステップ7）離れた10°のフリップ角パルス買収に過分極サンプルからの一連の信号を測定します。このステップでは、過分極を測定することができます信号減衰および代謝産物の信号の蓄積。 </li></ol> 10.フィッティング<ol><li>ステップ9.4において取得された各スペクトルについて、それぞれ（A）及び生成物（B）が、基板と、それらを統合するために対応するピークを同定する（ピークの面積を決定します）。ピークの積分は、磁化の経時変化を信号（M（A、B）（t）は、式2を参照）を得ました。 </li><li>方程式の解を使用すると、（2）、F =（R A + K EFFの値を決定します ）ステップ10.1に統合された基板の信号の単純な指数関数フィットから。 </li><li>値F =（R の A + K effはを使用して、 ）ステップ10.2において判定式を積分した機能を持つ製品信号Mの B（t）の適合からのk effは及びR Bを決定する（2）。代表的な結果セクション（Enzymatを参照してください。反応モデリング、フィッティングおよびRF補正の詳細については、ICの活動と代謝の測定値）。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言

溶解DNP NMR実験の重要なポイントがある：（i）実験のために必要な最低の生成物濃度と同様に行わ及び（ii）可能な信号取得回数を決定した基板、のために達成分極レベル寿命偏光と検出サイト間および基板変換率への転送の持続時間に比べて、磁化。本明細書中に記載の溶解DNPセットアップの噴射システムは、わずか3-4として秒のサンプル転送を可能にします。転送はS.ボーエンとC.ヒルテ?...

<table><tbody><tr><td>DNP polarizer</td><td>Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)</td><td>///</td><td>Cryostat and electronic equipment for sample polarization</td></tr><tr><td>Vacuum system components</td><td>Edwards vacuum (France)</td><td>Various</td><td> &lt;p&gt;- turbomolecular pumping setup&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- membrane pumping setup&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- high capacity roots pumping system&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- vacuum fittings and components&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>DNP 3.35T Magnet</td><td>Bruker (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 MHz NMR Spectrometer</td><td>Bruker (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (US)</td><td></td><td>Data analysis software</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;4-Hydroxy-TEMPO 97%</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer, pH&amp;nbsp;=&amp;nbsp;7.0</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDH enzyme in&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin, BSA</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissolution dynamic nuclear polarization instrumentation for real-time enzymatic reaction rate measurements by nmr

NMRベースの調査の主な制限は、低感度です。これにより、代謝変換のリアルタイムNMR測定を防止し、長い取得時間を入力するよう求められます。溶解DNPを介した過分極は、電子・ツー・核スピン分極移動に起因する大規模なアウトオブ平衡核磁化のおかげで感度の問題の一部を回避します。得られた高NMR信号は、リアルタイムでの化学反応をモニターするために使用することができます。過分極NMRの欠点は、関連付けられた緩和時間定数のオーダーで、好ましい場合において、核スピン縦緩和時間定数、T 1、または程度で通常の信号取得のための限られた時間ウィンドウ内に常駐結合された核の一重項状態、T LLS。内因性分子および代謝速度の細胞取り込みは、腫瘍の発生と薬剤応答に不可欠な情報を提供することができます。ニューmerous以前の過分極NMR研究は、 インビボでの酵素活性をモニタリングするための代謝基質としてピルビン酸の関連性を実証しました。この作品は、特に、過分極NMRによる乳酸脱水素酵素（LDH）の存在下でピルビン酸対乳酸の変換率を、酵素反応の研究に必要な実験装置と方法の詳細な説明を提供します。

溶解DNPを使用して、NMR信号ゲイン DNPの効果は、サンプルのマイクロ波照射下、NMR活性核に、典型的には安定したラジカル分子から、不対電子スピンの高い偏光の伝達にあります。最も頻繁に使用されるフリーラジカルは、TAM（OXO63）およびTEMPOLある。TEMPOLを用いて4偏光手順は「交差偏光」によって最適化することができる。25 <p class="jove_content...

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Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

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10.6K ビュー.  Université Paris Descartes. The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

ビデオ: Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have emerged in conjunction with the state-of-the-art positron emission tomography with 18F-fluorodeoxyglucose ([18F]-FDG PET). 13C magnetic resonance spectroscopic imaging (13CMRSI) is a minimally invasive imaging method that enables the monitoring of metabolism in vivo and in real time. As with any other method based on 13C nuclear magnetic resonance (NMR), it faces the challenge of low thermal polarization and a subsequent low signal-to-noise ratio due to the relatively low gyromagnetic ratio of 13C and its low natural abundance in biological samples. By overcoming these limitations, dynamic nuclear polarization (DNP) with subsequent sample dissolution has recently enabled commonly used NMR and magnetic resonance imaging (MRI) systems to measure, study, and image key metabolic pathways in various biological systems. A particularly interesting and promising molecule used in 13CMRSI is [1-13C]pyruvate, which, in the last ten years, has been widely used for in vitro, preclinical, and, more recently, clinical studies to investigate the cellular energy metabolism in cancer and other diseases. In this article, we outline the technique of dissolution DNP using a 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer and demonstrate its usage in in vitro studies. A similar protocol for hyperpolarization may be applied for the most part in in vivo studies as well. To do so, we used lactate dehydrogenase (LDH) and catalyzed the metabolic reaction of [1-13C]pyruvate to [1-13C]lactate in a prostate carcinoma cell line, PC3, in vitro using 13CMRSI.

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

過分極<sup&gt; 13</sup&gt; C代謝磁気共鳴分光法とイメージング

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

がん研究

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

生化学

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due to fundamental constraints imposed by the hyperpolarized state, exotic imaging and reconstruction techniques are commonly used. A practical system for characterization of dynamic, multi-spectral imaging methods is critically needed. Such a system must reproducibly recapitulate the relevant chemical dynamics of normal and pathological tissues. The most widely utilized substrate to date is hyperpolarized [1-13C]-pyruvate for assessment of cancer metabolism. We describe an enzyme-based phantom system that mediates the conversion of pyruvate to lactate. The reaction is initiated by injection of the hyperpolarized agent into multiple chambers within the phantom, each of which contains varying concentrations of reagents that control the reaction rate. Multiple compartments are necessary to ensure that imaging sequences faithfully capture the spatial and metabolic heterogeneity of tissue. This system will aid the development and validation of advanced imaging strategies by providing chemical dynamics that are not available from conventional phantoms, as well as control and reproducibility that is not possible in vivo.

A multi-compartment dynamic phantom is used to simulate some biology of interest for metabolic studies using hyperpolarized magnet resonance agents.

過分極磁気共鳴剤の研究のための多区画動的単一酵素ファントムの使用

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

工学

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important biological processes. Understanding how the balance between structure and dynamics governs biological function is a new frontier in modern structural biology and has ignited several technical and methodological developments. Among these, CPMG relaxation dispersion solution NMR methods provide unique, atomic-resolution information on the structure, kinetics, and thermodynamics of protein conformational equilibria occurring on the &#181;s-ms timescale. Here, the study presents detailed protocols for acquisition and analysis of a&#160;15N relaxation dispersion experiment. As an example, the pipeline for the analysis of the &#181;s-ms dynamics in the C-terminal domain of bacteria Enzyme I is shown.

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the  &#181;s-ms Timescale

Here, a detailed description of the protocol implemented in the laboratory for acquisition and analysis of 15N relaxation dispersion profiles by solution NMR spectroscopy is provided.

15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。<em&gt;インビボ</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

生物工学

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...

化学

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various factors affect the relaxation rates, such as buffer composition, solution pH, temperature, and magnetic field. In this last regard, the spin-lattice relaxation time can be measured at clinical field strengths, but at lower fields, where these compounds are dispensed from the polarizer and transported to the MRI, the relaxation is even faster and difficult to measure. To have a better understanding of the amount of magnetization lost during transport, we used fast field-cycling relaxometry, with magnetic resonance detection of 13C nuclei at ~0.75 T, to measure the nuclear magnetic resonance dispersion of the spin-lattice relaxation time of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Dissolution dynamic nuclear polarization was used to produce hyperpolarized samples of pyruvate at a concentration of 80 mmol/L and physiological pH (~7.8). These solutions were rapidly transferred to a fast field-cycling relaxometer so that relaxation of the sample magnetization could be measured as a function of time using a calibrated small flip angle (3&#176;-5&#176;). To map the T1 dispersion of the C-1 of pyruvate, we recorded data for different relaxation fields ranging between 0.237 mT and 0.705 T. With this information, we determined an empirical equation to estimate the spin-lattice relaxation of the hyperpolarized substrate within the mentioned range of magnetic fields. These results can be used to predict the amount of magnetization lost during transport and to improve experimental designs to minimize signal loss.

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

We present a protocol to measure the magnetic field dependence of the spin-lattice relaxation time of 13C-enriched compounds, hyperpolarized by means of dynamic nuclear polarization, using fast field-cycled relaxometry. Specifically, we have demonstrated this with [1-13C]pyruvate, but the protocol could be extended to other hyperpolarized substrates.

過偏光のスピン格子緩和磁場依存性の測定[1-13C]ピルビン酸

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

<meta charset="utf8"></head><body>蛋白質の動力学の調査のNMR 15Nの緩和およびhetNOEの実験のためのプロトコル

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide groups of the protein backbone or the methyl groups in side chains are used as reporters of structural dynamics in proteins. A structural dynamics study of the protein backbone of globular proteins on 15N labeled and fully protonated samples usually works well for proteins with a molecular weight of up to 50 kDa. When side chain deuteration in combination with transverse relaxation optimized spectroscopy (TROSY) is applied, this limit can be extended up to 200 kDa for globular proteins and up to 1 MDa when the focus is on the side chains. When intrinsically disordered proteins (IDPs) or proteins with intrinsically disordered regions (IDRs) are investigated, these weight limitations do not apply but can go well beyond. The reason is that IDPs or IDRs, characterized by high internal flexibility, are frequently dynamically decoupled. Various NMR methods offer atomic-resolution insights into structural protein dynamics across a wide range of time scales, from picoseconds up to hours. Standard 15N relaxation measurements overview a protein&#39;s internal flexibility and characterize the protein backbone dynamics experienced on the fast pico- to nanosecond timescale. This article presents a hands-on protocol for setting up and recording NMR 15N R1, R2, and heteronuclear Overhauser effect (hetNOE) experiments. We show exemplary data and explain how to interpret them simply qualitatively before any more sophisticated analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:NMR緩和実験による本質的に不規則なタンパク質ダイナミクスの探索

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can characterize structural protein dynamics in a residue-specific manner. We provide a hands-on protocol for recording NMR 15N R1 and R2 relaxation and {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE) experiments, sensitive to the picoseconds to nanoseconds timescale.

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

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過分極

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

過分極磁気共鳴剤の研究のための多区画動的単一酵素ファントムの使用

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

¹⁵μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

過偏光のスピン格子緩和磁場依存性の^測定[1-13C]ピルビン酸

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR ¹⁵N緩和実験

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR ¹⁵N緩和実験