Name: visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI at JoVE.com

We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

miniSOG細胞株の1世代<ol><li> 5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の2 mlを含む35 mmディッシュにU2OS（ヒト骨肉腫）細胞を増殖させます雰囲気。 </li><li>彼らはminiSOGとmCherryをのための配列を含むプラスミド構築物をトランスフェクション試薬19の製造業者のプロトコルに従って修復タンパク質をタグ付けされた精製されたトランスフェクションの質（A269 / 280比1.8〜2.0）でリポフェクション80％コンフルエントである場合には細胞をトランスフェクション。 miniSOG発現プラスミドは、ツィン・ラボから注文することができます<a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">。http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li>ソート蛍光活性化細胞によってminiSOGとmCherryをタグで組換えタンパク質を発現する細胞は、2日後にトランスフェクションをソートします。細胞を回収20を過剰発現している細胞を回避するために、中間蛍光強度を持ちます。 </li><li>培養10％FBSおよび選択剤G418（ジェネティシン）0.6 / mlのが補充されるDMEM培地10ml中で10cmのディッシュ上の陽性細胞。 </li><li>目に見えるコロニーがプレート上に出現した後、mCherryを陽性コロニーのための画面が倒立蛍光顕微鏡を使用して、恒久的なマーカーで（プレートの底部に）自分の周りの円を描きます。低倍率の空気対物レンズ（例えば、10倍）を使用して、慎重にコロニーを掻き、ゆっくりと滅菌千μlのピペットチップにそれらを吸引することにより、無菌技術を使用してクローンを選択します。 </li><li>選択したコロニーを展開し、10％のジメチルスルホキシドを補っステップ1.1で説明した成長培地を用いて、それらの一部を下に凍結。無菌の18×18 mm 2のカバースリップ上に成長しており、それらを暴露することによってDRF形成のための細胞をテスト放射線の2 Gyの。安定miniSOG mCherryをを発現して照射された細胞は、mCherryをを画像化するためのフィルタが設定され使用して蛍光顕微鏡で可視化したときに修復タンパク質は、DSBは典型的な焦点パターン特性を示さなければならないタグ​​付け。 </li></ol> 2.細胞培養<ol><li>安定miniSOGとmCherryをを表現する文化U2OS細胞は、ステップ1.1に概説された条件の下で修復タンパク質をタグ付け。 2mlのDMEMを含む35ミリメートル直径のガラスボトムディッシュに80％コンフルエントに細胞を増殖させます。プラスチックや使用されるプラスチックにカバースリップを添付接着剤が使用される樹脂の水溶液とアルコール溶液に耐性と耐性であることを確認してください！ </li><li>実験を行う前に、関心領域を識別するために、蛍光顕微鏡を用いて滅菌ダイヤモンドペンを用いてスクラッチすることにより異所性タンパク質を発現する細胞を含む約1mm 2の小領域の輪郭を描きます。あるいは、ガラス底皿tを使用帽子はカバーガラスに内蔵されたプリエッチングされたグリッドシステムとカバーガラスが含まれています。 注：ESIおよび蛍光顕微鏡写真21を組み合わせ 、高品質な相関顕微鏡を使用している場合は、カバーガラスの厚さは、油浸対物レンズとの互換性があることを確認してください。これは、厚さ1.5号（0.16〜0.18ミリメートル）を持っている必要があります。領域は、エッジ付近で発生する可能性がある樹脂の重合の問題を回避するために、TEMで検査するために皿の中央に近いエリアを選択してください（ポイント4.10から4.13を参照）。 </li></ol> 3. DNA損傷誘導<ol><li> 、ガンマ線を用いて細胞を照射放射線様薬剤を使用するか、（18,22または 23に記載されているように、 例えば ）共焦点顕微鏡にレーザーマイクロ照射による損傷を誘発。 </li><li>この例では、405nmのゾルを用いたセシウム137線源またはレーザmicroirradiateでガンマ線照射の2及び6 Gyを用いて細胞を照射します0.5 / mlのヘキストで20分間細胞を感作した後、共焦点顕微鏡のid固体レーザ。 </li></ol> 4.サンプル調製<ol><li> 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中または暗所で室温で30分間、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.4中の4％パラホルムアルデヒド注意1mlで細胞を固定してください。 注意：パラホルムアルデヒドとカコジル酸ナトリウムは有毒です！手袋を着用し、適切に有害物質を廃棄してください。 </li><li> 4ミリリットルの0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4のリン酸緩衝液pH 7.4で細胞を2回洗浄します。 </li><li> 2ミリリットルの50mMグリシンで固定した細胞を治療、5 mMのアミノトリアゾールと30分間、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液または0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.4）中の10mMシアン化カリウムの注意（pH値をチェック！）未ブロックするために、アルデヒド基とは、バックグラウンドを増加させることができ、ヘム基によって生成された活性酸素種を抑制する。 注意：シアン化カリウムは非常に有毒です！ W耳の手袋は、ボンネットの下で働くと十分に有害物質を廃棄してください。それはpHが検証され、正確であることが重要であるので、反応は、pHに非常に敏感です。 </li><li>相関顕微鏡法が所望される場合、倒立蛍光顕微鏡上で2Dまたは3Dのステップ2.2で選択された領域を記録します。 </li><li> 2ミリリットルのマイクロチューブに10 mgのジアミノベンジジン塩酸塩錠を配置することによって、1 mg / mlのジアミノベンジジン塩酸注意溶液を調製します。蒸留H濃塩酸（11.65 M）の2 Oおよび20μlの980μlを添加し、溶液が淡褐色半透明になるまで混ぜます。 7.0と7.6の間のpHに水酸化ナトリウムでpHを調整しながらの1mg / mlの最終濃度になるように0.1 Mリン酸または0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中にこの溶液を希釈液（pH 7.4を推奨）。 注意：ジアミノベンジジンが有毒です！手袋を着用し、適切に有害物質を廃棄してください。 </li><li>光酸化のために、Replace、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝液中1 mg / mlのジアミノベンジジン塩酸溶液2 mlのバッファー。光からこの溶液を保護し、酸素の溶解度を増加させるために4 O Cに氷上で冷却します。 （溶液中に挿入し、酸素ボンベに接続されたホースを使用）溶液に酸素をバブリングすることによって酸素を含む溶液を飽和。再びのpHを確認し、必要に応じて調整してください。 注：これは、pHが7.0およびpH 7.6の間であることを光酸化反応のために非常に重要です。 </li><li>慎重に40倍油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡上に固定された細胞を用いた料理をマウントして、関心のある領域に移動します。 GFPまたはCFPのためのフィルターキューブを使用して青色光とminiSOGタグエキサイト。 MiniSOGは473 nmの10で肩を448 nmで励起最大値を有します。 </li><li>でも緑miniSOG蛍光ヘクタール後に照明を続行完全に消失し、重合ジアミノベンジジンの茶色の光酸化物は、透過光路に出てくるまでです。酸化生成物は、細胞の大部分に表示されている場合には、光酸化を停止するために、蛍光照明をオフにします。 注：光酸化は、対物レンズ、フィルタ透過波長と効率、および照明源に応じて数分かかることがあります。 </li><li> Postfixの0.1 Mカコジル酸ナトリウムのpH7.4の緩衝液または30分間、リン酸緩衝液pH7.4中の2％グルタルアルデヒドの1 mlの細胞。 </li><li> 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4または0.1でMリン酸緩衝液pH 7.4で20分間0.1％-0.5％の四酸化オスミウムを用いて細胞の膜を修正。 注：これは、膜を安定化するために必要な四酸化オスミウムの可能な限り低い濃度を使用することをお勧めします。重合DAB沈殿物はESI、強いによって直接検出することができ、窒素の高い密度を有するためオスミウム染色はminiSOGタグ化タンパク質を識別し、ESIにとって有害で​​あるかもしれない必要はありません。四酸化オスミウムは毒性が非常に強いです！ヒュームフードで作業し、適切に有害廃棄物を処分します。 </li><li> 30％、50％、70％、90％、98％、100％エタノールステップ（各5分）を​​用いて、エタノールシリーズを通して、細胞を脱水します。その後、1で細胞をインキュベートする：100％エタノールおよびアクリル樹脂（LRホワイト）の1ミックス100に少なくともさらに4時間、細胞をインキュベートする前に、細胞への浸透を容易にするために4時間シェーカー上に皿を置き％アクリル樹脂（LRホワイト）。 </li><li>樹脂を重合させるためには、カミソリの刃とコートアクリル樹脂アクセラレータとの縁で標識した2ミリリットルのマイクロチューブの蓋を遮断。アクセラレータだけ縁をカバーし、チューブ内に流れないことを確認してください。その後、慎重にパスツールピペットを用いて、LRホワイト樹脂で約2/3のチューブを埋めます。樹脂が接触ウィットに入らないように注意してくださいHリムの加速器！ </li><li>皿に細胞を浸透させた樹脂を外し、チューブの幅はほぼ完全に皿のガラス覆われた観察窓をいっぱいにするように直立マイクロチューブの上に逆さに皿を置きます。 </li><li>その後、チューブとカバーガラスを密閉チューブ内の樹脂は、現在のセルを覆うようにチューブを反転させる加速器のために1〜2分待ってください。 </li><li> 60℃のオーブンの中にチューブでシャーレを置き、12時間のためにそれを治します。 </li><li>ブロックが硬化されると、オーブンから添付樹脂充填マイクロチューブでシャーレを削除し、皿からマイクロチューブを分離します。液体窒素と熱水中で凍結融解サイクルによる分離を促進します。 </li><li>ガラスボトムディッシュを捨て、慎重にブロックを除去するために、かみそりの刃でマイクロチューブを切断してオープン。 </li><li>永久的なマーカーでブロックにラベルを付けます。 </li><li>トライにカミソリの刃を使用します以前にダイヤモンドやタングステンペンでマークされた領域が含まれています（または目的の細胞の領域が含まれています）1ミリメートル2地域が、何も残らないようにブロックをm個。 </li><li> 、ウルトラミクロトームでブロックをマウントトリミングナイフでブロックをトリミングし、ダイヤモンドナイフを用いて、約50nmの超薄切片を切りました。 </li><li>高透過300メッシュのグリッド上のセクションをピックアップ。これらのグリッドは非常に小さいグリッドバーを持っているので、興味のある領域での少ないセルをカバー。 </li><li>コー​​ト炭素の約0.2〜0.4ナノメートルとグリッド上のセクションでは、TEMの電子ビームの下でそれらの安定化を助けるためにカーボンコーターを用いて。 </li></ol> 5.電子顕微鏡<ol><li>エネルギーフィルタを装備していたTEMにグリッドをロードします。製造者の指示に従って顕微鏡及びエネルギーフィルタをチューニングした後、低倍率モード（通常伝送）のセクション上の細胞を検査し、比較しますそれら（ステップ4.4で得られた）ときに適切なデータを蛍光します。 </li><li>興味深い機能（DNA損傷トラックまたはDNA修復フォーカス）と核が発見されると、エネルギーフィルタリングモードに切り替えて、厚さマップを記録します。 注：この手順は、ゼロ損失とフィルタ処理されていない画像の記録が含まれています。 0.3までの厚さはフリーパス（入射ビームの電子の30％は、試料によって散乱されます）は、良好な元素マップを生成するのに十分薄いことを意味します。 </li><li>使用顕微鏡のエネルギーフィルタを制御するソフトウェアを使用して、要素のリンと窒素のレコード比マップ。また、20 eVでのスリット幅と、120 eVのエネルギー損失で20 eVのプリエッジ画像のスリット幅を175 eVのエネルギー損失でリン地図ポストエッジ画像を記録します。窒素マップ、また、35 eVでのスリット幅を有する358 eVでの35 eVのプリエッジ画像のスリット幅を有する447 eVのに記録後エッジ画像については。 注：画像形成された要素の内容以来（ホスホオルス及び窒素）が（約1％）、より良い信号対雑音比を有する画像を生成するために、「3ウィンドウ法」上の「比画像」（定性元素マップ）（元素マップを定量化）を選択し、相対的に低いです。 </li></ol> 6.画像処理<ol><li> （例えば、デジタル顕微鏡写真）を取得写真のファイル形式を扱うことができる画像処理ソフトウェアに元素比マップを開きます。マップを重ね合わと揃えた後、RGB画像のグリーンチャンネルに赤チャネルへの窒素マップとリンマップをコピーします。 </li><li>タグ付き画像ファイル形式（TIFF）ファイルとして合成画像をエクスポートします。 層 （例えば、フォトショップ）を使用することができ、画像処理ソフトで画像を開きます。 </li><li> 8ビット・データ・セット（0〜255）に画像内の最小値および最大値を再スケーリングすることにより、各チャネルのダイナミックレンジを調整します。 </li><li>使用した窒素マップ（のリン含有量を差し引きますタンパク質の分布を示す定性マップを生成するために「レイヤー」ウィンドウ）。 </li><li> 「インデックスカラー」に、前のステップで作成した核酸（リン）のマップとタンパク質（窒素）を変換した核酸分布を示すマップのCMYK色空間とシアンルックアップテーブルに黄色のルックアップテーブルを作成します非核地図を表示します。色は、二つの要素間の最大コントラストマップを生成するように選択されます。 </li><li>新しいイメージを作成し、異なる層としてリンとタンパク質の分布を示すマップをインポートします。お互いに重畳された両方の層を表示するには「スクリーン」透明度モードを使用してください。 </li><li>ステップ5.2で取得したゼロ損失画像を開きます。この画像は、従来のTEM像のように見えるだけで、試料に衝突することなく、試料を​​透過した電子を含んで記録された領域の画像を表しています。エクスポートTIFF画像としてこの画像。 </li><li>フォトエディタでエクスポートゼロ損失の画像を開き、元素マップを示す画像の最上層にコピーします。 「スクリーン」透明度モードを使用して画像の位置を合わせます。 </li><li>必要に応じて、閾値セグメントにゼロ損失画像miniSOGに由来する信号。上記のように別の層として得られる画像を追加します。 </li></ol>

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Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESIは、それが具体的にリンが豊富な領域をマッピングすることが可能であるため、核内でクロマチンとリボの異なる状態を調べるための優れたツールとして機能することができます。それは深く、電子顕微鏡によって得ることができる詳細の量を増大し、非特異的な対照的な方法に依存していません。 ESIの1つの欠点は、同じ加速電圧で、従来のTEMより薄いセクションを必要とすることです。これは、連続切片での作業や断層撮影法28を使用することによって克服することができます。 多くの情報は、リンと窒素の分布を見ることによって得ることができるが、それはまた、特定のタンパク質の分布をマッピングできることが重要です。本論文で提示された方法では、ESIは、ジアミノベンジジンの部位特異的重合に基づいている方法と組み合わせることができることを実証しました。この方法は、FUを追加しませんがESIにLLの新色は、それがタンパク質の分布をマッピングすることが明らかに便利です。これは、クロマチンと相互作用するタンパク質に当てはまります。研究は、二つ以上のタンパク質の集団を可視化する必要がある場合は前の光酸化9に、予め埋め込 ​​み染色として適用される場合、免疫を用いた標識方法を引き続き使用することができます。安定な細胞株と比較して、一過性トランスフェクションは、発現レベルは、細胞間で有意に変化するので、それはハードタグ付きタンパク質の同量を発現する複数のセルを検索することを可能にすることができないという欠点を有しています。そのため、安定した細胞株の作成が推奨されます。しかし、蛍光イメージングを用いて、タンパク質発現の相対量を判断し、一過性トランスフェクション後の中間体の式を有する細胞を選択することが可能です。 miniSOG融合タグは、それ自体蛍光性であるが、その量子収率は、GFP（0.37対0.6）10よりも大幅に悪化しています。パープについてmCherryをのような追加の蛍光タンパク質タグを追加相関顕微鏡のOSEは、miniSOG励起で発生する一重項酸素を生じることなく生きた細胞内イメージングを可能にします。 miniSOGタグ付きタンパク質の発現レベルは、DABを含む緩衝液中の酸素量、およびpHがまた、光酸化の速度に影響を与えることができます。時にはそれがあるため、光酸化反応の光依存性の関心領域内に均一な光酸化を達成するの​​は非常に問題となる可能性があります。長時間の光酸化は、非特異的染色およびESIことによって、要素固有の信号の検出を複雑にすることができますサンプルでも多くの重金属の堆積につながることができます。光酸化プロセスは非常に時間がカバーガラスには、いくつかの細胞を含む通常は非常に小さい領域が正常に染色されるようにかかります。 我々はminiSOGの組み合わせが付着HUの単層を使用して、ESIを有するタンパク質をタグ付けが示されています人間の癌細胞株。原則として、この方法は、それが妥当なレベルでminiSOG標識タンパク質及び限り透光及び酸素の拡散を表現することが可能であり、DABは、任意の他のサンプル（酵母、細菌、組織、胚）にも適用することができ適切な光酸化、従っ​​て、均一な染色を可能にするのに十分に高いです。懸濁細胞の場合、それは、ポリ-L-リジン等の接着剤を用いてカバースリップ上の細胞の位置を固定することが有利であろう。厚い試料の場合、低い開口数の目標は、より均質な照明を実現しますが、光酸化するために時間がかかります。 私たちは、シュウらによって公表された元のプロトコルに近いminiSOGタグ融合タンパク質の使用を提示している可能な限り10 - 。四酸化オスミウムの使用を含むが。そこ離れ優先DABポリマー及び膜に付着から、四酸化オスミウムは、いくつかの反応性を示すことが観察できたと試料中の生物学的物質のほとんどの堆積（10 図3）。四酸化オスミウムは、45 eVので元素エッジを有します。この信号は、そのプラズモンは試料を通過する間に、複数のエネルギー損失事象を受ける検体が増加し、単一電子の厚さの電子エネルギー損失スペクトルに重ね合わせることができます。高濃度のOsO 4は、試料調製において使用される場合、これは、リン元素マップの品質を制限することができます。 10以前に使用されたものよりも有意に低い我々がここで使用した濃度は、良質のリンマップの生成を可能にしました。高いのOsO 4の濃度を要求するタンパク質をタグ付けminiSOGを用いた実験では、まだ良いリンマップの作成 ​​を可能にする最良の濃度は、経験的に決定する必要があります。 我々は、DNA修復に焦点を形成DABポリマーがsufficieであることを見出しました四酸化オスミウムで後固定を省略した場合でも、従来のTEMモード（またはより良いコントラストがゼロロスモード）で見ることがntly稠密（ 図8参照）。このように記録された信号のセグメント化は、オスミウムで処理したサンプルを使用してのように堅調に推移しました。可視化されなければならない核タンパク質、それが形成構造物の大きさや膜系を可視化する必要性に応じて、四酸化オスミウムを使用する必要はないかもしれないし、その省略は、リンの元素シグネチャーをマスクする可能性を除去します。 ESI 18,29,30を使用して、他の出版物に比べて、我々は、ノイズの最小量の元素比マップを生成するために、前後のエッジ画像に異なる設定を使用しています。私たちは、経験的に原稿に提示した設定を決定した（ 図9参照）。エッジの周りに選択した設定が正しいELEにつながるはずコレクションウィンドウない限りメンタルマップは、試料中に存在する他の要素と重複しています。私たちのケースでは、硫黄は、このような要素である可能性があります。 （アミノ酸メチオニンおよびシステインで起こる）、硫黄の濃度が非常に低く、ごくわずかな量で計算されたマップに寄与するので、我々は不利な点を上回る、ここで使用される設定を使用して得られた優れたS / N比を信じてそれは、試料中の硫黄の痕跡から生じる可能性があります。 私たちは、ESIおよびTEM技術と組み合わせたDNA修復タンパク質MDC1、53BP1とRAD52を使用して、ナノメートルの解像度でDRFSの超微細構造を明らかにしました。クロマチンと個々のDSB修復タンパク質局在化の組織は、このアプローチを使用して解決されました。クロマチンのリッジとの間の空間を充填するレーザーマイクロ照射DNAおよび修復タンパク質の傾向を以下のDNA損傷に富むドメインにおけるそれらの局在を示しました。 RAD52の場合、ナンプラーでYS相同組換えにおける役割、レーザー損傷したトラックに沿って核体のような球状構造の形成を観察することができ、これは、他の2つのテストのタンパク質と対照的でした。損傷がガンマ線照射によって適用されたとき、53BP1が損傷クロマチン周囲に病巣を形成しました。病巣内クロマチンとタンパク質の相対組成および位置は、時間の経過とともに変化しているようです。これらのタンパク質および損傷したクロマチンならびにクロマチンの組織化及び核小体の組成の変化との関係は、すべて容易に薬剤が直接これらの特性を評価することができない対照的なとしてウラニウム、鉛を用いた従来の明視野顕微鏡に対し、ESI法を用いて得ることができます。したがって、この技術は、特に、DNAに作用するプロセスのための構造 - 機能関係の研究のための高い可能性を示しています。

近年1以上の光学顕微鏡の大幅な進歩にもかかわらず、細胞生物学者は、まだ解像度のギャップに苦しんでいます。これは、巨大分子複合体の協調相互作用を伴う基本的な細胞プロセスにおける構造と機能の関係の理解を制限する（例えば、クロマチンリモデリング、DNA修復、RNA転写およびDNA複製で）。透過電子顕微鏡（TEM）は、必要な分解​​能を提供だが、それはまた、視覚化構造の生化学的組成を決定することができる一方で、特定のタンパク質を標識するために、構造的にできないので、これらのプロセスを定義するために挑戦してきました。核構造を区別するのに役立つ内部の膜が存在しない場合には、核が特に困難となっています。電子分光イメージング（ESI）は、DNA、RNA、およびPROTの同時検出および区別を可能にすることにより、これらの制限のいくつかを解決しますEINベースの核構造2-5。 電子分光イメージング。 電子顕微鏡での高感度と分解能で元素の分布をマッピングするためには、非弾性的に試料6の要素の内殻電子との相互作用を介して散乱された電子を選択画像分光計を使用することができます。エネルギーの要素固有の量が試料中の原子のイオン化の結果として失われるので、これらの電子は、電子顕微鏡に取り付けられた分光計を用いて分離し、可視化することができます。このように、試料と相互作用した電子のスペクトルの分析は、 試料 7の元素組成に関する定性的および定量的情報を明らかにする。試料を通過する際にエネルギーを失わない電子は、電子エネルギー損失の「ゼロ損失ピーク」に見出されますスペクトル。これらの電子の存在量は、試料の質量、密度および厚さに関係し、試料に衝突または試料を通過する間にエネルギーを失うことなく、試料を​​通過する電子から構成されています。この情報は、試料8中に存在する特定の元素の原子数の絶対的な定量化のために有用であり得ます。 生物学的サンプルは不十分TEMの入射ビーム中の電子を偏向する光素子の大部分から構成されているため、重金属塩を使用する染色方法は、試料のコントラストを生成するために適用されなければなりません。これらの造影剤の多くの特異性および特異性が可能な複数の染色を可視化することができないことがないことは、核の研究において、従来の電子顕微鏡の値を制限しています。 ESIは、特に細胞核の構造の研究のために、従来のTEMを超える大きな利点を持っています。これは、タンパク質複合体の核タンパク質複合体を区別するために、および核酸のそれらの濃度に基づいて、種々の核タンパク質複合体を解決するためのDNA-及びRNAを含む高分子複合体のリンが豊富な性質を利用することが可能です。残りの生物学的物質は、窒素の存在量に基づいて画像化することができます。異なる解剖学的構造内のマッピングだけでこの2つの要素とそれらの分布と相対量の分析は、核に関する多くの情報を提供してくれます。例えば、それは、クロマチンとリン存在量を示すマップでリボソームを同定することは容易です。 interchromatin空間、核膜孔複合体、および核小体は、一方で、簡単に窒素マップ画像で検出することができます。 ミニ一重項酸素発生システム（miniSOG） それが取るので、ESIは、 その場でのクロマチン構造で勉強するための強力な技術を表していますリンと窒素の元素組成における特性の比の利点は、元素組成は、通常、タンパク質複合体の異なる集団の間で区別するために使用することができません。ナノメートル範囲の小さな金粒子で標識された抗体は、広く、個々の分子の位置をマッピングするために使用されてきました。金粒子は、通常、二次抗体に結合しているので、一次抗体によって検出されるエピトープの周囲に約20nmの円周内に表示されます。埋め込み後の試料では、抗体は、セクションの表面に露出されるエピトープを検出することができます。それは、抗原の存在を証明し、細胞の特定の解剖学的構造に関連することが可能であるがエピトープの大部分が樹脂によって覆い隠されているので、得られた情報は、不完全です。全体を通して、抗原へのアクセスを許可し、蛍光顕微鏡検査のために使用されるものと同様のプロトコルを使用する技術を、事前に埋め込みサンプルの全体の深さが、典型的には脂質膜の除去を必要とアルデヒドで固定することができない成分を除去する抗体が細胞に侵入することを可能にするために必要とされる透過化のステップ。また、超微細構造の保存のための好適なアルデヒド固定液、グルタルアルデヒドは、一般的にエピトープを破壊し、その結果、パラホルムアルデヒドは、一般的に必要とされます。これは、タンパク質 - タンパク質架橋にあまり効果的です。金ナノ粒子で標識された抗体の別の欠点は、金が弱いコントラストを有するサンプルの興味深い構造の詳細を隠すことができ、強いコントラストを作成し、非常に電子密度の高い材料であることです。 発現したタンパク質タグとして緑色蛍光タンパク質（GFP）の出現は、細胞生物学の質問に答えるために、蛍光顕微鏡の使用を変えてきました。小さ ​​な蛍光ドメインを有するタンパク質をタグ付けすることは、生体内でその分布のマッピングを可能にします</eM&gt;の構造を変更することができる透過性手順を必要とせずに。電子顕微鏡法に細胞内のタンパク質の分布をマッピングするためにタンパク質タグを使用してエレガントな原理を変換するために、システムは、関心のある構造に近い信号を生成し、TEMのコントラストを生成することができることが必要でした。重合したジアミノベンジジンは、しばしば、抗体結合を検出するために、組織学に使用される染色あります。この染色は、通常、二次抗体にコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いて堆積されます。反応は信頼性の高い結果を生成するが、HRPは、 セル 9の細胞質ゾルに触媒活性ではありません。その解像度はナノゴールド法10よりも悪いようにHRPの反応生成物も生成部位から離れて拡散することができます。これらの問題を回避するために、フラッシュ/ ReAsHシステムが11を開発しました。これは、テトラシステインモチーフを保有する組換え融合タンパク質で構成されています。このモチーフは、との結合ができますbiarsenic蛍光団。励起されると、結合したFlashやReAsHは、標識タンパク質の現場ですぐに沈殿するポリマーへの反応性の高い一重項酸素を生成するので、photoconvertジアミノベンジジン（DAB）することができます。 DABポリマーは、電子密度で四酸化オスミウムで染色することができ、TEMでの組換え融合タンパク質の分布をマッピングするために使用することができます。 2011年には、シュウら 10は、蛍光灯や448 nmの青色光で励起されたとき、多くの一重項酸素ラジカルを生成することが可能であるシロイヌナズナのフラビンタンパク質由来の小さな106アミノ酸の融合タグで構成されていminiSOGシステムを発表しました。それらの一重項酸素ラジカルは11免疫標識された抗体よりもかなり近いタグタンパク質の表面に近くポリマーを形成する光酸化ジアミノベンジジンを使用することができます。フラッシュ/ ReAsHシステムは、フルオロをもたらす必要があるがクロムと光変換を行う前に、細胞へのジアミノベンジジン、miniSOGシステムのみジアミノベンジジン、光を必要とし、加えて、ジアミノベンジジンを重合で約2倍の効果があります。ここで、miniSOGはDNA修復フォーカスの超微細構造をマッピングするために、ESIと組み合わせて使用​​されます。 DNA修復巣（DRF） 彼らは転座と遺伝情報の損失につながることができますので、未修復のDNA二本鎖切断は、細胞への深刻な脅威をもたらします。今度は、これが老化、癌、及び細胞死をもたらすことができます。 DNA二本鎖切断修復に関与している多くのタンパク質は、DNA二本鎖切断12-14の周りに組み立てる病巣に蓄積します。それらの機能は不明であるが、それらは、DNA二本鎖切断を含み、DNA二本鎖切断修復の部位である、核内の部位を表します。 DNA修復FOC私（DRF）は、蛍光顕微鏡によって特徴付けられており、それらはDNA損傷12,15のためのバイオマーカーとして役立ちます。これらは、二本鎖切断のサイズに大量の相対的であり、最近の超解像顕微鏡研究は、それぞれ16を集中内の分子のサブ区画のいくつかの証拠を明らかにまで比較的均質と考えられました。これらの部位は組織化されている方法を理解するために、互いに対して基礎となる生物学的構造のすべてを可視化することが必要です。これは、蛍光顕微鏡検査によって達成さが、電子顕微鏡17,18を介して可能であることはできません。ここでは、この方法は、DNA二本鎖切断修復の超微細構造を探索するために、この組み合わせアプローチの可能性を示すためにminiSOG法により電子分光イメージングを組み合わせることが記載されています。

<table><tbody><tr><td>35 mm glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&amp;nbsp;</td><td>not made for immersion objectives</td></tr><tr><td>LR White: acryl resin</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LR White accelerator</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten-Point Lab Pen</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater 208 carbon</td><td>Cressington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra microtome Leica EM UC6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>Adobe</td><td></td><td>might even work with older versions</td></tr><tr><td>Digital Micrograph V.2.30</td><td>Gatan</td><td></td><td>might even work with older versions</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Quiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniSOG-Constructs</td><td>Tsien-Lab</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;mailto:tsienlab@yahoo.com&quot;&gt;tsienlab@yahoo.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cesium 137 radiation source &quot;MARK 1&quot;</td><td>&amp;nbsp;(J.L. Shepherd &amp;amp; Associated)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FiJi</td><td>open source</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife ultra 35&amp;deg;</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trimming Knife ultratrim</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium cacodylate trihydrate</td><td>emsdiasum</td><td>12300</td><td>Caution Toxic!</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td><td>emsdiasum</td><td>16020</td><td>Caution Toxic!</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>emsdiasum</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>emsdiasum</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>emsdiasum</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide 4% solution</td><td>emsdiasum</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisherbrand</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td><td>Fluka</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Medigas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>Potassium cyanide</td><td>Sigma</td><td>207810</td><td>Caution Toxic!</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>Caution Toxic!</td></tr><tr><td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td><td>emsdiasum</td><td>71960</td><td>Caution Sharp!</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

光学分解能透過型電子顕微鏡における特定のタンパク質の集団を同定する課題には限界が細胞生物学における障害となっています。多くの現象は、簡略化システムインビトロ分析により説明と完全に理解されるために、特に1nmから0.1μmの間の範囲内で、 その場で追加の構造情報を必要とすることはできません。ここで、電子分光イメージング、タンパク質および核酸の分布の同時マッピングを可能にする、透過電子顕微鏡法、および発現タグ、miniSOGは、DNA二本鎖切断修復巣の構造と組織を研究するために組み合わされます。

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Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K ビュー.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

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Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

生化学

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

遺伝学

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

がん研究

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

免疫・感染学

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate identification and localization of proteins, glycans, and small molecules. While this technique is well-established in two-dimensional (2D) cell culture, less is known about its use in three-dimensional (3D) cell models. Ovarian cancer organoids are 3D tumor models that recapitulate tumor cell clonal heterogeneity, the tumor microenvironment, and cell-cell and cell-matrix interactions. Thus, they are superior to cell lines for the evaluation of drug sensitivity and functional biomarkers. Therefore, the ability to utilize immunofluorescence on primary ovarian cancer organoids is extremely beneficial in understanding the biology of this cancer. The current study describes the technique of immunofluorescence to detect DNA damage repair proteins in high-grade serous patient-derived ovarian cancer organoids (PDOs). After exposing the PDOs to ionizing radiation, immunofluorescence is performed on intact organoids to evaluate nuclear proteins as foci. Images are collected using z-stack imaging on confocal microscopy and analyzed using automated foci counting software. The described methods allow for the analysis of temporal and special recruitment of DNA damage repair proteins and colocalization of these proteins with cell-cycle markers.

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

The present protocol describes methods for evaluating DNA damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids. Included here are comprehensive plating and staining methods, as well as detailed, objective quantification procedures.

免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

生物学

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

RPA2免疫蛍光染色によるG1期一本鎖DNA病巣の検出

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

著者スポットライト:治療上の洞察のためのDNA修復中の一本鎖DNAの可視化 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

要約

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近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

免疫蛍光アッセイによる患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)

のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

要約

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近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)

のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

免疫蛍光アッセイによる患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)