Name: fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids
Uploaded: 2016-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.

倫理文：フィールドサンプリングおよび動物対象を含む手順は、ノッティンガム・トレント大学の動物、農村環境科学（ARES）科で承認されています。 糞便サンプルの1コレクション注：糞便サンプルおよびメタノールを取り扱う際は手袋を着用する必要があります。動物が人獣共通感染症に苦しんでいることができることを強い疑いがある場合は、そのような白衣などの防護服も着用してください。 <ol><li>排便、次の（数時間に分以内）できるだけ早く糞便サンプルを収集し、サンプルバッグに入れます。約10グラムの総重量で任意の排便サンプルの3つから5つのサブサンプルを取ります。 、収集の時刻と日付で袋にラベルを付け、個々のID、および分析まで-20℃でサンプルを凍結します。 </li><li>エラーを最小限に抑えるために、全てのサンプルは-20℃で凍結します °Cまでの研究である完全な単一のバッチとして分析のために一緒にサンプルを収集します。&lt;/李&gt; </ol> 2.糞便ホルモンの抽出<ol><li>室温で解凍し糞便サンプルを残します。 </li><li>サンプルは手動で独自のサンプルバッグ内の各サンプルを混合することにより均質化されていることを確認。 </li><li>各サンプルについて、その後8ミリリットルのガラスバイアルに糞を転送計量ボートに天秤に糞便材料で（0.003グラム±）0.50重量を量ります。各試料についての新しい計量ボートを使用して、各試料間の30％メタノールでピンセットをクリーニングします。 </li><li>糞便物質の0.5グラム、90％メタノール5mlでコンバイン：水、そして室温でオービタルシェーカー上でO / Nを振ります。 </li><li>翌朝は、サンプルをボルテックスした後、600グラムで20分間遠心します。 </li><li> 37℃の温度に設定した水浴中のラックに16×125 mm 2のガラス管と、所定の位置にメタノール画分をデカント。ドラフトチャンバー内の空気を使用して乾燥するまで蒸発させます。抽出用容器をすすぎ、処分のための医療廃棄物袋に残った糞石を配置します。 </li><li> 、100％で1ミリリットルのメタノールを糞便抽出物を再懸濁し、12×75ミリメートル2ポリプロピレンチューブに移します。すぐに分析するまで-20℃でキャップや店舗。 </li></ol> 3.ホルモン分析<ol><li>ポリクローナルコルチコステロンCJM006抗血清を用いて、酵素結合イムノアッセイ（EIA）との分析を行います。 注：第二EIAは（コルチゾールR4866抗血清を試験したが、これは（4.1節を参照してください）​​ポリクローナルコルチコステロンCJM006抗血清およびコルチゾールR4866抗血清とそれぞれのHRPのがCJマンロー、カリフォルニア大学によって供給されている生化学的検証ステップを達成するために失敗しました、デイビス、カリフォルニア</li><li>繰り返しのピペットと50μlのピペットチップを使用して、コーティング緩衝液（0.05 M炭酸水素ナトリウム、pHは9.6）で15,000、50μl/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートをロード：1で抗血清を希釈します。プレートシーラーでプレートを覆い、4℃でO / Nインキュベートします。非特異的結合ウェル（Nを表現するためにコーティングされていない2つの井戸を残しますSB）。 </li><li>使用直前に自動マイクロタイタープレート洗浄機（; 0.15MのNaCl、0.05％ツイーン20洗浄液）を用いてマイクロタイタープレートを5回洗浄します。 </li><li>千PG / - NSBのためのウェルあたり50μlのと「ゼロ」のウェル[EIA緩衝液（0.1 MのNaPO 4、0.149 MのNaCl、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.0）でのみ]、標準（コルチコステロン、3.9でプレートをロードウェル）または糞便抽出試料（適切に1時20分EIAバッファーで希釈し、4.1節を参照してください）​​。標準とゼロはそれぞれ、三重および四重に実行する必要があります。希釈した糞便抽出試料とNSBのは、二重に実行する必要があります。 </li><li> 7万：50μlの/ウェルを加え1にEIA緩衝液で希釈したラベル西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートᵻですぐにこれに従ってください。 </li><li> RTで2時間、暗所でマイクロタイタープレートをインキュベートします。 </li><li>洗浄溶液でマイクロタイタープレートを5回洗浄し、100μl/ WELと暗闇の中で、室温でプレートをインキュベートRT基板のL [0.4mMの2,2&#39;-アジノ-ジ（3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩、1.6mMのH 2 O 2、0.05 Mクエン酸、pHを4.0]。使用直前に基板を準備します。 </li><li>マイクロタイタープレートを読み取るために405nmの波長で分光光度計を使用してください。ゼロウェルの光学濃度が0.8〜1.0に達したときに、プレートのインキュベーションが完了したと見なされます。 </li><li>再現性を保証するために、約30％（EIA規格）、50％（生物学的サンプル、 例えば、国内の馬の糞便抽出液のプール）、70％（EIA規格）に結合するためにEIA緩衝液で希釈したコントロール[EIA規格または生物学的サンプルを使用]は、それぞれ&lt;10％の変動と&lt;15％の内およびアッセイ間の係数を実証します。 </li></ol> 4.酵素結合免疫測定法：研究種の検証とセックス<ol><li>生化学的検証（並列処理） <ol><li> EIA緩衝液を使用して、プールされた糞便余分に連続希釈を行いますCT、理想的には、いくつかの個体から疑われる高および低ホルモン濃度のサンプルから採取した（範囲：ニート、1：8192：2〜1）および第3章で説明したようにEIA上で実行されます。 注：糞便抽出物の連続希釈が標準曲線と直線回帰の結果に変位曲線を平行に得たときに並列処理が達成されたと見なされはR2&gt; 0.90、スロープ&gt; 0.50およびp &lt;0.05を示しています。標準曲線に50％前後を結合する段階希釈糞便抽出物は、すべての糞便抽出物を実行するために理想的な希薄化を考慮すべきである（ 例えば、1時20分）。線形回帰の結果はR2&gt; 0.90およびp &lt;0.05を実証するときにアッ​​セイに考え干渉はありません。 </li></ol></li><li>生化学的検証（干渉） <ol><li>適当に希釈したプールされた糞便抽出液200μlで連続的に希釈した標準液200μl（ゼロ、3.9〜1000 ngの/ウェルコルチコステロン）のスパイク[50％に希釈したparalleliによって決定バインディングSM（1時20分）]およびEIA分析プロット次のセクション3のようにEIA上で実行観察濃度マイナス予想濃度対バックグラウンド（ゼロサンプルの濃度）。 注：標準の希釈プールされた糞便抽出物の添加が有意量予想と線形回帰の結果を変更しない場合はR 2&gt; 0.90、1.0およびp &lt;0.05に近い傾斜をもたらします。 EIAとの干渉が達成されていません。 </li></ol></li><li>生物学的検証： 注：選択されたEIAは、関心のホルモンの生物学的に関連する変化を測定する能力を持っていることを実証[ 例えば、薬理以下のグルココルチコイド濃度の上昇（ACTHは、多くの場合、ライセンス手続きである）または生物学的課題（ 例えば、心理学的および/ ​​または環境;日和見無秩序なイベントである可能性がより高いです）]。 <ol><li>グルココルチコイド代謝物濃度のために糞便サンプルを選択し、抽出して分析します挑戦的なイベントの前と後の3 - セクション1に詳述プロセスを使用して。 注：挑戦的なイベントは、特定の種​​になります。例示的な方法は、国内の馬のために以下に提供されます。馬のための挑戦的なイベントの完全な例は、管理9と飼育手順16の使用を含め、以前に発表されています。挑戦的なイベント次のグルココルチコイド代謝物濃度の有意な上昇が観察され、統計的分析を用いて確認する必要があります。これは、適切な場合には反復測定は、サンプルの日付と個々の効果を組み込む必要があります。生物学的検証は、次に達成と考えられています。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

糞便のコルチコステロン分析は、ウマにおいて副腎活動の長期的パターンを評価する手段を提供します。方法の非侵襲的な性質は、唾液、血漿分析9を含む副腎活性を評価するために使用される他のサンプリング方法の交絡効果を克服します。自由変動の馬を研究する場合に加えて技術は明確な非侵襲的な利点を有しています。 このメソッドとその適切な利用に関する議論には、いくつかの重要なポイントがあります。プロトコルにおける重要なステップは、質問と適切な抗体の選択における種のためのアッセイの検証です。使用した抗体は、構造的に似ていますが、機能的に異なるグルココルチコイドの代謝産物と交差反応する場合、これは結果17を混乱させる可能性があります。したがって、ホルモンの代謝物を測定するためのアッセイは、文献18,19に、プロトコルDESCR内に存在するその詳細は、慎重な生理学的または生物学的な検証が必要ibed。 糞便試料の条件は両方のホルモン代謝産物レベル20に影響を与えることが示されているサンプルおよび環境曝露の鮮度などを考慮する必要があります。過度の雨や日光曝露は、細菌代謝21による代謝産物濃度の増加または減少を引き起こすことが知られています。鮮度の様々な程度のサンプルを収集したい研究者は、環境への影響に加えて、試料の完全性に対する時間の影響を調査しなければなりません。これは、気候変数に新鮮さと露出度を変化させて、小さな実験を設定し、定期的に男性と女性の個人からの糞便をサンプリングすることによって、従来の研究に行うことができます。 ほとんどの研究のシナリオでは、既知の個体由来のサンプルは10人または必要であろう。国内の馬では、これはdefaecationのグループを監視またはIDに摂取された食物のマーカーを使用することによって達成することができます大きなグループ12内の個人から糞をentify。フリーの範囲の種において、これは、個々の追跡が必要とされるようにかかる時間を証明することができます。 グルココルチコイド分析の方法を選択する際には、糞便コルチコステロンアッセイの結果は、時間の経過にプールされたサンプルではなく、時間の測定値の時点を表すことを考慮しなければなりません。そのため、データにはあまり変動があります。研究者は、状況の長期的な影響に関心がある場合、畜産技術や管理の実践は、その後、糞の分析は、適切な技術を提供しています。ホルモン濃度の短期パターンの評価が必要とされる場合、血漿または唾液分析は、好ましい方法です。

この方法は、副腎活性の非侵襲的評価を提供するために馬の糞便中のコルチコステロン濃度を分析することを目的とします。視床下部 - 下垂体 - 副腎（HPA）軸の活性を測定すると、キャプティブと国内の両方の種において潜在的に嫌悪事態への対応を研究するための一般に認められた手法です。参考技術と最も広く使用される方法は、しかしながら、例えば、糞便分析などの別の方法は、遊離の範囲の種を監視する能力を採血自体によって誘発されるストレスを克服し、可能にするために開発されてきた血漿1の使用です。 嫌悪状況の間に、生理的恒常性が破壊されています。下垂体前葉に作用し、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）の放出を刺激ホルモン放出ホルモン（CRH）の副腎皮質脳のリリースでは視床下部。 ACTHは血流に入り、種を分泌する副腎皮質を刺激しますsの特定のグルココルチコイド（GC）。グルココルチコイドは密接ではなく、一貫したがって、彼らはしばしば他のストレスリンクのホルモン2の上に優先的に測定されているすべてのエネルギーの高まりの状態で製造されるよりも、ストレスの多いイベントにリンクされています。グルココルチコイドは、馬のいくつかの適応効果を担当しています。エネルギーが急速に酸素摂取量を増加させ、脂肪酸およびグルコースの形で体内の貯蔵部位から動員され、感覚機能は、3と、血流を向上さ動き4に必要でない領域まで低下します。同様に対処メカニズムとして機能するように、グルココルチコイドの応力誘起される上昇はまた、次のストレッサー5のために動物を準備するのを助けることができます。 血漿および唾液中のホルモンのレベルを評価することは、糞便中の代謝物の測定は、ホルモンの代謝最終産物を測定し、しかし実際の循環ホルモンを測定することを含みます。循環ステロイドはリットルに異化されています彼らは腸のトラック6内細菌叢の酵素活性によって容易にさらなる変化を受ける胆汁に排泄前にアイバー。したがって、血液グルココルチコイドに向けイムノアッセイは、糞便、グルココルチコイド代謝物7の分析に適していないかもしれません。 糞便収集が馬に乱れを行うことができるように、コルチコステロンのための糞の分析は、多くの状況でHPA活性をモニターするために広く使用されています。馬の糞便中の上昇コルチコステロンは、術後獣医の治療8の間にあり、限定ハウジング9に含む潜在的嫌悪状況に応じて報告されています。糞便サンプルは、時間をかけてプールされたグルココルチコイドレベルではなく、血漿および唾液長期的に監視することが適切で作る、慢性または季節的パターン10によって提供される時間サンプリング点を反映しています。非侵襲性に起因し方法の性質は、サンプルを捕捉または拘束具11を必要とせずに、個々の繰り返し収集することができます。サンプリングプロトコルを計画する際しかし、種特異的腸通過時間を考慮しなければなりません。馬では、腸の通過時間は約18時間12したがって、副腎応答およびその後のコルチコステロン代謝物は1日HPA軸の初期起動後に糞便中に検出することができます。 非侵襲的なイムノアッセイ技術を利用する場合検討さ種について注意深く検証は13不可欠です。また、ホルモンの代謝物の排泄の性差が原因で、マウス14、鶏15を含む様々な種に排泄コルチコステロン代謝物の代謝速度とタイプの違いにおそらく報告されています。アッセイは目に詳述されているように男性と女性の国内の馬の両方で使用するために検証されたそのため、この方法の一部として重要でした電子プロトコル。男女間のホルモン代謝におけるこの違いは、アドレス指定されず、アッセイの検証の一部として含まれているまれまだデータ品質に対する影響を有しています。 この非侵襲的方法は、国内のウマにおける副腎活動の長期評価を可能にします。プロトコルの詳細分析の検証およびアッセイ技術自体の両方。

<table><tbody><tr><td>Corticosterone antibody &amp;amp; HRP kit</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td></tr><tr><td>Cortisol antibody &amp;amp; HRP kit</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td></tr><tr><td>Corticosterone synthetic standard hormone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50-23-7</td><td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Cortisol synthetic standard hormone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15087-01-1</td><td>Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-56-1</td><td>Irritant. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>497-19-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10049-21-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-92-9</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>ABTS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30931-67-0</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 4</td><td>VWR</td><td>332732B</td><td></td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 7</td><td>VWR</td><td>332742D</td><td></td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 10</td><td>VWR</td><td>332762H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td>Irritant. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>BFS-525-010A</td><td></td></tr><tr><td>Air compressor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer +printer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fridge-freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drying apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>+tubing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flammable liquid storagecabinet</td><td>VWR</td><td>649-002</td><td></td></tr><tr><td>Fume cupboard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot-plate stirrer</td><td>VWR</td><td>640-282</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate washer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&amp;reg; pipettes - multipack option 2</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 1,000 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 200 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 20 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette filler</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Progen Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Hilsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water purification system</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

国内馬（N = 16は、8頭の牝馬、8去勢馬）15年（±3）の平均年齢と性別に応じてグループ化され、社会的孤立のレベルの増加と4住宅のデザインを施した（n = 4の馬/処理）しました。密接に彼らの自然の生息地をシミュレートし、群れ環境に住んでいる住宅1関与馬。屋内納屋でペアに住んでいる住宅2関与馬。ハウジング3関与馬は厩舎ではなく、他の馬と馬のハウジング4関与総分離を視覚的に接触して、単独で収容しました。 各治療への曝露は、5日間の期間のための無作為化ブロック設計でした。次のこの馬は次の住宅治療への曝露前の2日間、彼らの実験群に草のパドックに判明しました。糞便サンプルは、1日目、2日に一度回収し、3は、n = 8頭の馬から各住宅の治療（内過ごしました各処理内のn = 2の馬）。糞便サンプルは、できるだけ早くと排便後1時間以内として収集しました。馬がハウジングの治療に導入された後初日の最初のサンプルは、少なくとも20時間を集めたことが全てのサンプルは、厩舎の意味の最初のフルの日に1200時間後に採取しました。初日、2および3（住宅の設計あたり24サンプルの合計）からの試料は、消化物12の通過速度に起因し、過去18時間の反射糞便コルチコステロンレベルについて評価しました。同じ個々の馬は試験を通じて糞便分析に使用しました。追加の測定パラメータを含む、この生物学的課題の詳細については、国内の馬のための挑戦的なイベントの9代替例も文献16に見出すことができる公開された作業を参照してください。 このセクションでは、両方のCORのための生化学的検証（並列処理）の例の結果を提供します男性と女性の国内の馬の糞中ticosteroneとコルチゾール。このセクションでは、糞便抽出し、EIA分析から得られた代表的なデータを提供します。結果は、馬の行動や生理9時に、住宅の設計に起因する社会的孤立の影響を調べた大規模な研究の一環として得られました。 生化学的検証の結果コルチコステロンEIAは、副腎活性を測定することが適切であることを明らかにした[ 図1（a）のオスのサンプル％結合= 25.349 + 0.729（標準％結合）、R2 = 0.9545、F（1、7）= 146.710、よりP少ないです0.001）; 図1Bの女性サンプル％結合= 29.989 + 0.7198（標準％結合）、R2 = 0.95594、F（1、7）= 151.865、コルチゾールEIA【 図1Cの男性サンプル％結合のp 0.001未満]ではありません= 79.089 + 0.0629（標準％結合）、R2 = 0.175、F（1、7）= 1.485、P = 0.262）; 図1D女性サンプル％結合= 81.652 + 0.0772（標準％結合）、R2 = 0.257、F（1、7）= 2.422、P = 0.164]。コルチコステロンEIAは、コルチコステロン上のコルチゾールEIAと干渉試験とは異なり、並列性を実証したようEIAは、予想される量を変化させなかったコルチコステロン規格に希釈した糞便抽出物の添加として、マトリックス干渉の証拠がないことを明らかにした（男性：観測= + 1.017 1.302（予想されます） 、R2 = 0.9972、F1、7 = 1287.128、P &lt;0.001;女性：観測= 0.3169 + 1.0931（予定）、R2 = 0.9972、F1、= 2432.65 7、P &lt;0.001;）。 EIAの結果は、雄ウマ（M = 37.7、SD = 14.1）と雌馬の間のコルチコステロンレベルにおける有意差がなかったことを明らかにした（M = 33.8、SD = 12.7、T（70）= 1.23、P = 0.22） 。分離のレベルが増加するにつれて糞便コルチコステロンのレベルが増加しました。孤立した馬（住宅の設計4）が大幅高でしたえー糞コルチコステロンのレベルは、他のすべての住宅の設計（; P≤0.02ウィルクスラムダ= 0.58、F（3、18）= 4.29、P = 0.01、多変量部分イータ二乗= 0.42）と比較します。他の住宅の治療と比較した場合、糞便のコルチコステロンのレベルが最も孤立した筐体の間にすべての3つのサンプルの日にすべての馬のために高かったです。それぞれの日のそれぞれのハウジングデザインの平均糞便のコルチコステロンの濃度を表1に示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53479/53479fig1.jpg" /> 男性と女性の馬のためのコルチコステロンおよびコルチゾール酵素結合免疫測定法の図1.生化学的検証（並列処理）。この図は、上の増加コルチコステロンおよびコルチゾール標準曲線濃度に対する男性と女性の国内の馬の糞便抽出物の連続希釈プールの結合パーセントを詳述EIA。結果は実証しますコルチコステロン（A、男性; B、メス）とないコルチゾールEIA（C、オス、D、女性は）。コルチコステロンEIA標準曲線と成功した変位曲線を平行にもたらした<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53479/53479fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table><tbody><tr><td rowspan="3"></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> EACH住宅の治療における平均（±SD）糞便のコルチコステロン濃度（ng / g）を </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 住宅治療 </td><td> 1日目 </td><td> 2日目 </td><td> 3日目 </td><td> 全体 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></tD&gt; </tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 31.73±10.2 </td><td> 32.18±8.0 </td><td> 29.22±5.9 </td><td> 31.05±7.​​8 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32.75±10.0 </td><td> 33.66±12.9 </td><td> 34.67±9.3 </td><td> 33.69±10.3 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 35.06±14.6 </td><td> 35.14±15.9 </td><td> 33.13±12.5 </td><td> 34.44±13.6 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td></td><td></td><td> * </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 38.16±17.8 </td><td> 42.00±16.7 </td><td> 41.52±17.6 </td><td> 40.56±16.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 各住宅治療における3日間のための日1つ、2つ、3つ及び平均糞便コルチコステロン濃度（ng / g）のために、各住宅の治療のための糞便コルチコステロン濃度（ng / g）を（全体）（±SD）を表1の平均。この表が示します糞便コルチコステロン濃度（ng / g）との平均値は初日、2と3の間に住宅の各処理のための標準偏差を±します。馬は、ハウジングに入った後、試料を少なくとも20時間に採取しました。また、各住宅の治療に（全体の）すべての3日間平均値±標準偏差糞便コルチコステロン濃度（ng / g）を示しています。糞便コルチコステロンconcentratイオンは、単離された住宅の設計時に（*）が有意に高かったです。すべての日のための糞便のコルチコステロンの最低濃度は、グループに収容され、治療（治療1）で発見されました。生理学や行動のジャーナルからの許可を得て、Yarnell ら （2015）から適応。

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Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K ビュー.  Nottingham Trent University. Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

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Systematic Assessment of Well-Being in Mice for Procedures Using General Anesthesia

In keeping with the 3R Principle (Replacement, Reduction, Refinement) developed by Russel and Burch, scientific research should use alternatives to animal experimentation whenever possible. When there is no alternative to animal experimentation, the total number of laboratory animals used should be the minimum needed to obtain valuable data. Moreover, appropriate refinement measures should be applied to minimize pain, suffering, and distress accompanying the experimental procedure. The categories used to classify the degree of pain, suffering, and distress are non-recovery, mild, moderate, or severe (EU Directive 2010/63). To determine which categories apply in individual cases, it is crucial to use scientifically sound tools.
The well-being-assessment protocol presented here is designed for procedures during which general anesthesia is used. The protocol focuses on home cage activity, the Mouse Grimace Scale, and luxury behaviors such as burrowing and nest building behavior as indicators of well-being. It also uses the free exploratory paradigm for trait anxiety-related behavior. Fecal corticosterone metabolites as indicators of acute stress are measured over the 24-h post-anesthetic period.
The protocol provides scientifically solid information on the well-being of mice following general anesthesia. Due to its simplicity, the protocol can easily be adapted and integrated in a planned study. Although it does not provide a scale to classify distress in categories according to the EU Directive 2010/63, it can help researchers estimate the degree of severity of a procedure using scientifically sound data. It provides a way to improve the assessment of well-being in a scientific, animal-centered manner.

We developed a protocol to assess well-being in mice during procedures using general anesthesia. A series of behavioral parameters indicating levels of well-being as well as glucocorticoid metabolites were analyzed. The protocol can serve as a general aid to estimate the degree of severity in a scientific, animal-centered manner.

全身麻酔を使用してプロシージャのマウスにおける体系的な評価

In keeping with the 3R Principle (Replacement, Reduction, Refinement) developed by Russel and Burch, scientific research should use alternatives to animal ...

行動学

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial species, the koala (Phascolarctos cinereus), faces prolonged exposure to anthropogenic-induced stressors and assessment of chronic stress in wild populations is urgently warranted. One of the most effective ways to measure chronic stress is through analyzing the glucocorticoid hormone cortisol in hair or fur, as it supports physiological and behavioral responses. This laboratory validation study aims to test current techniques to validate an optimal hormone extraction method to be used as a non-invasive measure of cortisol in koala fur. It is recognized that using non-invasive techniques to measure stress hormones is preferred over traditional, invasive techniques due to their ideal practical and ethical standpoints. Additionally, it is comparatively easier to acquire fur from koalas than it is to acquire samples of their blood. This study used samples of koala fur acquired from the Adelaide Koala and Wildlife Hospital to run a number of hormone extraction techniques in an attempt to validate an optimal cortisol extraction method. Results showed that 100% methanol provided the most optimal solvent extraction compared to 100% ethanol or 100% isopropanol based on parallelism results. In conclusion, this method of cortisol extraction from koala fur provided a reliable non-invasive assay that could be used to study chronic stress in koalas.

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

We present a protocol to determine the optimal extraction solvent to measure cortisol from koala fur. The solvents used in this protocol are methanol, ethanol and isopropanol. Determining an optimal extraction solvent will aid in reliably measuring fur to determine the impact of chronic stress on koalas.

コアラでのコルチゾール測定(ファスコラルコトス・シネレウス)毛皮

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

生化学

A Cross-Disciplinary and Multi-Modal Experimental Design for Studying Near-Real-Time Authentic Examination Experiences

Over the past ten years, research into students&#39; emotions in educational environments has increased. Although researchers have called for more studies that rely on objective measures of emotional experience, limitations on utilizing multi-modal data sources exist. Studies of emotion and emotional regulation in classrooms traditionally rely on survey instruments, experience-sampling, artifacts, interviews, or observational procedures. These methods, while valuable, are mainly&#160;dependent on participant or observer subjectivity and is limited in its authentic measurement of students&#39; real-time performance to a classroom activity or task. The latter, in particular, poses a stumbling block to many scholars seeking to objectively measure emotions and other related measures in the classroom, in real-time.
The purpose of this work is to present a protocol to experimentally study students&#39; real-time responses to exam experiences during an authentic assessment situation. For this, a team of educational psychologists, engineers, and engineering education researchers designed an experimental protocol that retained the limits required for accurate physiological sensor measurement, best-practices of salivary collection, and an authentic testing environment. In particular, existing studies that rely on physiological sensors are conducted in experimental environments that are disconnected from educational settings (e.g., Trier Stress Test), detached in time (e.g., before or after a task), or introduce analysis error (e.g., use of sensors in environments where students are likely to move). This limits our understanding of students&#39; real-time responses to classroom activities and tasks. Furthermore, recent research has called for more considerations to be covered around issues of recruitment, replicability, validity, setups, data cleaning, preliminary analysis, and particular&#160;circumstances (e.g., adding a variable in the experimental design) in academic emotions research that relies on multi-modal approaches.

An experimental design was developed to investigate the real-time influences of an examination experience to assess the emotional realities students experience in higher education settings and tasks. This design is the result of a cross-disciplinary (e.g., educational psychology, biology, physiology, engineering) and multi-modal (e.g., salivary markers, surveys, electrodermal sensor) approach.

ほぼリアルタイムの本格的な試験体験を研究するための学際的かつ多モーダル実験設計

Over the past ten years, research into students&#39; emotions in educational environments has increased. Although researchers have called for more studies ...

Providing Meaningful Environmental Enrichment and Measuring Saliva Cortisol in Pigs Housed on Slatted Flooring

As pork is the most consumed meat worldwide, the welfare of animals in the swine industry has increasingly become a major public concern, which imposes a substantial pressure coming from customers, legislators and other stakeholders, to make management changes to improve the well-being of these animals. Several studies have demonstrated that providing environmental enrichment to pigs allows them to express their natural behavior, such as rooting and exploring, as well as nesting prior to farrowing, and is associated with reduced stress and improved production and welfare. However, many considerations should be taken into account when providing environmental enrichment, such as the type of floor, drainage and sewage systems, the pigs&#39; stage in life, the material, as well as its hanging method, height and location within the pen. The objectives of this paper are (1) to give methodologic information on how to provide a relatively simple and practical meaningful environmental enrichment for pigs which are housed on slatted floors during the different stages of their life, and (2) to demonstrate how to collect saliva samples for the measurement of cortisol concentrations, as a biomarker for acute stress. Protocols include information regarding the use of jute, cotton ropes, straw in racks, as well as chewable silicone sticks devices as environmental enrichment in pens of farrowing and lactation, weaners and finishers. In addition, the use of cotton rope for a non-invasive saliva samples collection for cortisol concentrations analysis is detailed. The protocols provided are relevant for professionals aiming to improve and monitor animal welfare, in both research and industrial swine farming.

This protocol demonstrates how to provide practical meaningful environmental enrichment for pigs which are housed on slatted flooring during the different stages of their lives, and how to collect saliva samples in a non-invasive manner for the measurement of cortisol concentrations, as a biomarker for acute stress.

スラットフローリングに収容された豚の有意義な環境濃縮と測定唾液コルチゾールの測定

As pork is the most consumed meat worldwide, the welfare of animals in the swine industry has increasingly become a major public concern, which imposes a ...

Thermal Imaging to Study Stress Non-invasively in Unrestrained Birds

Stress, a central concept in biology, describes a suite of emergency responses to challenges. Among other responses, stress leads to a change in blood flow that results in a net influx of blood to key organs and an increase in core temperature. This stress-induced hyperthermia is used to assess stress. However, measuring core temperature is invasive. As blood flow is redirected to the core, the periphery of the body can cool. This paper describes a protocol where peripheral body temperature is measured non-invasively in wild blue tits (Cyanistes caeruleus) using infrared thermography. In the field we created a set-up bringing the birds to an ideal position in front of the camera by using a baited box. The camera takes a short thermal video recording of the undisturbed bird before applying a mild stressor (closing the box and therefore capturing the bird), and the bird&#8217;s response to being trapped is recorded. The bare skin of the eye-region is the warmest area in the image. This allows an automated extraction of the maximum eye-region temperature from each image frame, followed by further steps of manual data filtering removing the most common sources of errors (motion blur, blinking). This protocol provides a time series of eye-region temperature with a fine temporal resolution that allows us to study the dynamics of the stress response non-invasively. Further work needs to demonstrate the usefulness of the method to assess stress, for instance to investigate whether eye-region temperature response is proportional to the strength of the stressor. If this can be confirmed, it will provide a valuable alternative method of stress assessment in animals and will be useful to a wide range of researchers from ecologists, conservation biologists, physiologists to animal welfare researchers.

There is a need for a non-invasive assessment of stress. This paper describes a simple protocol using thermal imaging to detect a significant response in eye-region temperature in wild blue tits to a mild acute stressor.

熱画像は、非侵襲的に拘束されていない鳥でストレスを研究します

Stress, a central concept in biology, describes a suite of emergency responses to challenges. Among other responses, stress leads to a change in blood ...

神経科学

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

コンシャスげっ歯類における腎機能の経皮評価

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

医学

A Novel Method: Super-selective Adrenal Venous Sampling

Primary aldosteronism (PA) and subclinical Cushing&#39;s syndrome (SCS) are conditions in which the adrenal glands autonomously produce excessive amounts of aldosterone and cortisol, respectively. The conventional adrenal venous sampling (cAVS) method collects blood samples from both adrenal central veins and is useful for identifying the laterality of excess hormone production in a unilateral lesion(s), as documented in PA cases. In cAVS, plasma cortisol concentrations (PCCs) are used to normalize plasma aldosterone concentrations (PACs). A novel &#34;super-selective&#34; adrenal venous sampling (ssAVS) method was developed using a micro-catheter, which collects blood samples from adrenal tributary veins (TVs). PACs in ssAVS samples do not require PCC normalization because samples contain a limited amount of systemic venous blood, if any. The ssAVS method enabled segmental lesion(s) to be detected in both adrenal glands, which may be treated by bilateral adrenalectomy, thereby sparing lesion-free segment(s). Right and left adrenals typically have three TVs each, i.e., the superior, lateral, and inferior TVs in the right adrenal as well as the superior-median, superior-lateral, and lateral TVs in the left adrenal. In the ssAVS method, specific parent catheters and a technique to handle them are required, and have been described herein. Furthermore, ssAVS results from three cases of PA are presented: bilateral aldosterone-producing adenoma (APA) (Case #1), left APA and right possible cortisol-producing adenoma causing SCS (Case #2), and idiopathic hyperaldosteronism in which bilateral adrenal segments produced excessive amounts of aldosterone (Case #3). The ssAVS method is not difficult for expert angiographers, and, thus, is recommended worldwide to treat PA cases for which cAVS does not represent a viable surgical treatment option.

&#39;Super-selective&#39; adrenal venous sampling (ssAVS, also called segmental adrenal venous sampling: sAVS)&#160;was performed using a micro-catheter to identify adrenal segment(s) that produce excessive amounts of hormones. The ssAVS technique was described, cases in which adrenal segmental lesion(s) were identified by ssAVS were presented, and the usefulness of ssAVS in future adrenal research was discussed.

手法: 超選択的副腎静脈サンプリング

Primary aldosteronism (PA) and subclinical Cushing&#39;s syndrome (SCS) are conditions in which the adrenal glands autonomously produce excessive amounts ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

ゼブラフィッシュ幼虫ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたグルココルチコイドシグナル伝達のための化学スクリーニング法

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

生物学

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

要約

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全身麻酔を使用してプロシージャのマウスにおける体系的な評価

コアラでのコルチゾール測定(ファスコラルコトス・シネレウス)毛皮

ほぼリアルタイムの本格的な試験体験を研究するための学際的かつ多モーダル実験設計

スラットフローリングに収容された豚の有意義な環境濃縮と測定唾液コルチゾールの測定

熱画像は、非侵襲的に拘束されていない鳥でストレスを研究します

コンシャスげっ歯類における腎機能の経皮評価

手法: 超選択的副腎静脈サンプリング

ゼブラフィッシュ幼虫ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたグルココルチコイドシグナル伝達のための化学スクリーニング法

ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイドホルモン産生機能の試金

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

要約

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全身麻酔を使用してプロシージャのマウスにおける体系的な評価

コアラでのコルチゾール測定(ファスコラルコトス・シネレウス)毛皮

ほぼリアルタイムの本格的な試験体験を研究するための学際的かつ多モーダル実験設計

スラットフローリングに収容された豚の有意義な環境濃縮と測定唾液コルチゾールの測定

熱画像は、非侵襲的に拘束されていない鳥でストレスを研究します

コンシャスげっ歯類における腎機能の経皮評価

手法: 超選択的副腎静脈サンプリング

ゼブラフィッシュ幼虫ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたグルココルチコイドシグナル伝達のための化学スクリーニング法

ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイドホルモン産生機能の試金