Name: in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling
Uploaded: 2015-11-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
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著者は、AHA（WTに13GRNT16990019）とNHLBI（WTにHL097246とHL119371）などの資金源を承認したいと思います。

1.シラン化スライドの生体分子機能化やポリカーボネートメンブレン注：このプロトコル内化学物質やソリューションの多くは、高い蒸発速度（エタノール（エタノール）、アセトンなど ）を持っています。他のステップは、低蒸発速度のための長いインキュベーション時間を必要とします。パラフィンフィルムは、容器を密閉することをお勧めします。注意：（含む：硫酸、アセトン、（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン、グルタルアルデヒド、エタノール）の化学物質の多くは、危険な、または揮発性と見なされます。使用前に適切な保管、取り扱い、および処分のための各材料の材料安全データシート（MSDS）を参照してください。 <ol><li>フルイマージョンを確保し、向きに関係なくきれいな、ガラススライド染色ディッシュ中に1ミリメートルによって50ミリメートルによって75ミリメートルを測定する新しいスライドガラスを配置します。ステップ1.1から1.12のコンテナを使用してください。 注：すべての後続のSTEために、50 mmの75 mmのサイズにカット0.4ミクロン孔サイズとの共培養のために、ポリカーボネートを含む（PC）膜PC官能とEC播種用のPS。 </li><li>硫酸（20％）、O / Nでスライドを浸します。 注意：使用前に硫酸のMSDSを参照してください。 </li><li> DIを毎回変更し、5分間、脱イオン水（DI）で3回浸漬することにより洗浄スライド。 </li><li> 30分間アセトン中でスライドを浸し。 注意：使用前にアセトンのMSDSを参照してください。 </li><li> 6％（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン/アセトン溶液、O / Nでスライドを浸します。 注意：使用前に（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン及びアセトンのMSDSを参照してください。 </li><li>アセトンを毎回変え、5分、3回、アセトンでスライドを浸します。 注意：使用前にアセトンのMSDSを参照してください。 </li><li> 、5分、3回のDIに浸漬するたびに、DIを変更することによって、スライドを洗浄します。 </li><li> 60分間1.5％グルタルアルデヒド/ DI溶液中でスライドを浸し。 注意：使用前にグルタルアルデヒドのMSDSを参照してください。 </li><li> 、5分、2回のDIに浸漬するたびに、DIを変更することによって、スライドを洗浄します。 </li><li>場所スライド無菌層流フード内で30分間、70％エタノール（EtOH）中に、S。 </li><li>エタノールを削除し、残った残留物が蒸発することができます。スライドを再水和するために、無菌DIとドレインでスライドを浸し。 注：スライドまたはPC膜をガラススライドホルダー中に密封し、一週間まで4℃で保存することができます。細胞培養に使用すると、繰り返しは1.10と1.11を繰り返します。 </li><li>スライドホルダーからスライドを削除し、層流フードでは100平方mmペトリ皿によって100ミリメートルにそれを置きます。 注：このコンテナには、残りのすべてのステップのために使用されます。 <ol><li>単一栽培実験のための内皮細胞播種のためのスライドまたはPCを準備します。 <ol><li>コー​​ト官能スライドやPC片側に1ミリリットルフィブロネクチン溶液（25μgの/ ml）で（ステップ1.11）、細胞培養室にさらされるおおよその領域をカバー。 </li><li> 1〜2時間、37℃に設定した滅菌インキュベーター内でスライドやPCをインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、GLAを使用して、残りの溶液を吸引真空に接続されたSSの吸引ピペット。 注：スライドは現在、将来の使用のために4℃でO / Nを格納することができます。 </li></ol></li><li>唯一のEC / SMC共培養を調製するための1.12.2の手順に従ってください。準備し、共培養実験のための平滑筋細胞（SMC）の培養を播種。 <ol><li> 50ミリメートル、外径を30mm、0.5mmの厚さ、およびフローチャンバーの真空に合わせ穿孔により50mmの内径75ミリの大きさで、スライド（ステップ1.11）の上にシリコンガスケットを置きます。 </li><li> 10％FBS / DMEM懸濁液中に1ミリリットルSMCを準備します。 7％NaHCO 3および7.4のpHを0.1 M NaOH溶液で2 mg / mlのコラーゲンI型の1 mlの溶液を中和し、そして2×10 6細胞/ mlの最終細胞密度SMCの懸濁液と混合します。 </li><li>ガスケット内SMC溶液を広げ、30分間、37℃、5％CO 2でスライドをインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、ダルベッコ改変で混合25 mlの0.1％ウシ胎児血清（FBS）でスライドをカバー72時間イーグル培地（DMEM）。 </li></ol></li></ol></li><li>スライドガラス/ポリカーボネート膜上で培養内皮細胞（EC）。 <ol><li>スライドガラスまたはポリカーボネート膜のフィブロネクチン表面上に6.0×10 5細胞/ mlの初期濃度と種子10％FBS / DMEM中の1ミリリットルのECを、。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートし、120分間、10％FBS。 </li><li> 37℃でインキュベーター中でさらに10％FBS / DMEMで細胞、および場所を含むカバースライド、5％CO 2、O ​​/ N、70％-80％コンフルエントになるまで。 </li></ol></li></ol>流体の粘度および体積流量の2決意注：回転粘度計は精密機器であり、粘度計のユーザマニュアルは、校正ゼロ、または測定を行う前に相談する必要があります。 <ol><li>実験の対象となる血管系の文献から所望の流体せん断（τ）を決定します。 </li><li> Measur回転式粘度計を使用して電子の1％FBS /（μ）DMEM粘度。 </li><li>ポアズイユの式から必要な体積流量（Q）を決定します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> 、 ここで、τ=流体せん断、μ=粘度、Q =体積チャンバ幅W =流量、及びh =室の高さ）。 </li><li>設定ポンプステップ2.3で導出流量、およびそれ以降のすべてのステップのために使用します。 </li></ol>拍動指数の3決意注：システム内のすべての接続ポートは、適切なサイズのロック・リング・ツー・バーブ、または雌型ルアー・ツー・バーブ接続で接続する必要があります。接続PVCチューブは、その後、バーブ継手に接続することができ、回路を完成。 <ol><li>正しい流れ方向にチャンバー（ 図3）と超音波流量計を減衰して、 図2のように流れ回路を接続します。 注意：超音波流量計は、機器の敏感な部分である、とマニュアルには、使用前に相談する必要があります。 </li><li> （ポンプ）リザーバアウトレットチューブを確保することによって、DI水を用いて流れ回路とリザーバを充填リザーバ容積内に沈められます。流量計を用いた流量波形を視覚化します。 </li><li>流体/空気の体積比を変化させる減衰室に外気開放弁。閉じる異なる流体レベル間隔で大気開放弁と拍動指数（PI =（V マックス - V最小）/ V の平均）を計算流量波形のピーク（V max）を使用することにより、トラフ（V最小）、および（V 平均）を意味します。ノートブックのレコードのPI値。 </li><li>マークは、将来の使用のために傾けフェルト、永続的なインクのペンを使用して、減衰室の流体レベルとPIを生じました。病理文献11から目的のPIレベルを決定します。 </li><li>シリコンチューブFormation-オプション、拍動を制御する、より高度な方法<ol><li>異なる比（例えば、BASにシリコーンエラストマーベースと硬化剤を混合1〜36：10から電子への架橋剤の比率。1）に変化対象と弾性率のために、先に示したように2 </li><li>簡単に所定の塩基対架橋剤の比を有するシリコーンプレポリマー混合物中に鋼製カニューレ（14 G）を浸漬し、繰り返し浸漬硬化プロセスによってシリコンチューブを製造します。 </li><li> 4時間は、硬化プロセスの途中で方向を切り替える、カニューレ上のポリマーコーティングを硬化させるために60℃に設定したオーブン中に、プレポリマー被覆カニューレを配置します。 </li><li>同じシリコーンエラストマー混合物で浸漬法を繰り返し、〜厚さ0.3mmのチューブになり、さらに4時間、背面オーブン内に配置します。 </li><li>ステンレス鋼カニューレから極薄シリコンチューブを外します。 </li><li> 3.3のようにそれぞれのための代わり室を減衰させる回路、およびテストPIを流すチューブを接続します。 </li></ol></li></ol> 4.ポンプの滅菌<ol><li> 1フローチャンバー（ 図2）、PVCチューブ、及びガスケットを浸します0％の過酸化水素（H 2 O 2）。ステップ4の前に滅菌DIで洗います。 </li><li>予備のインキュベーターの棚の上の血液ポンプを配置します。 注：インキュベーターの棚はステンレス鋼であること、および全体の流れ回路の重量を支えることができるはずです。 </li><li> （ポンプ）リザーバアウトレットチューブを確実にすることによって、10％のH 2 O 2と流体回路とリザーバを充填リザーバ容積内に沈められます。上のUV光を層流フード中で20分間回路を介してポンピングすることによってH 2 O 2を循環させます 。 </li><li>すべて吸引チューブからH 2 O 2、およびフロー回路を通ってポンプで滅菌PBSで洗浄しました。 </li></ol> 5.フロー商工会議総会注：フローチャンバは、真空ポートと、入口および出口流れポート（ 図2を参照）、アクリル、特注のプレートから成ります。チャンバアセンブリは、培養スライドの上にフローチャンバーとガスケットを配置することで構成され、プロperly整列、および以下に記載されています。 <ol><li> 37℃の水浴中で1％FBS / DMEMをウォームアップし、フローチャンバーを準備します。 <ol><li> （ステップ1.13から）メディアのうち、ECスライドを取り、セル側を上にして上の場所ガスケット。 </li><li> （オプション）（ステップ1.13から）メディアのうち、PC膜を取り、セル側を上にして上の場所ガスケット。 PC膜の下にシードされたSMC（ステップ1.12.2）との共培養のスライドを置きます。 </li></ol></li><li>ガスケットの穴（ 図2）とフローチャンバーの真空チャネルを合わせます。 </li><li>真空へのメディアの漏れを確実にしない真空ポート（ 図2）に真空管を取り付けます。 </li><li>スプリングクランプ、フローチャンバーの各側に1つ（ 図2および図5）を用いてガラススライド及びクランプフローチャンバアセンブリの下に置きポリカーボネートシート。 </li><li>場所フロー37℃のインキュベーター内のシステムおよび5％CO 2、および低脈動で満たされた容器からポンプでメディアとの回路を埋めます。細胞をプレコンディショニングのために4時間のためにこの流れを維持します。 </li><li>所望の時間のためにマークPIレベル、および文化にダンピング室に流体音量を調整します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、in vitroでの拍動流を再生する方法を記載し、そして疾患の病理に流れ状態の寄与を決定するのに役立つ最初の工程であってもよいです。このプロトコルを使用して、以前の研究では、流れ状態は、血管炎症反応に寄与する発見した。さらに1、10、このプロトコルは、経験豊富な研究室のために意図されています。このように、いずれも深流体力学において、また生化学分析は、本明細書に記載されています。 。より高度な流体力学のために、1と高度な技術は、文献を参照してください長期間にわたって流体剪断下で細胞を培養することで2重要である：1）貯水池を除く、密閉された流回路を維持し、2）実験を通して汚染を防止します。流れ回路のシールは、所望のフローパラメータに影響を与える意図しない空気を導入して、メディアボリュームと正しいPIレベルを維持するために不可欠です。システムかもしれPにおける追加空気artially、ストリーム内の流れを妨げ、流路を妨害し、システム全体のコンプライアンスを高めます。体積流量が維持される一方で、局部的な速度で増加し、表面の不連続性につながるこの部分閉塞の断面積を減少させました。流速の変化及び表面不連続性の両方が不安定化の流れに寄与し、そしておそらく乱流になります。最後に、加圧流システムに閉じ込められた空気は、それによってその所望のレベルからPIを減少させること、流れの圧縮可能な減衰として作用するであろう。流れ回路は、一定の体積であるように、閉じ込められた空気はまた、経時的な代謝産物の濃度を増加させる、衝撃細胞に悪影響を与えることができる媒体の漏れの原因となります。血液ポンプシールおよび機能は、したがって、インキュベーター内でポンプの配置は、シール合併症を導入することが、温度に依存しています。ポンプシールまたはmalfuncフロースルー回路やメディアの損失内の空気の両方の存在が増加ションは、セル環境の変動性を高め、不正確な結果につながる可能性があります。実験中の汚染の防止は、すべての細胞培養において重要です。流れ回路のシールは、再び同様の汚染物質の侵入を防止するために、強調されなければなりません。フローメディアは、したがって、使用後すぐに回路の洗浄が必要である、微生物の増殖に必要な栄養素および糖の多くを提供します。さらに、不透明なポンプカバーは、全体的なポンプの殺菌における紫外線の有効性を低減します。これは、エタノールとアクリルピストンの非互換性と相まって、過酸化水素（H 2 O 2）を使用して回路の完全な滅菌を必要とします。システムが使用されていない汚染物質の成長の防止、溶液を滅菌し、滅菌環境では、すべての汚染を許可または細胞培養物を滅菌することにより、いずれかの合併症を導入することができる保持する使用。この技術の制限は、適切にできないことが含まれますLY生理的血流の複雑な流れ波をモデル化します。フローシステムは、近似を提供しますが、生理的な流れの中で見られる複雑な波形のさまざまな側面を制御または変更することはできません。また、往復流にせん断応力を逆にすると、一部の動脈疾患で見られる合併症であり、このフローシステムに複製されないかもしれないことで。さらに、細胞応答の長期的な研究は、主にポンプの性能に、より複雑で困難な可能性があります。下流抵抗を低減するフローシステムとポンピング効率の完全性を維持するために不可欠です。最後に、上記のシステムは、生理学的に血管系をモデル化していない、と動脈ストレッチや基底膜の剛性に起因する機械的なシグナリングを考慮していないガラススライドおよびポリカーボネート膜を、使用しています。以前は、一つの研究は、シリンジポンプ1 2を使用して、拍動流を再生可能な拍動システムを使用しています。 repr表現におけるシステムの有効性高いPIをoducingは、ポンプ速度とシールの制限により影響を受ける可能性があります。チャンバーを減衰させる方法は、ポンプのプログラミングを必要としない、そのアプリケーションでさらに簡単です。フローシステムの将来のアプリケーションは、フローチャンバーとスライドを交換する弾性チューブの取り込みによる動脈ストレッチの結果として、機械的なシグナリングを可能にするであろう。この改善により、ミスマッチのコンプライアンスおよび管腔表面の不連続をさらに研究することができます。

心血管疾患の罹患率は、不健康な血管系に起因する多くは、アメリカで最大です。健康な動脈は、内皮細胞（EC）の単層でコーティングされたソフト腔表面に、弾性組織で構成されています。動脈流は、正の平均流量で振動波の関数としてモデル化することができます。拍動指数（PI）は振動の大きさの商と平均流（。。PI =（最大-最小）/平均値 ）で、1変数血管の弾力性とin vitroでモデル化された2動脈の弾力性は、フローのストレージ上で重要です。収縮期圧の下で拡張する心臓収縮のエネルギー、および血流PIの調節に重要な役割を果たしています。心臓が一貫、拍動、体積流量を維持するので、動脈の拡張は、流速、せん断応力、及びPIを減少させることにより流動性を高め、断面積を増大させます。弾力性に頻繁に、不健康な動脈存在変更またはコンプライアンス、血管リモデリングから補強、瘢痕組織または石灰化3、4が表示されます。加えて、新生内膜過形成（NIH）、5瘤および高血圧6および血管線維症4のような他の血管障害は、血管の直径を収縮することができます。しかし、現在の薬物治療、および血管疾患の治療装置は、多くの場合、多くの場合、血管の形態及び特性の変化によって複雑になる血管疾患における血管壁コンプライアンスまたは血流力学の重要性を無視します。どちらのバルーン血管形成術やステント留置術は、壁の弾力性7の合併症に答えます。したがって、血液の in vitroモデルは、動脈疾患と治療に起因する疾患の病理と治療の将来の有効性を検討する上で重要であるが流れます。本明細書において、我々はpathol血管疾患における細胞応答を決定するように設計生理学的および病理学的血流を複製する方法を記載オギース。流体の流れは、血管系内のすべてのセルに影響を与え、血管の健康に重要な機械的な信号である血管壁、でせん断応力が発生します。流体せん断のための血管内皮上のいくつかの機械式センサは内皮mechanosensing 8のための最近の研究で示さ一次繊毛を含む、同定されています。内皮細胞の活性及び形態は、流れの速度、方向、および脈動の影響を受けます。また、平滑筋細胞（SMC）移動は、間質液9を介して低速の流れのメカノ信号によって影響を受けることができ、また、流れおよびサイトカインを介して流量信号のメカノトランスダクションするためにそれらの応答を介して内皮細胞からのパラクリンシグナリングを通じてことができ10を解放します 。 「用量」の平均せん断、PIの依存性、およびパラクリンシグナル伝達はまた、相互に依存する場合があります。単層培養で変化 &quot;投与&quot;と流体せん断に対する血管細胞応答のこの目的のために、決意またはin vitroでの共培養は、血管リモデリングに機械的な洞察を提供し、病気や治療の予測を向上させることができます。この実験で使用されるフ​​ローシステムは、血液ポンプ、空気タンク、唯一実験中に使用される下流の流量計、下流の細胞培養、パラレルプレートフローチャンバー、およびメディアリザーバを減衰上流の流れから成ります。以下のような血流変数の制御は、流量平均、分当たりのビート、及びPIは、流量制御、パルス周波数、圧力減衰の導入によって達成され得ます。拍動血液ポンプは、体積流量、およびパルス周波数を意味するように直接関連して、制御されたストロークの周波数で、可変ストローク変位を用意しています。流れ回路内の空気タンクの導入は流れ振動の大きさを低減し、圧力減衰を可能にします。減衰チャンバ内の空気が流れ波から過剰な圧力があることをできるように、圧縮可能である一方でメディアは、非圧縮性流体であります空気圧縮により吸収されます。メディア比への空気は多くの減衰がどのように発生するかを制御することができます。幅50mmによって長さが75ミリメートルカスタム細胞培養フローチャンバーは、アクリルから作成されました。流れは、入口ポートを通って入り、入口マニホルドを通じて膨張し、フローチャンバーの全体一貫した流れを提供します。同様の流れと構造は、チャンバ出口に存在します。細胞は、官能化スライドガラス上に播種し、続いてフローチャンバーに取り付けられています。これは、簡単に研究した後に検索された大規模な集団を可能にします。共培養実験は、サイトカイン/フロー輸送を可能にしながら、培養の間、細胞間の接触を排除するために、多孔性ポリカーボネート膜を使用することができます。このシステムは、以前に病的に高いPI疾患に対する細胞応答を調査するため、10、高PIフローおよび内皮単層培養およびEC / SMC共培養1への影響をモデル化するために使用されてきました。これらのフローコンをモデル化するために使用するプロトコルを記述することによりditionsは、我々は、細胞応答への流れ信号の寄与を決定する際に他の人を支援したいと考えています。

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide (70&amp;#160;mm x 50&amp;#160;mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate Membrane</td><td>Millipore Corp.</td><td>HTTP09030</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Gasket</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>RD 475464</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin (25 &amp;mu;g/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>36486</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Damping Chamber</td><td></td><td></td><td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of &lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>Blood Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td><td>US Plastic</td><td>65066, 65063, 65062</td><td>Various sizes may be required</td></tr><tr><td>Luer Connections</td><td>Nordson Medical</td><td>Various</td><td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td></tr><tr><td>Culture Chamber</td><td>Machined in-house</td><td>Custom</td><td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in &lt;strong&gt;Figure 2&lt;/strong&gt; may be used to recreate this chamber.</td></tr><tr><td>Square Petri Dish</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-14007-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide Holder</td><td>Capitol Scientific</td><td>WHE-900303</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Flow Meter</td><td>Sonotec, GmbH</td><td>Sonoflow co.55/060</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td></td></tr><tr><td>14 G Steel Cannula</td><td>General Laboratory Supply</td><td>S8365-1</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

血管疾患は、米国内の死亡の一般的な原因です。ここで、我々は、血管疾患の病理に向けて流動力学の寄与を​​調べるための方法を提示します。壁の補強、瘢痕化、またはすべての流体の流量に影響を与える可能性があり、部分的狭窄、及び拍動流、または拍動指数の大きさにしばしば存在不健康な動脈。様々な流れ条件の複製は、血液ポンプの下流室を減衰流れ圧力を調整する結果です。閉じたフローシステム内の空気の導入は、ポンプからの脈動圧力を吸収する圧縮可能なメディアを可能にし、したがって、拍動指数を変化させます。本明細書に記載される方法は、単純に、高度に制御入力、および容易に測定結果を、再生されます。いくつかの制限は、システムで近似され、複雑な生理的なパルス波形のレクリエーションです。内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞は、血流THRの影響を受けます動脈ウワーッ。血流の動的成分は、心拍出量および動脈壁のコンプライアンスによって決定されます。流動力学の血管細胞メカノトランスダクションは、サイトカイン放出および動脈内の細胞型の間のクロストークをトリガすることができます。血管細胞の共培養は、血管壁との機械的シグナルに対する血管応答における細胞間相互作用を反映して、より正確な画像です。流れの動的平均（または安定した）コンポーネントに対する細胞応答を含む流動力学の寄与は、したがって、疾患の病状および治療有効性を決定する上で重要な測定基準です。 in vitroでの共培養モデルを導入し、圧力がシミュレートされた心拍出量を生成する血液ポンプの下流に減衰を通して、種々の動脈疾患の病状を調査することができます。

流れ条件の維持は、フロー回路（ 図1）の正確な組立に依存しています。チューブの直径がより大きな直径を培養室の前後の流れ抵抗およびその後の圧力低下を低減することで、アセンブリ内の重要な選択です。意図された圧力と流速を確保するために、意図されたチューブを用いた実験の前に流量計を使用してシステムを組み立てます。培養チャンバの真空チャネルのアラインメント（ 図2）は 、シリコンガスケット（図示せず）で穿孔して、フロー回路内で密封保持します。シールを確実にするために、ばねクランプは、ガスケットに追加の圧力を適用するために使用することができます。ガラススライドは、チャンバ領域（ 図6）に合うようにカットし、ポリカーボネートシートで保護されるべきです。流速は、さらに、シールを維持するの合併症に寄与することができるので、メディアは、メディアの粘度を増加させるために、デキストランを添加することによって変えることができます。増加ヴィスコを通して性、流体剪断が低い速度に維持することができます。システムの応答性と整合性は、単に減衰室とリザーバ（ 図3）内の流体レベルと流体の色を観察することによって、実験の途中でチェックすることができます。流体レベルが一定の値を維持する必要があります。初期の流体レベルは検診の比較のためにリザーバとダンピング室の両方にマークする必要があります。調整は、実験開始時に培地を添加することによって作られた、またはダンピング室への空気の進入を可能にすることができる。 図4は、流速の代表記録を示す図です。フェノール赤色の着色は、実験の過程で減少するはずです。実験終了時に、培地を回路から排出させなければならず、将来のメジャーまたは使用のために-80℃の冷凍庫で保存しました。メディアは、代謝産物の含有量または放出されたサイトカインについて分析し、または細胞カルトのためにそれを使用して、細胞応答にパラクリンシグナリングを監視するために使用することができますURE。細胞は、形態および集密度（ 図5）は、位相差顕微鏡下で画像化することができます。形態のようなスピンドルは、24時間（ 図7）を介して、HPF後のECで観察されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53224/53224fig1.jpg" /> 図1のフロー回路の概略図。スキーム内の標識された流量計は、減衰チャンバによって設定拍動指数レベルを測定するために使用されます。流量波形は、システム圧力が生理学的なまま確保することを目的と接続チューブ径で測定する必要があります。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53224/53224fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53224/53224fig2.jpg" /> 図2.フローチャmberデザインと測定。外側チャネルは、真空に接続されています。センター画像は、チャンバのクランプを示しています。右の画像は、ガスケットの設計を示 ​​す。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53224/53224fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53224/53224fig3.jpg" /> チャンバの概略を減衰図3.フローダンピング室。フローは、意図流れ方向との接続を示しています。排気弁は、出口弁が閉じられ、開かれ、流体を所望のPIレベルにチャンバを満たします。室内の出口弁と閉鎖空気開放弁の、流れが再開し、流体レベルの開口部がレベルを維持すると。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53224/53224fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </p&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53224/53224fig4.jpg" /> 図4。様々な拍動指数とサンプル流の波。ハイ拍動流（左）と低拍動フロー（右）。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53224/53224fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53224/53224fig5.jpg" /> 図5。共培養フロー概略図 。共培養は、コラーゲンゲル中の平滑筋細胞と内皮細胞上の拍動流を示しています。細胞からのサイトカインの放出は、多孔質ポリカーボネート膜を介して交差していてもよい。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53224/53224fig5large.jpg" target="_blank">してください</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53224/53224fig6.jpg" /> 図6。フローの状況との内皮細胞形態の変化。官能基化ポリカーボネート膜上でコンフルエント内皮細胞培養。示すフローの前（左）とフロー（右）の後です。フローは、静的（無速度）、安定した（等速）、高パルス（高拍動）、異なる条件の下に表示されます。細胞を、2％クリスタルバイオレットで染色されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53224/53224fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53224/53224fig7.jpg" /> 図7。平滑筋細胞タンパク質発現は、フローの状況に応じて変化します。 α平滑筋アクチン（SMA）とミオシン重鎖（SM-MHC）異なる条件下では、静的（無速度）、定常流（等速）、高パルスの平滑筋細胞の表現。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53224/53224fig7large.jpg" target="_blank">大きなを見るにはこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。</a>

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In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

このプロトコルは、疾患の病理における細胞応答を決定するのを助けるために、インビトロで生理学的または病理学的な血流を複製します。血液ポンプの下流ダンピング室の圧力を導入することにより、脈管構造を横切る血流が血管内皮または模倣共培養の単層上で要約し、課すことができます。

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.6K ビュー.  University of Colorado at Boulder. このプロトコルは、疾患の病理における細胞応答を決定するのを助けるために、インビトロで生理学的または病理学的な血流を複製します。血液ポンプの下流ダンピング室の圧力を導入することにより、脈管構造を横切る血流が血管内皮または模倣共培養の単層上で要約し、課すことができます。 

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Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

生物工学

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

発生生物学

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

hiPSC由来内皮細胞の分化と機械的刺激

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

著者スポットライト:流体媒介性機械的刺激下で培養されたhiPSC由来内皮細胞の研究 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

流れの下で標的とする血管薬を研究するためのin Vitro 3D細胞培養動脈モデル

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

要約

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血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

微細と3D微小血管の組立

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

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イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

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イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

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