Name: correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell
Uploaded: 2015-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
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Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

全ての動物のケアと実験は、デューク大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。 Cocem3Dは、以前に公開されたプロトコル10,11の組み合わせから茎とPyyGFPレポーターマウス12を使用して、特定の腸内分泌細胞を研究するために、ここで適用しました。この方法は、商業的に容易に入手可能なトランスジェニックレポーターマウスを用いて、関心のある他のセルに適用することができます。相関、共焦点顕微鏡、シリアルブロック面を走査型電子顕微鏡（SBEM）、及び3Dのレンダリングデータ：この方法は、3つのセクションに記載されています。 相関共焦点顕微鏡このセクションの目的は、相関、共焦点とSBEMイメージングを可能にする寸法の遠位結腸からの組織セグメントを収穫することです。次のようにプロトコルは次のとおりです。 1.収穫組織<ol><li>準備しますPBS中の50μg/ mlのヘパリン溶液10ml。 </li><li>ケタミンの10ミリリットル（100 mg / mlの）とキシラジンの1ミリリットル（20 mg / mlの）を混合することにより、キシラジン/ケタミン麻酔在庫を準備します。 <ol><li> 0.1MのPBSで4：1をキシラジン/ケタミンの株式を希釈します。 </li></ol></li><li> PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび0.1％グルタルアルデヒドを含む固定剤溶液100mlを準備します。 </li><li>キシラジン/ケタミン麻酔薬の致死量で6〜10週齢PyyGFPマウスを、麻酔。マウス体重の20グラム当たり0.15ミリリットルで腹腔内麻酔薬を注入します。 </li><li>尾や足の指をつまんで、適切なマウスの麻酔を確認し、乾燥を防ぐために、目に軟膏を使用しています。 </li><li>心臓内固定剤10を灌流する可変流量蠕動ポンプを使用してください。外科用ハサミ（12センチの長さ）を使用する腸、心臓、および肺を露出させるために腹腔を開き切りました。狭パターン湾曲鉗子（13センチ長）との心を持ち、蠕動ポンプから翼状針（19 G）を挿入し、I左心室NTO。すぐに、春ストレートはさみ（長さ4ミリメートル）と右心房をカット。 1分間のヘパリン溶液で最初に2ml /分の速度で灌流し、その後15分間氷冷固定液溶液でマウスの尾が完全に剛性になるまで。 注：これは、腸粘膜に小血管の破裂を防ぐために遅い速度で灌流するために非常に重要です。血管の破裂は、組織の超微細構造を損なうことになります。灌流が適切である場合、肝臓は3〜5分以内に色が淡い有効にしてください。 </li><li>小さなハサミを使用して腹腔を開き、遠位直腸に盲腸との接合部から結腸全体を切除。氷冷PBSで組織を配置します。 PBSに沈めながら、小さな春のはさみで腸間膜に沿ってコロンを切り開い。 </li></ol> 2.組織セグメントを解剖し、固定<ol><li>メスを使用して、遠位結腸から約6小さな組織セグメント（2 平方ミリメートル） で切断しました。シートO上でこれを行いますF歯科用ワックス及びPBSの数滴中に沈め。 </li><li> 4℃で3時間固定液中で組織セグメントをポスト修正。 </li></ol> 3.マイクロ解剖組織ブロック<ol><li> PBS中の5％低融点アガロースを調製し、45℃の水浴中に保ちます。 </li><li>標準サイズのティッシュテックCryomoldように、小さなプラスチック容器を使用して、5％の低融点アガロースで組織セグメントを埋め込みます。 </li><li>振動刃ミクロトームに包埋切片をマウントし、氷冷PBSでバッファトレイを埋めます。 </li><li> 0.8振幅と0.04ミリメートル/秒の速度で300μmの組織片をカットします。注：この時点で、組織片をアガロースから除去されます。 </li><li>アガロースで300μmの組織片を再埋め込み、ビブラトームのブレードに垂直にミクロトームにマウント。 </li><li>ビブラトームを用いて、50μmの厚さで組織片を切断します。注：最終的な組織ブロックは、約300μm幅×50μ​​mの厚さでなければなりません。これらのDimensionsは、腸内分泌細胞の厚さは15〜20ミクロンとneuropodの長さ30〜70 nmの間であることが示されたパイロット共焦点実験から最適化されています。電池の向きが組織ブロックの表面に平行である場合にはそのため、セル全体は、厚さ50μm、幅300μmの組織のブロック内に含まれる可能性があります。目的の組織および細胞タイプに応じて、これらの寸法を変え。 </li><li> 4℃でPBS中の組織ブロックを格納します。 </li></ol> 4.共焦点イメージング<ol><li> 4,000：1でPBSにDAPIを希釈することにより核染色溶液を調製します。 </li><li> 5分間、DAPI核染色で組織ブロックをインキュベートします。注：DAPI染色は、共焦点とSBEM画像を相関させるために有用であるそれらの核によって区別個々の細胞を容易にします。 </li><li>帯電したスライドガラス上にマウント組織ブロックは、PBSを数滴を追加し、カバースリップでそれらをカバーしています。 </li><li>共焦点顕微鏡を使用して、ブロックを識別する興味のある無傷の絨毛およびPyyGFP細胞とSとzスタックに光学切片を得るためにそれらを画像化しました。 <ol><li> 1μmの光学切片のzスタックを取得するために20X / 0.8ツァイスプランアポクロマート対物レンズを使用してください。 </li><li> zスタックのために細胞の位置を決定するために、対象の細胞、および微分干渉コントラスト（DIC）を局在化するために、他のセルとの関係を決定するために488nmの内在性GFPを405 nmで（DAPI）のためにチャネルを使用しますルーメン。 </li><li> 1024ピクセル以上の画像解像度を使用します。 </li></ol></li></ol>アガロース5.埋め込みブロック<ol><li> PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒドを含む固定液の10ミリリットルを準備します。 </li><li>慎重に組織ブロックにダメージを与えることなく離れてガラススライドからカバースリップをスライドし、カバースリップの端にPBSを添加することにより、ガラススライドから組織ブロックを削除します。そして、1にスライドから組織ブロックを転送するために美術の絵筆を使用4％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒド固定剤を含む0.5ミリリットルのマイクロチューブ。 </li><li> 4℃でのポストフィックス組織ブロックO / N。 </li><li> PBSに組織ブロックを転送します。そして、2枚のスライドガラスの間に、それらを挟んで5％低融点アガロースでフラットブロックを埋め込みます。 注：アガロースの薄層でブロックを埋め込み、染色の際に事後操作が容易になります。 </li><li>広場にアガロースをカットし、上側のハンド側に切り込みを作ります。注：このステップは、後続のステップの配向を維持する必要があります。 </li><li>さらに処理するまで4℃でPBS 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに保管ブロック。 </li></ol>シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBEM） このセクションでは、組織ブロックは、低倍率でSBEMを用いて調製し、画像化されます。ブロック面の調査画像は、目的の細胞を含む領域を識別するために、共焦点データと相関しています。地域一回識別され、組織は7ナノメートル/ピクセルと70nmのスライスの解像度で撮像されます。これが解決し、他の細胞小器官から大高密度コア分泌小胞を区別するのに十分でした。腸内分泌細胞では、小胞のこのタイプは、直径13で100から150nmの間で変化します。次のようにプロトコルは次のとおりです。 6.染色組織切片<ol><li> PBSから組織を除去し、0.1Mカコジル酸緩衝液で3回、各5分、すすぎます。 </li><li>細胞膜14のコントラストを向上させるために0.1 Mカコジル酸緩衝液に溶解した0.1％のタンニン酸で1時間染色ブロック。 </li><li>公開されたプロトコル11に従って、その後の染色および組織の脱水を行います。 Deerinckらに続いて。プロトコルは、これらの溶液を調製する：1）1％（w / v）のthiocarbonhydrazide（THC）。 2）アスパラギン酸溶液をリード。 3）1％酢酸ウラニル、および4）オスミウムtetraoxyde /フェロシアン化カリウム（のOsO 4 / Kフェロシアン化）。 4％のOsO 4と2倍を混ぜますのOsO 4 / Kフェロシアン化を行うために1：1の比率で[10ミリリットルのH 2 OにKフェロシアン化し、0.86グラムのNaカコジル酸を0.3グラム] Kフェロシアン化ストック。注：アガロース中に包埋された組織は染色中の取り扱いを容易にしたが。慎重に、その後の樹脂の浸透のためのアガロースを除去します。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸緩衝液中のサンプル三回、5分毎に、リンスした後、4℃で2時間、OsO4 / Kフェロシアン化溶液を用いて染色。 </li><li> 60℃でそれぞれ、超純水で5分間3回すすぎ、そして30分間TCHと染色。 </li><li> RTで60分間、2％のOsO 4（なしKフェロシアン化）と超純水で3回、それぞれ5分間および汚れを洗い流します。超純水で再び3回、各5分洗浄します。 </li><li> 4℃で1％の酢酸ウラニルO / Nで染色。超純水で3回、各5分洗浄します。 </li><li> 60℃で30分間のリードアスパラギン酸で染色。超純水で3回、各5分洗浄します。 </li><li> solutioですすぐことにより、組織を脱水エタノール濃度の増加に伴って、NS。 50％、75％、85％、95％、絶対100％エタノールで2回、各5分洗浄します。終わりに、プロピレンオキシドを用いて2回、10分毎にセクションをすすぎます。 </li></ol>樹脂7.浸潤と埋め込み組織切片<ol><li>商業avaialbleキットを用いて樹脂とブロックを潜入。エポン包埋キットを用いて樹脂に埋め込む組織。 48％のエポキシ樹脂の混合物を準備し、20％ミリリットルDDSA、30％ミリリットルNMA、および2％DMP30。 5分間激しく樹脂混合物を攪拌した後、気泡が表面に来ることができるように30分間真空中でミックスを置きます。 </li><li> 1のプロピレンオキシドと樹脂を混合：1の比率、激しく振ります。組織から最後の脱水すすぎを外し、プロピレンオキシドとの混合樹脂を追加します。回転子のO / Nでのサンプルと場所バイアルとキャップなしバイアルのままにします。次の日は、作りたてのエポン樹脂を追加し、回転装置で90分間混合します。 </li><li>それらを挟んでできるだけ平坦樹脂中に埋め込みブロック互いに15に付着するのを防止するために、液体離型剤を用いて硬化されたガラススライドの間です。 </li><li>ブロックが平坦に埋め込まれると、60℃でさらに48時間のブロックを治します。 </li><li>ブロックを解放するために離れてスライドを引き出します。 </li></ol> 8.取り付けとイメージングのための組織ブロックをトリミング<ol><li>解剖顕微鏡下で、ブロックをトリミングする前に、目的の細胞を含有する領域を同定する容易にするために、共焦点顕微鏡写真のものと樹脂に包埋組織ブロックの向きと一致しています。 </li><li>手動ダウン〜500×500μmのブロック面に樹脂包埋ブロックをトリミング。 </li><li> 30分間導電性エポキシ、乾燥を含むピンのフラットブロックをマウントします。その後、60℃で、表面上に平らにブロックを置き、乾燥O / N。 </li><li>コー​​ト銀コロイド液でブロック。 COを容易にするために、直角ブロックのスライスを確保するために、組織切片フラットを維持シリアルブロック面と共焦点顕微鏡写真をrrelating。 </li></ol> 9. SBEM <ol><li>画像SBEMシステムを備えた走査型電子顕微鏡を用いてブロック（E .G。、3View）。 </li><li>組織の顔がブロックから出てくるまで〜2μm刻み、切断時に初期厚さのセクションを設定します。 </li><li>ブロック全体の顔のsurver画像を取得。 </li><li>フィジーソフトウェアを使用して、固定および16を染色中にサンプルの反りのための共通分母とアカウントを生成するために、両方のシリアルブロック面と共焦点顕微鏡写真の測定を行います。 </li><li>共焦点画像の座標に分母を乗じてブロック面上の関心領域の位置を確認します。参考として、微絨毛、杯細胞、または固有層の位置のように、他の構造的特徴を使用してください。 </li><li>で、目的の画像領域2.25 kVの高真空モードでは7nm /ピクセル（または15,147X倍率）。スライスの増分を設定してください70nm以下で。 </li><li>生の16ビット.dm3形式でSBEMデータを収集します。 </li></ol>面分割のための10の最適化SBEM画像<ol><li> SBEMイメージは、8ビットの.TIFFに生.dm3形式から変換します。 </li><li>フィジー0.8ガウスぼかしフィルタを用いて画像を.TIFFフィルター。 </li><li>元のサイズの25％に設定されたデータを縮小してセットを処理するのに必要なRAMメモリの量を最小限にするために.TIFFスタックとして保存します。 </li><li>変換モードフィジーのプラグイン「SIFTと線形スタックアライメント」を使用してSBEM画像のスタックの位置を合わせ、「作物3D」プラグインを使用して切り取ら。注：トリミングをさらにセグメント化し、ボリュームレンダリングに必要なRAMメモリの量を低減するのに役立ちます。 </li></ol> 3Dで描画データ 11.共焦点顕微鏡<ol><li> 「面」ツールのモードを上回る自動を使用して、Zスタックを再構築する。 図1D、RECを示しています絶対強度として0.126ミクロンで表面エリアの詳細、上の滑らかなオプションを使用して、各チャネルのonstruction、およびしきい値。 </li></ol> 12.シリアルブロック面SEM 注：手動データセグメント化は非常に時間の手順を消費し、数週間かかることが手順を描画する機能に応じてです。 Bohórquez らに提示ビデオや数値のための分割。2014年8を手動で行われ、労働力の約500時間を要しました。これは、セグメント化プロセスを開始する前にレンダリングを必要とする基本的な機能に優先順位を付けることをお勧めします。手順は次のとおりです。 <ol><li>手動セグメントに50ミリ秒の描画モードで描画モードと「輪郭」オプションで「面」ツールを使用し、ボリュームが目的の細胞をレンダリング。 </li><li>スムーズなレンダリングまたはより高速なレンダリングのために、すべての5つのスライスにセルのすべてのスライス上の輪郭をトレースします。 </li><li>エクスポート最終イム300dpiの以上の解像度で「スナップショット」ツールを使用して年齢。 </li></ol>

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博士サティシュMedicettyはの従業員であり、Renovoの神経社から100％の給与を受けます。しかし、これは、データを共有すると、材料にJoveの方針の著者の遵守を変更しません。興味のある競合は、残りの著者のために宣言されていません。

<html>胃腸chemosensationは、生物医学研究にエキサイティングな新しい分野として浮上しています。これは、腸内分泌細胞18内の機能味覚受容体の発見に大きな部分です。その後の研究は、腸内分泌細胞は、炭水化物、脂質、およびアミノ酸5,6,19,20などの栄養素のための特異的受容体を発現することを示しました。これらの発見のための触媒因子は、腸内分泌細胞は、蛍光20をラベル付けされたレポーターマウスの開発、となっています。我々は、遠位小腸および結腸17,21の腸内分泌細胞を研究するために、これらのマウスの1、PyyGFPマウスを開発しました。彼らは満腹22,23の誘導因子であり、どちらもPYYおよびグルカゴン様ペプチド1を分泌するので、これらの細胞は、関心対象です。このとき、これらの細胞の完全な超構造のアカウントは、我々は彼らのシグナル伝達機構を理解することが不可欠だと信じていたこれ、行方不明になりました。 ontentは &quot;&gt;ここでは、SBEMと共焦点顕微鏡を埋めるための視覚的方法を説明した。方法は、私たちは、腸内分泌細胞の完全な超微細構造を文書化することができCocem3D、と呼ばれている。我々は、これらの細胞が三含まneuropodを持っていることを報告しています細胞を腸これらneuropodsが物理的にニューロンに接続しても分泌小胞8のすべての四半期。neuropod内では、ニューロフィラメントと神経軸索のようなはるかにあり、neuropodsが腸内グリア細胞8に育まれています。さらに重要なこと、それは腸を支配し、コロン9。 cocem3Dの強みの一つは、そのシンプルさです。共焦点によって結像さSBEMが組織内の特定の細胞の同定を容易にすることができるブロックに組織サンプルを減らします。分泌小胞および他の細胞小器官は、7ナノメートル/ピクセルの解像度で容易に識別することができます。 SBEMのセクションが破棄されているので、さらにプロセスへ特定のタンパク質を同定するために、組織の歌うこの時点ではオプションではありません。しかしながら、そのような組織ブロックからの切片が保存されているアトゥム24、などの方法の開発は、細胞中の特定のタンパク質の同定を可能にする可能性があります。腸内分泌細胞は、脳内の腸と満腹の食糧間の感覚のインターフェイスであるため、腸内分泌細胞に化学感覚受容体の特定の位置を決定することは、肥満のための薬物療法の開発のための重要な情報です。

細胞内の生命は時間と空間で起こります。経時変化は、しばしば、超解像顕微鏡のような蛍光イメージング技術と組み合わせタイムラプス顕微鏡を用いて研究されています。スペースは、特に、細胞内小器官または細胞間相互作用の配置は、唯一のセルの微細構造を完全に考慮することによって導出することができます。細胞の微細構造の包括的なアカウントはC.のような、ゲノムが利用可能である場合には、ゲノム機能に明確さをもたらすことができます線虫1またはフラット板形動物門のtricoplaxのアドヘレン2 エレガンス 。連続切片の電子顕微鏡検査は、現在、効率的な再現性、時間、シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡3（SBEM）のような自動化された3次元電子顕微鏡技術の開発に安価なタスクのおかげです。 機能を解明するための構造情報の必要性は、特定のセル画では非常に明白ですこのようなニューロン、グリア、または感覚上皮細胞としての機能は、物理的な細胞間相互作用に依存するL型、。我々は、腸の内腔での栄養素からの感覚信号は、最終的欲求行動を調節する電気信号に導入されているかの解明に特に興味を持っています。回路は複雑であるが、栄養素が腸内分泌細胞と呼ばれる感覚上皮細胞に接触し、腸の壁に始まります。このような味覚細胞のような他の感覚上皮細胞とは異なり、腸内分泌細胞は、1千4-7つの割合で腸上皮全体に分散されています。したがって、それらは、特定し研究することが困難であった、そして長時間彼らは消化管ホルモンの供給源として観察しました。しかし、細胞特異的蛍光レポーターマウスの開発に、これらの細胞の複雑な感覚機能が浮上しています。これらのレポーターマウスの一つは、ペプチドYY-GFP（PyyGFP）マウスを使用して、我々はそのenteroendocrを発見しましたINE細胞は、我々はneuropodという名前の顕著な細胞質尾部を持っています。 neuropodsの出現は、細胞間コミュニケーションに保存された機能を示唆しました。したがって、我々は、腸内分泌細胞の超微細構造を文書化することにより、neuropodsの関数を導出することができると推論しました。 特定するのは困難である分散セルに付属物の構造を理解する必要性は、共焦点顕微鏡とSBEMを結合する方法を開発するための主な根拠でした。関心の細胞は、PyyGFP腸内分泌細胞特異的レポーターマウスを用いて同定しました。この方法は、私たちは腸内分泌細胞とそのneuropod全体の超微細構造を文書化することができました。 neuropodsの中で、我々は、腸溶性グリア8への物理的な関係を発見し、神経細胞の軸索の構造的特徴を発見し、外neuropods。実際、neuropodsは、これらの細胞の分泌機能において必須の役割を示唆しているすべての分泌小胞の約70％を含みます。上の建物構造データは、より最近では、これらのneuropodsを通じて、腸内分泌細胞と神経細胞が腸舌8,9で味細胞と同様の神経上皮の回路を形成し、神経支配することがわかりました。 構造データから生じ胃腸化学感覚のメカニズムのような特徴を暴くことは、この相関顕微鏡法を使用して収集しました。我々は、細胞は、非常に低い割合で組織内に分散している場合は特に、この方法は、細胞生物学の他の分野に有用であり得ると考えています。我々は、3次元（Cocem3D）における相関、共焦点およびシリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡などの方法に言及しました。組織切開、共焦点顕微鏡、SBEMイメージング、SBEMと共焦点画像相関、および手動のセグメンテーション：メソッドは、以下の主要なステップから構成されています。相関が物理的ではなく、化学物質であるため、他の相関の方法と比較して、概念はかなり単純です。

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting agarose</td><td>Life technologies</td><td>16520-100</td><td>5%, freshly made in PBS</td></tr><tr><td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62534-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp; nuclear stain</td><td>Life technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Postively charged glass slides and coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine art paintbrush #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate buffer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11650</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>EMbed 812 kit&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Liquid releasing agent&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70880</td><td></td></tr><tr><td>Liquid silver colloidal&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>CircuitWorks conductive epoxy&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ITW Chemtronics</td><td>CW2400</td><td></td></tr><tr><td>Variable flow peristaltic pump</td><td>VWR</td><td>70730-064</td><td></td></tr><tr><td>VT1200S Vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 780i confocal microscope</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3view system</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td><td></td><td>http://www.renovoneural.com</td><td>Renovo provides 3d EM services</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>Open access software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer station with 16 GB of RAM or more</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data visualization software Imaris 7.5&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

細胞の超微細構造の描写は、その機能を理解するために重要です。これは、腸上皮の腸内分泌細胞などの多様な細胞型からなる組織に拡散希少細胞タイプのために困難なプロジェクトであることができます。千：彼らは1の割合で他の上皮細胞に分散しているため、食品や細菌のこれらの胃腸のセンサは、勉強することが困難でした。近年、トランスジェニックレポーターマウスは、蛍光によって腸内分泌細胞を同定するために生成されています。それらの一つは、ペプチドYY-GFPマウスです。このマウスを用いて、共焦点およびシリアルブロック面の走査型電子顕微鏡を相関させる方法を開発しました。私たちはこの方法cocem3Dという名前で、組織内の特定の腸内分泌細胞を識別し、3Dで細胞の超微細構造を明らかにするためにそれを適用しました。 cocem3Dの分解能は、分泌小胞と小さい小器官を同定するために、ボリューム再ために細胞膜を区別するのに十分ですndering。 Cocem3Dは容易に天然の組織内の他の特定の細胞型の3次元超微細構造を研究するために適合させることができます。

ここで紹介する方法は、上皮の層内の特定の細胞の超微細構造を研究するために使用しました。この場合、目的の細胞は、とらえどころのない腸内分泌細胞です。 その場でそれらの同定は、細胞特異的蛍光レポーターマウスの開発にここ数年で可能でした。 2011年に、我々は、ホルモンPYYのプロモーターは緑色蛍光タンパク質17の発現を駆動するマウスを開発しました。このPyyGFPマウスでは、小腸および結腸の遠位部分の腸内分泌細胞は、容易にUV光下で識別されます。このマウスモデルは、腸内分泌細胞を含む組織ブロックを識別し、SBEMためにそれを処理するための基盤でした。相関法はcocem3Dとしてここに呼ばれ、以前に公開されたプロトコル10,11の上に建てられました。 組織ブロックの寸法を最適化することは、相関のために重要です。予備実験では、それは目的の細胞の全身を覆いながら組織ブロックに300ミクロンが長い×50ミクロンの厚SBEM画像の数を最小限に低減されることが決定した。 図1（a）は、振動羽根microtromeにを使用して切開の見逃しを示しています右の寸法を有する組織ブロックを得ます。少なくとも100ブロックは、関心のある無傷の細胞を有するものを選択するためにそれらを分類する前に取得されます。ブロックは、共焦点顕微鏡と画像のzスタックによって撮像され、選択された光学的にすべての1ミクロン（ 図1BおよびC）を間隔を置いて配置されている。 図1Dは、マウスの回腸における腸内分泌細胞のボリュームレンダリングされた図を示しています。その顕著なneuropodは〜60ミクロンのために上皮細胞の下に延びています。 目的の細胞は、ブロック全体の顔のSBEMイメージと共焦点のzスタックを相関させることによって発見されました。例はPyyGFPの遠位結腸からブロックからここに提示されていますマウス。共焦点のzスタック（ 図2A）を得た後、ブロックは、低融点アガロース（ 図2B）の薄層に埋め込 ​​まれています。これは、ブロックの後続の操作のために必要です。これはSBEMスライスの光スライスに合わせて可能な限り平坦なブロックの向きを維持することが重要です。 図2Cに、代表画像は、組織ブロックの全面で示されています。この図の一部は、以前にBohorquez らに出版された。2014年8。これは、その後、アカウントの組織のランドマークと寸法を考慮することにより、共焦点画像と相関していた。 図2Dは ​​、明らかに、ブロックの共焦点とSBEM画像の重ね合わせを示しています興味のある私たちの細胞の正確な位置。 セルが識別されると、SBEMイメージングは​​分泌小胞および他の細胞小器官を同定するのに十分に高い解像度で行われます。彼提示されたデータセットブロックの画像は、すべての70nmで採取したとして再画素当たり7 nmで画像化しました。データセットは、組織の深さ45ミクロンに及ぶ643の画像を含んでいました。数ミクロンは、低倍率での全体ブロック面の最初の撮影中に剃毛されています。生SBEMデータセットは.dm3形式で取得し、以降の処理のために.TIFFに転換しました。 SBEMスタックは、関心のある領域のみを含むようにフィジーのソフトウェアプラグイン「作物（3D）」ブロックを使用して、トリミングされました。これは、ボリュームレンダリングに必要なRAMメモリの量を減少させます。セルは、その位置と、分泌小胞によって識別され、IMARISソフトウェアを使用してセグメント化された。 図3は、腸内分泌細胞の3Dでレンダリングが含まれています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> 図1：相関、共焦点顕微鏡の一部を分析するための（A）のワークフロー。300×厚さ50μmの組織ブロックに腸組織。 （B）右の寸法の代表組織ブロック。マウス小腸からこれらのディメンションの組織ブロックは、コロン約8陰窩の場合には、約3絨毛をまたがっているか、ということに注意してください。 （C）目的の細胞を含む小腸で絨毛。 （D）IMARISソフトウェアを使用して3次元でレンダリング共焦点zスタックは、腸上皮の下に実行されている顕著なneuropodで腸内分泌細胞を示します。青= DAPI核染色。バー=10μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> 図2：SELEの連続ブロック面の走査型電子顕微鏡検査（A）共焦点画像興味のPyyGFPの腸内分泌細胞（緑）を含む大腸から組織ブロックをCTED。ブロックは、共焦点顕微鏡によって画像化されると、（B）は、その後、スライドガラスを使用して低融点アガロースで平坦に埋め込 ​​まれます。アガロースで組織ブロックを埋め込むことは、その後の操作を容易にし、左の角のノッチが正しい方向にSBEM内のブロックをマウントすることができます。 （C）ブロックの顔のSBEM画像。 （D）利息（白矢印）の細胞を識別するためのSBEMと共焦点データの相関。この図のCとDの画像は、。Bohorquezらから変更2014年8されています。ブルーはDAPI核染色を=。バー=10μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> 図3：IMARISソフトウェアを使用して腸内分泌細胞のデータは、3Dでレンダリング（A）ボリュームレンダリング。細胞は、分泌小胞を充填したneuropodが含まれています。腸内分泌細胞の超微細構造の完全な説明については、Bohórquez ら 、2014年8を参照してください。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K ビュー.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

生物工学

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

発生生物学

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

神経科学

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

生物学

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

免疫・感染学

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

共焦点顕微鏡を明らかに細胞表面受容体画像相関分光法による凝集

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201 
2 Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland 21201
Confocal fluorescence microscopy is an imaging technique that enables increased optical resolution as compared to conventional &#34;wide-field&#34; epifluorescence microscopy. Confocal microscopes are able to achieve improved x-y optical resolution through &#34;laser scanning&#34;- typically a set of voltage-controlled mirrors (galvanometer or &#34;galvo&#34; mirrors) that direct laser-illumination to each pixel of the specimen at a time. More importantly, confocal microscopes achieve superior z-axial resolution by using a pinhole to remove out of focus light originating from locations that are not in the z-plane being scanned, thus enabling the detector to collect data from a specified z-plane. Because of the high z-resolution achievable in confocal microscopy, it is possible to collect images from a series of z-planes (also-called z-stack) and construct a 3D image through software.
Before discussing the mechanism of a confocal microscope, it is important to consider how a sample interacts with light. Light is composed of photons, packets of electromagnetic energy. A photon impinging on a biological sample can interact with the molecules comprising the sample in one of four ways: 1) the photon does not interact and passes through the sample; 2) the photon is reflected/scattered; 3) the photon is absorbed by a molecule and the absorbed energy is released as heat through processes collectively known as nonradiative decay; and 4) the photon is absorbed and the energy is then rapidly reemitted as a secondary photon through the process known as fluorescence. A molecule whose structure permits fluorescence emission is called a fluorophore. Most biological samples contain negligible endogenous fluorophores; therefore exogenous fluorophores must be used to highlight features of interest in the sample. During fluorescence microscopy, the sample is illuminated with light of the appropriate wavelength for absorption by the fluorophore. Upon absorbing a photon, a fluorophore is said to be &#34;excited&#34; and the process of absorption is referred to as &#34;excitation&#34;. When a fluorophore gives up energy in the form of a photon, the process is known as &#34;emission&#34;, and the emitted photon is called fluorescence.
The light beam used to excite a fluorophore is focused by the objective lens of a microscope and converges at a &#34;focal point&#34; where it is maximally focused. Beyond the focal point the light again diverges. The entering and exiting beams may be visualized as a pair of cones touching at the focal point (see Figure 1, left panel). The phenomenon of diffraction imposes a limit on how tightly a beam of light can be focused - the beam actually focuses to a spot of finite size. Two factors determine the size of the focal spot: 1) the wavelength of the light, and 2) the light-gathering ability of the objective lens, which is characterized by its numerical aperture (NA). The focal &#34;spot&#34; extends not only in the x-y plane, but also in the z direction, and is in reality a focal volume. The dimensions of this focal volume define the maximum resolution achievable by optical imaging. Although the number of photons is greatest within the focal volume, the conical light paths above and below the focus also contain a lower density of photons. Any fluorophore in the light path can thus be excited. In conventional (wide-field) epifluorescence microscopy, emission from fluorophores above and below the focal plane contribute out-of-focus fluorescence (a &#34;hazy background&#34;), which reduces image resolution and contrast, as demonstrated in Figure 1, with the red cube representing fluorophore emission above the focal plane (red star) that results in out-of-focus fluorescence (top right). This problem is ameliorated in confocal microscopy, due to the utilization of a pinhole. (Figure 2, bottom right). As depicted in Figure 3, the pinhole allows emissions originating from the focal place to reach the detector (left), while blocking the out-of-focus fluorescence (right) from reaching the detector, thus improving both resolution and contrast.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg" /> 
Figure 1. Optical resolution of epifluorescence versus confocal microscopy. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The light beam used to excite a fluorophore is focused by the objective lens of a microscope and converges at a focal volume and then diverges (left). The red star represents the focal plane of a sample that is being imaged while the red square represents fluorophore emission above the focal plane. When capturing an image of this sample using an epifluorescent microscope, the emission from the out-of-focus red square will visible and contribute to a &#34;hazy background&#34; (top right). Confocal microscopes have a pinhole which prevents the detection of light emitted outside of the focal plane, eliminating the &#34;hazy background&#34; (bottom right).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg" /> 
Figure 2. Pinhole effect in confocal microscopy. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Although the highest intensity of the excitation light is at the focal point of the lens (left, red oval), other parts of the sample not in the focal point (right, red star) will get light and fluoresce. To prevent light emitted from these out-of-focus regions to reach the detector, a screen with a pinhole is present in front of the detector. Only the in-focus light (left) emitting from the focal plane is able to travel through the pinhole and reach the detector. The out-of-focus light (right) is blocked with the pinhole and fails to reach the detector.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg" /> 
Figure 3. Principal components of a confocal laser scanning microscope. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
For the sake of simplicity, the mechanistic description of a confocal microscope will be limited to that of the Nikon Eclipse Ti A1R. Although there may be minor technical differences between different confocal microscopes, the A1R serves well as a good model for describing confocal microscope function. The excitation light beam, produced by an array of diode lasers, is reflected by the primary dichroic mirror into the objective, which focuses the light onto the specimen being imaged. The primary dichroic mirror selectively reflects the excitation light while allowing light at other wavelengths to pass through. The light then encounters the scanning mirrors that sweep the light beam across the specimen in an x-y manner, illuminating a single (x,y) pixel at a time. Fluorescence emitted by fluorophores at the illuminated pixel is collected by the objective lens and passes through the primary dichroic mirror to reach an array of photomultiplier tubes (PMTs). Secondary dichroic mirrors direct the emission light to the appropriate PMT. Excitation light scattered by the sample back into the objective is reflected by the primary dichroic mirror back towards the specimen, and thus prevented from entering the detection light path and reaching the PMTs (see Figure 3). This allows the relatively feeble fluorescence to be quantified without contamination by light scattered from the excitation light beam, which is typically orders of magnitude more intense than the fluorescence. Because the pinhole blocks light from outside of the focal volume, the light arriving at the detector comes from a narrow, selected z-plane. Therefore, images can be collected from a series of adjacent z-planes; this series of images is often referred to as a &#39;z-stack&#39;. By using the appropriate software, a z-stack can be processed to generate a 3D image of the specimen. A particular advantage of confocal microscopy is the ability to distinguish the subcellular localization of staining. For example, the differentiation between membrane staining from intracellular staining, which is very challenging with conventional epifluorescence microscopy (1, 2, 3).
Sample preparation is an important facet of confocal imaging. A strength of optical microscopy techniques is the flexibility to image live or fixed cells. When attempting to produce 3D images, because of the number of images that must be acquired for a z-stack, the difficulty of maintaining cell health, and the movement of live cells and their organelles, the use of fixed cells is typical. The procedure for fixing and staining cells for confocal fluorescence is similar to that conventionally used in immunofluorescence. After culture in chamber slides or on coverslips, cells are fixed using paraformaldehyde to preserve cellular morphology. Non-specific antibody binding is blocked using bovine serum albumin, milk, or normal serum. In order to maintain the specificity of the secondary antibodies, the solution used should not originate from the same species in which the primary antibodies were generated. The cells are incubated with primary antibodies that bind the antigen of interest. When labeling several cellular targets, the primary antibodies must each be derived from a different species. Antibodies tagging an antigen are then bound by fluorophore-conjugated secondary antibodies. Fluorophore-conjugated secondary antibodies should be selected so that they are compatible with the wavelengths of laser excitation available in the confocal microscope. When visualizing multiple antigens, the excitation/emission spectra of the fluorophores should differ enough so that their signals can be discriminated by microscopic analysis. The stained specimen is then mounted on a slide for imaging. A mounting medium is used to prevent photobleaching and specimen dehydration. If desired, a mounting medium containing a nuclear counterstain (e.g. DAPI or Hoechst) can be used (4).
In the following protocol, mouse fibroblasts transfected to express CD1d (LCD1) were stained with antibodies recognizing CD1d and CD107a (LAMP-1). CD1d is a major histocompatibility complex 1 (MHC 1)-like receptor present on the surface of antigen presenting cells that presents lipid antigens. LAMP-1 (lysosomal associated membrane protein-1) is a transmembrane protein primarily present in lysosomal membranes. For proper antigen presentation, CD1d is trafficked through the low pH lysosomal compartment, so LAMP-1 is being used as a marker of the lysosomal compartment for this protocol. By probing the LCD1 cells with anti-CD1d and anti- LAMP-1 that were produced in different species, secondary antibodies with unique fluorophores can be used to determine the localization of each protein in the cell and whether CD1d is present in the LAMP-1 positive lysosomal compartments.

Confocal Fluorescence Microscopy and Localization of Proteins

共焦点蛍光顕微鏡:マウス線維芽細胞におけるタンパク質の局在を決定する技術

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...