NIHの助成金のP30のCA051008とT32 CA009686（ATR）でサポートされています。

スフェロイドの1世代<ol><li> PBSを用いて70％のコンフルエンス〜の接着性癌細胞培養物を分離することによって、ドロップ培養を掛けるために、単一細胞懸濁液を調製し、0.05％トリプシン-EDTA溶液への暴露に続いて洗浄します。 <ol><li>細胞培養培地でトリプシン溶液を中和し、細胞懸濁液のアリコートを用いて細胞を数えます。注記：特定の細胞培養培地は、試験される細胞株に依存します。細胞培養培地は、典型的には、DMEM + 10％FBSであり、ATCCメディアの推奨事項に従ってください。詳細については、資料の表に記載されています。 </li><li>細胞培養培地20μlのドロップあたり500〜1,000細胞の播種を可能にするために希釈を実行します。 </li></ol></li><li> 10cmディッシュを取得し、底に滅菌5mlのPBSを追加。注：このステップでは、吊り蒸発から落下保護します。細胞が続きないので「細菌グレード」皿を、細胞培養等級皿の代わりに使用することができる低コスト培養面として作用します。 </li><li>蓋の内面に希釈した細胞懸濁液の20μlの液滴を転送するためにマルチチャンネルピペットを使用します。 <ol><li>ピペット40は、10cmの皿の蓋の上に（8滴の5行）をドロップします。 </li></ol></li><li>培養皿の上に蓋と場所を反転。スフェロイドを生成するために、72時間、37℃で懸滴培養物をインキュベートします。 <ol><li>自信を持って、まだ制御された方法で蓋を反転します。注意：蓋が速すぎたり遅すぎ反転させると、液滴がシフトする可能性があります。他のものはコンパクト凝集体を生成するために72時間以上を必要とするかもしれないいくつかの細胞株は、48時間以下でスフェロイドを形成することができます。 </li></ol></li></ol> 3Dマトリックスへのスフェロイドの2埋め込み<ol><li>一晩スフェロイドを埋め込む前に、4°Cで成長因子低減基底膜材料のアリコートを解凍します。 <ol><li>オプション：組織cultuの潜在的な回転楕円体との相互作用を防止するために、事前にECMとのレイヤウェル表面再。 <ol><li> 24ウェルプレートにウェル当たりECMのピペットで200μlの。 </li><li> ECMは全体ウェル表面を覆っていることを確認するために、プレートを傾けます。 </li><li>慎重にピペットで余分なECMを削除します。 </li><li> 3時間、室温または4℃で一晩：井戸が乾燥するまで、プレートをインキュベートします。 </li></ol></li></ol></li><li>組織培養皿の蓋を傾け、メディアをプールすることによりスフェロイドを収集します。 1.5mlの微小管にスフェロイドとメディアを転送します。 </li><li>スフェロイドのための10分は、マイクロチューブの底に沈降することを許可します。スフェロイドを目で見えるようにする必要があります。 </li><li>私は独立した予備冷却管に型コラーゲン冷たい100μlの（4℃）と基底膜材料の100μLを混合します。途中で固化からゲルのいずれかを防ぐために4℃で混合物を保管してください 。 <ol><li>小さなボリュームを転送する場合はあらかじめ冷却ピペットチップを使用してください。 </li><li>するときには注意を与えますIは、気泡の形成を防止するために、基底膜の材料や型コラーゲンを混合します。注：彼らはゲル中に埋め込 ​​まれたとなった場合に気泡が 、後のプロトコルでの撮像を妨げることがあります。 </li></ol></li><li>マイクロチューブの40μlの底部分からのスフェロイドを吸引し、そして私は、混合物をコラーゲン基底膜材料/タイプと組み合わせます。混合する際に気泡形成を防止するように注意してください。注：100μlの基底膜の素材を含む溶液、100μlのコラーゲンI型、およびスフェロイド40μlのは、4つの独立した3次元培養のための十分な材料を作成します。これは、拡大または縮小することができます。 </li><li>ピペットで24ウェルプレート上のウェルの中心に粘性混合物の40μlの滴。ウェルの側に実行してから、混合物を防ぐために、プレートのレベルを保持します。注：24ウェルプレート上の単一の列 - 4ウェルが - 各条件がテストされることをお勧めします。 </li><li>プレートINTを置きますOA 37℃のインキュベーターで30分間乱されていないままにしておきます。 3D培養はこの期間中に重合します。 </li><li>ゆっくりと細胞培養培地1ml中に三次元培養を沈めます。 <ol><li>さらにゲル重合を促進するためにウェルにそれを追加するときにメディアが暖かいであることを確認してください。 </li><li>重要なステップ： 静か 3D培養にメディアを追加 。ウェルに早すぎるメディアをピペットは、組織培養表面から3D培養の離脱につながることができます。 </li></ol></li></ol> 3.スフェロイドの侵入を監視し、分析<ol><li>研究者が決定した時点での周囲の3次元マトリックスにスフェロイドからの画像侵攻。 20倍対物レンズを倒立顕微鏡を用いて写真を取得します。注：理想の時点は、試験される細胞株によって異なります。より侵襲的な細胞株はすぐにメッキ後のスフェロイドからの出力を開始し、そのため、最初の写真がかかりますメッキ後の数時間内の。一般的に、写真は（メッキ後）0時間、24時間、および48時間で採取されます。侵攻は通常、播種後24〜48時間を終了します。 </li><li>画像J.のような画像解析ソフトを使用して侵襲的な能力を定量<ol><li>回転楕円体の端からセル距離として侵略を分析します。 <ol><li>半径および/または最大侵襲距離をマークするためにストレートドローツールを使用します。 </li><li>トップメニューの「分析」をクリックして、[長さ測定値を表示するには、「測定」をクリックします。 </li></ol></li><li>回転楕円体の外側全体の侵襲領域として侵略を分析します。 <ol><li>回転楕円体および/または総侵襲的領域の境界をトレースするフリーハンド描画ツールを使用します。 </li><li>トップメニューの「分析」をクリックして、[面積計測を表示するには、「測定」をクリックします。 </li></ol></li><li>画像のスタックのための測定を作成するために、ROIマネージャーツールなどのプラグインを使用してください。 </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. 51, (2011).</li><li>Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. 88, (2014).</li><li>Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+matrix+metalloproteinase-9+(MMP-9)+via+a+converging+plasmin/stromelysin-1+cascade+enhances+tumor+cell+invasion.">Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion.</a> J Bio Chem. 274 (19), .</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+integrin+&#945;6&#946;1+in+metastatic+breast+carcinoma+cells+assessed+by+expression+of+a+dominant-negative+receptor.">Function of the integrin &#945;6&#946;1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor.</a> Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), (2010).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), (2006).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Brenner, W., Gro&#223;, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Th&#252;roff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).</li><li>Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+promotes+motility+in+human+breast+cancer+cells+regardless+of+their+E-cadherin+expression.">N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression.</a> J Cell Biol. 147 (3), .</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), (2013).</li><li>Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+I+but+not+Matrigel+matrices+provide+an+MMP-dependent+barrier+to+ovarian+cancer+cell+penetration.">Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration.</a> BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+ductal+elongation+and+myoepithelial+migration+are+regulated+by+the+composition+of+the+extracellular+matrix.">Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix.</a> J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).</li><li>Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+circulating+metastatic+cells+produced+in+orthotopic+but+not+ectopic+prostate+cancer+models.">Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models.</a> Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

この研究では、スフェロイド浸潤アッセイ（ 表1）の癌細胞株のパネルの性能を評価しました。一般的に、我々はスフェロイド形成が細胞間結合の存在は、回転楕円体のような構造の形成を促進する複数の上皮に見える細胞株に増強されることを見つけます。 MDA-MB-231細胞のような上皮間葉移行を経験した既知の細胞系は、それらの減少E-、N-およびP-カドヘリン発現16に最も可能性の高いハンギングドロップ培養でのスフェロイドを形成しません。 スフェロイド浸潤アッセイのステップのいくつかは、プロトコルへの密着性を必要とします。これは、基底膜とコラーゲンの混合物をピペットとき迅速に作業することが絶対的に重要であり、それは1つが、それが室温で固化し始めるであろうとして働いている間4℃に近い混合物を保持することが重要です。また、可溶性コラーゲンの調製物は、酸性であり、ADDITによりゲルに誘導されます水酸化ナトリウムおよび塩の少量のイオンを、37℃に加温しました。基底膜成分がコラーゲンを中和することが可能であるため、私たちの手では、単純に基底膜材料でコラーゲンの等容量を混合することは、ゲル有能な温暖化の際にレンダリングされます。小さい基底膜の比場合：コラーゲンが計画され、コラーゲンが重合を容易にするために、基底膜の混合物を添加する前に中和する必要があります。一旦形成されると、ほとんどのスフェロイドは、解離に耐性があり、3D培養を含むことになるこの粘性混合物中に再懸濁後も存続します。これらのイメージングを妨げることができるように再懸濁工程の間に、1つはまた、気泡の形成を制限するように注意を発揮しなければなりません。ゲルが固化した後、ウェルに培地を追加する場合、それはゆっく​​りと1ピペットがディッシュから剥離するから3Dの文化を防ぐことが重要です。 周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の出口はgenerallですYは、E0771およびU-87 MG細胞は、ここで検討した細胞株（ 図2）のパネルに最も浸潤を示した株の浸潤能と相関。興味深いことに、これらの2行はまた、侵略の異なるモードを示します。 E0771細胞が緩やかと一括して侵入するのに対し、U-87 MG細胞は、スフェロイドから個人や迅速な出口を表示します。スフェロイド浸潤アッセイは、このように1が基板に侵入するラインで使用される異なるモードを比較することができます。 浸潤を分析する別の方法が図3に示されており、分析の好ましい方法は、侵入の様式に依存してもよいです。かかわらず、分析に使用の種類の、このアッセイは、スフェロイドの多数のうち侵略の迅速な定量を可能にするために設計されました。その後、3次元培養混合物中にスフェロイドをプールし、4つの独立した複製の文化を作成するには、この混合物を分取は、establiにつながります所与の実験条件について監視することができる複数のスフェロイドのshment（ 図1）。アッセイ」は、n個」による大規模な潜在的に、したがって、統計の比較が容易に修正可能であり、同じタイプのスフェロイドが共有する表現型は、最小の変動性を示すように思われます。 BT-474とMCFDCIS細胞のようにそれほど積極的な細胞株は、より積極的なラインよりもはるかに小さいサイズを持っている滑らかな、コンパクトな球体を形成することに注意してください。結果として、ハンギングドロップに初期細胞播種の間、出発細胞数はそれに応じて調整する必要があります。 いくつかの転移性細胞株は、我々の予想に対して実行し、このアッセイでは、侵襲性の挙動を示さありませんでした。顕著な例は、A-431およびCOLO 357 PL細胞が含まれます。これらの線で表示された浸潤の欠如はスフェロイドの中に埋め込まれたECM基材の種類に起因する可能性があります。確かに、他の人がその基底膜のメイトを示していますリアル（ 例えばマトリゲル）とコラーゲンは、移行のための18の異なるマトリックスメタロプロテアーゼ要件におそらくセル 17の侵入に異種の効果を持つことができます。したがって、コラーゲンの比微調整：基底膜材料は、それによって、コラーゲンの量の増加を可能にする、全混合物の1/3に基底膜材料成分を低減、さらにによって浸潤を高めることができ、アッセイの結果を変更する別の方法でありますいくつかの細胞タイプ。このアイデアは、コラーゲン線維形成は、コラーゲン19を中和しpHを4℃のプレインキュベーション期間を延長することによって促進された私は存在原線維コラーゲン乳腺オルガノイドの浸潤能とタイプの数との間に正の相関関係を発見した最近の研究に例示されています。 いくつかの細胞株は、予想に反して作用するという発見は、このアッセイの制限の一部を示しています。 O外に癌細胞の浸潤を監視するが、コラーゲンおよび基底膜材料から成る3D混合物中にFAスフェロイドは、より生理学的に関連する2次元運動アッセイよりも、それはまだそうでない場合は、生体内で見つかったいくつかの生物学的な複雑さを省略したモデルシステムです。例えば、転移能はこのように、間質様々な要因が深く転移プロセスに影響を与えることができることを認識することが重要であり、同所対異所性腫瘍増殖をサポートする20の異なる微小環境によって変調することができます。これらの要素の数は、ここに提示浸潤アッセイには存在しないと観察された不整合のいくつかを説明できます。 要約すると、ここで紹介する癌細胞スフェロイド浸潤アッセイは、生物学的に関連する設定で侵入を監視するための柔軟なフレームワークを提供し、細胞浸潤のメカニズムの発見をサポートしており、潜在的に新規の抗転移治療法の開発に役立つことができます。

これは、癌細胞の運動性がこのような行為は、基底膜および循環系1への参入を通じて侵入を促進することを考えると、転移の可能性を予測することが確立されています。運動に関するほとんどの研究は、それが広く、三次元（3D）マトリクスの細胞の動きがする実際にどのようにこれらの同じ細胞のより代表的であることが認識されてきているものの、細胞が、二次元（2D）の設定でどのように動作するかに焦点を当てています生体 2 で動作します。 3D培養システムは、ますます増殖動態および薬物感受性3に、細胞形態の範囲での細胞挙動を研究するために使用されます。 3D環境のコンテキスト内での癌細胞の浸潤をモニターするための欲求は、3Dの外に、これらのスフェロイドを埋め込 ​​む続いハンギングドロップ培養法4を介して3D細胞凝集体（スフェロイド）の生成を含む、以前に確立された技術の合成につながっています行列（ECM）コラーゲンと基底膜材料5で構成される。この方法は、簡単な実験、種々の条件下で浸潤を比較するために利用することができる効率的なアプローチを提供することにより、これらの以前に確立された技術を改良することを目的とします。 in vitroで細胞の運動性を評価するためのより多くの伝統的な方法は、スクラッチ巻きアッセイおよびトランスウェルアッセイ6です。前者の分析は、2D設定で細胞の運動性を示し、したがって、in vivoでの侵略、 例えばプロテアーゼ活性 7のための重要な機能の様々な独立しています。トランスウェルアッセイは、より良いウェルインサートは、ECM基質でコーティングされたが、単一のパラメータのみ、反対側の膜表面上の細胞の出現、すなわちされたモデル細胞の浸潤を測定したり、細胞浸潤の多くのニュアンスは、このように容易に観察されません。これらの技術とは対照的に、癌細胞スフェロイド浸潤アッセイ（ 図1 &lt;/ strong&gt;の）だけで、生理学的に関連しない設定に細胞浸潤のリアルタイム監視が可能になり、だけでなく、個々の対集団細胞遊走8として可視化されるべき重要な細胞株固有の機能を、許可します。この方法はまた、標準的な三次元培養増殖アッセイを超える利点を提供します。細胞は、この制約が解除された後に侵入する奨励されるように、ハンギングドロップ法を介した細胞凝集体の生成は、最初に、細胞運動を抑制します。その制約が解除された後さらに、細胞放出はその後便利に定量することができる一定の方向に進むことになります。 癌細胞スフェロイドのアッセイのために使用される最も人気のあるECM材料は、マトリゲルとこれらの各コンポーネントは、転移挙動に影響を与える上で重要と異なる役割を持っているI型コラーゲン、あります。マトリゲルは、エンゲルホルム、スウォームマウス肉腫細胞によって産生されるタンパク質の分泌混合物であり、かつbasemeに富みますラミニン、エンタクチン、およびIV型コラーゲンなどの9ヌクレオチド膜タンパク質。この理由のために、マトリゲルを今後とも呼ばれる「基底膜材料。」これらの基底膜材料を細胞の挙動11への影響の範囲を発揮する多くの他のタンパク質に加えて、癌細胞の浸潤10中インテグリン接着のために必要不可欠なリガンドを提供します。比較では、一般的に腱および他の高密度のコラーゲン構造物12の酸消化物から調製されたI型コラーゲンは、身体の組織および器官を支持する結合組織と間質の主要な構造要素として機能する非常に単純なマトリックス材料です。それは、コラーゲンの物理的特性は、細胞運動性の機能の数を調節することができることが実証されています。例えば、腫瘍間質界面におけるコラーゲン線維の整列は、基質13内に侵入したときに、その後、それらの線維に沿って移動するように癌細胞を許可します。ここで紹介するアッセイでは、両方のI型コラーゲンと基底膜の材料は、3Dがん細胞間質の相互作用を研究するためのツールと​​して利用されています。 細胞は三次元マトリックス中に埋め込まれた後の侵入を制御する経路の阻害または刺激の効果をモニターすることができます。細胞は、長い治療が侵入を調節するために必要とされるかどうかに応じて、ハンギングドロップまたは3D培養に移す際に、成長中に前処理することができます。短い治療のためには、薬物が収集後のスフェロイド懸濁物、ならびに細胞への適切な薬物暴露を容易にするために、3次元培養を取り囲む培地と混合することをお勧めします。次に、正常または腫瘍関連間質細胞は、腫瘍細胞浸潤の調節におけるそれらの役割を評価するために、またはどのように傍分泌および自己分泌シグナル伝達に影響を与える細胞の挙動を決定するために、マトリックス材料と混合することができます。このアイデアは、COLの共培養の研究で示されました懸滴中の癌細胞および内皮細胞上でスフェロイド14内の血管網につながりました。癌細胞の浸潤は、異なる基板15の影響を受けるように、最終的に、ECMの成分はまた、変更することができます。以下に示す方法は、このように様々な条件下での癌細胞の浸潤を評価するための枠組みを提供します。一般に、すべての細胞株は、ハンギングドロップでスフェロイドを作成し、上皮に見える細胞株は、典型的には、定期的な球を形成しないことが見出されました。

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC-treated Plates</td><td>NEST Biotechnlology</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

スフェロイド浸潤アッセイを用いた （図1）、癌細胞株のパネルは、同様に基底膜材料およびI型コラーゲンから成る3次元マトリクス状に移植後展示電池出口の量についてのスフェロイドを形成するそれらの能力について試験しました（ 表1）。これらの結果は、全ての癌細胞株は、 インビトロでの上皮形態を有する細胞株は、通常、滑らかな凝集物を生成する傾向があった整形スフェロイドを、作成されていないことを示しています。アッセイに侵入する異なる細胞株の能力はまた、可変でした。 4T1、E0771、およびU-87 MGのような侵襲的なものとして確立された細胞株は、アッセイにおいて、回転楕円体出口の高度を示しました。予想されたようにあまり積極的な細胞株は、MCF-7のように、BT474、およびMCF10DICS.comは、侵入しませんでした。予期しない、しかし、A-431およびCOLO 357 PL細胞によって表示される浸潤の欠如でした。これらのいくつかのためのデータの例ラインは（ 図2）が示されています。 4T1およびE0771細胞では、侵入は既に3Dマトリックス中にスフェロイドを埋め込んだ後、24時間を顕著であったと、U-​​87 MGのために、侵略はマトリックスへの移植の直後に開始しました。 細胞浸潤の定性的評価は、さらに、画像解析ソフトウェアで定量化することにより支持することができます。浸潤の程度を定量化するための2つの異なる戦略が（ 図3）含まれており、選択された戦略が目撃侵略のタイプに依存しています。 ImageJのでは、侵襲的な距離や侵襲的な領域は、第1の比較値は、ピクセルの測定として生成された後にソフトウェアのドローツールを使って、区分されます。顕微鏡画像は、そうする場合、ROIマネージャーツールなどのプラグインは、効率的な測定を容易にするために推奨され、より効率的なデータ収集を可能にするために、スタックとしてインポートすることができますが。 <table><tbody><tr><td>細胞株</td><td>癌型</td><tD&gt;種</td><td>スフィア形成能</td><td>アッセイ侵攻</td></tr><tr><td> 4T1 </td><td>乳腺</td><td>マウス</td><td> +++ </td><td> ++ </td></tr><tr><td> -431 </td><td>類表皮の</td><td>人間</td><td> +++ </td><td> - </td></tr><tr><td> BT-474 </td><td>乳</td><td>人間</td><td> ++ </td><td> - </td></tr><tr><td> COLO 357 PL </td><td>膵臓</td><td>人間</td><td> ++ </td><td> - </td></tr><tr><td> E0771 </td><td>乳腺</td><td>マウス</td><td> +++ </td><td> +++ </td></tr><tr><td> LNCaP細胞</td><td>前立腺</td><td>人間</td><td> + </td><td> - </td></tr><tr><td> MCF-7 </td><td>乳</td><td>人間</td><td> +++ </td><td> - </td></tr><tr><td> MCF10DCIS.com </td><td>乳</td><td>人間</td><td> ++ </td><td> - </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td>乳</td><td>人間</td><td> - </td><td> ？ </td></tr><tr><td> PANC-1 </td><td>膵臓</td><td>人間</td><td> + </td><td> ++ </td></tr><tr><td> PC-3 </td><td>前立腺</td><td>人間</td><td> - </td><td> ？ </td></tr><tr><td> SK-BR-3 </td><td>乳</td><td>人間</td><td> - </td><td> ？ </td></tr><tr><td> U-87 MG </td><td>グリア芽腫</td><td>人間</td><td> +++ </td><td> +++ </td></tr></tbody></table> 表1：種々の細胞系によって球形成および浸潤試験した細胞株は、その球形成能および浸潤に応じて採点されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53409/53409fig1.jpg" /> 図1：スフェロイド浸潤アッセイのビジュアルワークフロースフェロイドは、72時間のための組織培養皿の蓋からハングメディアの滴で生成されます。次に、滴をプールして、スフェロイドはTRANSFです<html>基底膜材料およびI型コラーゲンの4℃の混合物に誤りを犯しました。回転楕円体の再懸濁の後、粘性混合物は、それが三次元培養に固化し、37℃で30分間が与えられた後、24ウェルプレートのウェルにピペットで移します。温かい培地をウェルに添加します。スフェロイドからの細胞出口はその後、経時的にモニターされます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53409/53409fig2.jpg" /> 図2：A-431およびMCF-7細胞にはないのに対し、 分析データの例 4T1、E0771、およびU-87 MG細胞は、スフェロイドからの侵略を示しています。 4T1およびE0771細胞による最大の侵入が後に行われている間、U-87細胞の浸潤はほとんど、24時間後に顕著です。最も侵襲E0771およびU-87 MG細胞株については、細胞は、他の退出低侵襲株で観察されたスフェロイドのサイズの増加を相殺するように見えます。スケールバー、200μmです。OM /ファイル/ ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53409/53409fig3.jpg" /> 図3：浸潤の定量浸潤は 、例えばイメージJソフトウェアを使用して、画像解析によって定量することができます。 （a）は回転楕円体から放出される最長の侵襲性の距離の関数として浸潤の計算。 （b）は回転楕円体を残して細胞に侵略総面積。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53409/53409fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting at JoVE.com

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

a-cancer-cell-spheroid-assay-to-assess-invasion-in-a-3d-setting

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

32.5K ビュー.  Georgetown University. This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored. 

ビデオ: A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

医学

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

がん研究

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

がん生物学における3Dモデル:ヘテロスフェロイドの浸潤ダイナミクス

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

著者スポットライト:頭頸部がんの進行過程におけるがんと免疫細胞との間のクロストークの解読

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

<meta charset="utf8"></head><body>3Dコラーゲンマトリックスセットアップにおけるマクロファージ-腫瘍スフェロイド相互作用の検討

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

要約

さらに動画を探す

この動画の章

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ